Study on the Preparation and Antioxidant Activity of Low Molecular Weight Polysaccharide from Cudrania tricuspidata Fruits
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摘要: 目的：制备低分子量的柘果多糖，并探究其对抗氧化活性的影响。方法：以柘木果实为原材料，采用H2O2/VC降解法制备低分子量柘果多糖。利用高效凝胶渗透色谱和离子色谱等手段对降解前后的多糖进行理化性质分析，并比较其总抗氧化活性、还原能力、DPPH自由基清除率和OH自由基清除率。结果：H2O2/VC法降解柘果多糖的较适比例为H2O2:VC=1.5:1，增加二者浓度时分别得到5种低分子量柘果多糖ZGB、ZGC、ZGD、ZGE和ZGF（其数均分子量分别为49.9、30.5、27.6、25.9、28.9 kDa）；红外光谱说明降解前后其结构并未发生明显改变；离子色谱表明它们均由葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸及微量的盐酸氨基葡萄糖和甘露糖组成；5种多糖均具有抗氧化活性，与其浓度呈正比，其中ZGD（H2O2:VC=30:20 mmol/L）的抗氧化活性最佳，与粗多糖相比其总抗氧化活性和还原能力分别提高了为42.7%和10.8%，对·OH的清除率提高了56.3%，对DPPH·的清除率无显著增强，清除率为87.44%。结论：降解后多糖ZGD的抗氧化活性最佳。Abstract: Objective: The molecular weight Cudrania tricuspidata Fruits polysaccharide was prepared and the effect of different molecular weight on their antioxidant activity was further explored. Methods: The low molecular weight cudge polysaccharide was prepared by H2O2/VC degradation method using cudge fruit as raw material. The polysaccharides before and after degradation were analyzed for their physicochemical properties using high performance gel permeation chromatography and ion chromatography, and compared for their total antioxidant activity, reducing ability, DPPH radical scavenging rate and OH radical scavenging rate. Results: The suitable ratio of this cudge polysaccharide degradation by H2O2/VC method was H2O2:VC=1.5:1, and the five kinds of cudge polysaccharide ZGB, ZGC, ZGD, ZGE and ZGF (Mn 49.9, 30.5, 27.6, 25.9, and 28.9 kDa) were obtained. The structure did not change significantly after degradation by infrared spectrogram analysis. IC analysis showed that it was composed of rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose galacturonic acid and a small amount of glucosamine hydrochloride and mannose. All the five kinds of polysaccharides with low molecular weight had antioxidant activity, which was positively correlated with its concentration. Among them, ZGD (H2O2:VC=30:20 mmol/L) had the best antioxidant activity, compared with crude polysaccharide, its total antioxidant activity and reducing capacity increased by 42.7% and 10.8%, respectively, and the scavenging rate of ·OH increased by 56.3%, while the scavenging rate of DPPH· was not significantly enhanced, and the scavenging rate was 87.44%. Conclusion: After degradation, the antioxidant activity of polysaccharide ZGD is the best.
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柘果为桑科植物柘树（Cudrania tricuspidata （Carr.） Bur.）的果实，最早记载于《浙江民间常用草药》，具有“清热凉血，舒筋活络”的疗效[1]。其含有丰富的多糖、矿物质（钙、铁、磷、钾等）及多种维生素等成分，其中多糖是其主要的活性成分之一[2]。
近年来，多糖已经被报道的生物活性有抗炎镇痛、保肝护肝、抗氧化、抗肿瘤、降低血压、血脂和血糖、调节免疫等[3]，但其生物活性受分子量、分支结构及空间结构影响很大[3-4]。多糖一级结构中的糖单元的组成以及相邻糖苷键的连接方式决定多糖的活性，高级结构中支链的类型、聚合度及其在主链上的分布情况等决定了多糖活性的强弱[4]。对于多糖的抗氧化活性，是因为多糖结构具有半缩醛羟基，即还原末端，使得自由基还原，从而清除自由基。也有报道表明，多糖的抗氧化活性可以通过水解而增强[5]。未降解的多糖分子量大、分子体积大、水溶性差，不利于生物吸收发挥活性，生物利用度较差，而多糖水解为低分子量的多糖或寡糖，会使其分子结构的活性部位暴露，从而提高多糖水解产物的活性[6]。
柘果多糖的分子量较大，在一定程度上影响了其生物学活性。为了获得较低分子量的柘果多糖，需对柘果多糖进行降解。降解多糖的方法主要有生物法对多糖链中糖苷键的断裂具有极高的特异性，成本较高，条件复杂；酸碱法降解可能导致糖单元结构的改变，破坏必要的生物活性基团；物理法对实验仪器要求较高，生产成本较高[7]。目前H2O2/VC降解法已经被用于多糖的降解H2O2/VC氧化降解是一种可控性强、环境友好的获得低分子量多糖的方法。因为羟基自由基虽然是O2的还原产物，但却是非常强的氧化剂。H2O2分解产生的羟自由基氧化断裂多糖间糖苷键，低浓度VC的加入可增加自由基的数量，多糖的降解速率明显提高[8-10]，但其对柘果多糖的降解是否有效未有报道。
本研究以柘木果实为原料，采用H2O2/VC降解法制备低分子量的柘果多糖，采用单因素实验，找到最适合柘果多糖降解的条件，以期建立一种快速、有效、最大利用程度的柘果低分子量多糖的制备方法。并对降解前后的多糖进行了分子量、单糖组成、红外光谱及抗氧化活性的比较研究，突出低分子量柘果多糖在抗氧化活性方面的优势，为低分子量柘果多糖的应用研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
柘果 2022年4月采自浙江湖州长兴县；洗净后，置于鼓风干燥箱80 ℃烘干，高速粉碎机粉碎，过筛（60目）得柘果粉；H2O2（30%）、维生素C（VC，500 g/瓶）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，250 mg/瓶）、硫酸亚铁（分析纯）、磷酸钠（分析纯）、七水合钼酸铵（分析纯）、水杨酸（分析纯）、铁氰化钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；葡聚糖标准品，分子量范围为1.5~200 kDa 北京海富达科技有限公司。
A-000274乌氏粘度计 江苏翌哲实验仪器有限公司；HH-2型恒温水浴锅 北京科伟永兴仪图有限公司；LC210型高效液相色谱仪、TSK G4000 PWxl（Japan）色谱柱 上海仪电分析仪器有限公司；LC-LX-LF50D型冷冻高速离心机 力辰科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵 上海尚仪仪器有限公司；T2600S型紫外分光光度计 青岛精诚仪器仪表有限公司；DSA800傅里叶变换红外光谱仪 河南奥普斯仪器设备有限公司；A01型冷冻干燥机 郑州冰雪时代设备有限公司；GI-5000离子色谱仪 深圳通瑞色谱仪器有限公司；FW100高速粉碎机 苏州江东精密仪器有限公司；KQ-500E超声波破碎仪 北京中仪汇丰科技有限公司；DDBJ-350电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 柘果粗多糖的提取
取一定量磨碎过筛的柘果粉末，加入20倍体积无水乙醇，70 ℃回流提取2 h，除去脂类、黄酮、多酚等醇溶性杂质，冷却后过滤、80 ℃烘箱干燥得脱脂除杂柘果粉末。取100 g脱脂柘果粉末，加入2000 mL去离子水，充分混匀，置于容器中超声波破碎20 min（超声功率300 W），98 ℃水浴加热搅拌提取2 h，滤渣重复提取2 h，合并两次滤液并离心（4000 r/min离心10 min）。上清液使用硅藻土助滤，取滤液装于3000 Da透析袋中，蒸馏水透析，电导率仪检测其电导率值（小于30 μS/cm），并减压浓缩至多少200 mL。浓缩液用95%乙醇沉淀，4 ℃静置过夜，离心（4000 r/min离心10 min）后将沉淀溶于适量超纯水中，再用Sevage法去除游离蛋白质，将水相溶液浓缩冻干，得到棕褐色粉末状柘果粗多糖ZGA[11]。精确称重计算多糖得率，并以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定ZGA中的总糖含量[5]。
1.2.2 多糖降解条件的筛选
精准称取降解所需浓度的抗坏血酸，溶于少量蒸馏水中，并量取所需浓度的过氧化氢，二者同时加入到待降解的多糖溶液中，磁力搅拌器搅拌20 min，溶液粘度趋于稳定，降解完成。
1.2.2.1 H2O2与VC比例的确定
为了确定H2O2与VC两种试剂的比例浓度对柘果多糖的降解的影响，采用单因素实验方法，在室温下将实验分为两组，浓度比例如表1所示，分别共同作用于多糖溶液，并绘制降解曲线，纵坐标为糖溶液的特性粘度，横坐标为降解试剂的浓度比例，来检验两种试剂的浓度比例对降解反应的影响。
表 1 过氧化氢与抗坏血酸的浓度比例Table 1. Concentration ratio of hydrogen peroxide to ascorbic acid第一组 第二组 H2O2（mmol/L） 1 5 10 20 40 10 10 10 10 10 VC（mmol/L） 10 10 10 10 10 3 5 10 15 20 1.2.2.2 H2O2与VC浓度的确定
在对两种试剂的比例进行检验之后，选择较适宜的比例，重复使用1.2.2 的方法以特性粘度为主要指标（分子量越低特性粘度越低），降解程度为参考指标，来确定两个试剂浓度对降解反应的影响（具体试剂浓度见表2），分别降解ZGB、ZGC、ZGD、ZGE、ZGF五个多糖产品。
表 2 柘果多糖的降解条件、特性粘度及分子量Table 2. Degradation conditions, characteristic viscosity and molecular weight of thepolysaccharide组分名称 ZGA ZGB ZGC ZGD ZGE ZGF 过氧化氢（mmol/L） − 7.5 15 30 60 120 抗坏血酸（mmol/L） − 5 10 20 40 80 特性粘度（dL/g） 55.5 40.0 29.7 22.1 12.0 7.3 降解率（%） − 28.0 46.5 60.2 78.4 86.9 重均分子量/Mw（Da） 1.215×105 7.649×104 4.497×104 4.042×104 3.760×104 4.230×104 数均分子量/Mn（Da） 7.658×104 4.989×104 3.048×104 2.761×104 2.596×104 2.895×104 峰位分子量/Mp（Da） 9.242×104 5.986×104 3.637×104 3.290×104 3.093×104 3.454×104 1.2.2.3 降解产品特性粘度的计算
多糖的分子量与其溶液的特性粘度有关，使用乌氏粘度计测定溶液的流出时间，计算相对粘度，以降解后溶液的特性粘度为评价指标，并计算不同比例与浓度的试剂对柘果多糖降解程度，以选择较适宜的降解条件[12]。
特性粘度和降解率按如下公式（1）、（2）、（3）、（4）计算：
ηr=tst0 (1) ηsp=ηr−1 (2) ηt=√2(ηsp−㏑ηr)c (3) 降解率(%)=η0−ηtη0×100 (4) 式中：ts为溶液流出的时间，s；t0为溶剂流出的时间，s；ηr为相对粘度；ηsp为增量粘度；c为柘果多糖溶液的浓度，g/mL；ηt和η0分别为柘果多糖溶液的特性粘度和溶剂的特性粘度。
1.2.2.4 降解产品的制备
按照表2所示的试剂浓度降解，将降解后的多糖溶液分别装于500 Da透析袋中，蒸馏水透析3 d，电导率仪检测电导率小于30 μS/cm后减压浓缩至挂壁。浓缩液用95%乙醇沉淀，将沉淀烘干得ZGB、ZGC、ZGD、ZGE、ZGF五个不同分子量的柘果多糖产品。
1.2.3 柘果粗多糖及降解多糖的理化性质分析
1.2.3.1 多糖分子量的测定
通过高效液相色谱法测定多糖分子量和纯度[13]。精密称取标准品和各样品，样品配制成0.5%的溶液，12000 r/min离心10 min，上清液用微孔滤膜过滤后转置于进样瓶中。色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱；流动相：0.05 mol/L氯化钠溶液；流速：0.6 mL/min，柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测器：示差检测器RI-10A。
1.2.3.2 红外光谱测定
通过FT-IR分析多糖的官能团[14]。精密称取样品5 mg和溴化钾500 mg，混匀研磨成细粉，并压制成片，单独使用溴化钾粉末压片作为空白对照。分别置于傅里叶变换红外光谱仪DSA800在400～4000 cm−1进行红外光谱扫描记录。
1.2.3.3 单糖组成的测定
使用离子色谱仪测定单糖组成。按照文献的方法[15]取16种单糖的标准溶液配制成标准品作为混标，测定不同单糖质量并计算出摩尔比。精密称量5 mg样品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L TFA 2 mL，120 ℃水解3 h。吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5 mL水涡旋混匀，吸取50 μL加入950 μL去离子水，12000 r/min离心5 min。取上清进IC分析。色谱柱条件：Dionex CarbopacTM PA20（3×150 mm）；流动相条件：A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH & 100 mmol/L NaOAC。流速：0.3 mL/min；进样量：5 µL；柱温：30 ℃；检测器：电化学检测器。
1.2.4 柘果粗多糖及降解多糖的抗氧化活性研究
1.2.4.1 总抗氧化能力
配制5.0 mg/mL柘果多糖溶液，取5支试管作为样品组，每管分别加入（50、100、150、200、300 μL）样品溶液，并用蒸馏水补足至1 mL。另取1支试管加入1 mL蒸馏水作为空白调零。依次向各试管中加入钼酸铵反应溶液4 mL，95 ℃水浴加热100 min，冰水浴冷却后于695 nm波长下测定吸光度值，吸光度值表示样品的总抗氧化能力[16]。
1.2.4.2 还原能力
配制1.0 mg/mL柘果多糖溶液，取5支试管，每管分别加入（100、200、400、600、800 μL）样品溶液，并用PBS（pH6.6）补足到1 mL，空白管用PBS溶液代替样品调零。采用铁氰化钾还原法，反应结束后于室温放置30 min，于700 nm波长下测定吸光度值。吸光度值代表了柘果多糖样品的还原能力[17]。
1.2.4.3 DPPH自由基（DPPH·）清除能力
配制5.0 mg/mL柘果多糖溶液，取5支试管作为样品组，每管分别加入（200、400、600、800、1000 μL）样品溶液，并用50%甲醇补足到1 mL，每管依次加入0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液3 mL，振荡混匀。以50%甲醇溶液代替样品作为对照，50%甲醇溶液作为空白调零。另取5支试管作为本底组，每管分别加入（200、400、600、800、1000 μL）样品溶液，并用50%甲醇溶液补足至4 mL，振荡混匀。置于暗处反应25 min，于517 nm波长下测吸光度值，按式（5）计算清除率[17-18]。
1.2.4.4 羟基自由基（·OH）清除能力
配制5.0 mg/mL柘果多糖溶液，取5支试管作为样品组，每管分别加入（100、200、300、400、500 μL）样品溶液，并用蒸馏水补足到1 mL，依据水杨酸法依次加入试剂，振荡混匀。另取5支试管作为本底组，每管分别加入（100、200、300、400、500 μL）样品溶液，并用蒸馏水补足到4 mL，振荡混匀。以蒸馏水代替样品作为对照，水杨酸作为空白调零。所有试管均37 ℃反应30 min，510 nm波长下测吸光度值，按式（5）计算清除率[19]。
清除率(%)=A0−(A1−A2)A0×100 (5) 式中：A0为对照组的吸光度值；A1为多糖样品组的吸光度值；A2为多糖本底组的吸光度值。
1.3 数据处理
采用Origin 2021、SPSS 22.0 Windows统计软件、GraphPad Prism 8.4.3绘图软件对实验数据进行统计分析与作图。降解前后的柘果多糖的抗氧化活性实验均重复三次，并对其进行误差分析，本实验中的实验数据均以平均数±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 降解柘果粗多糖（ZGA）的浓度确定
柘果粗多糖得率为5.64%，多糖含量为60.2%。实验采用10 mg/mL的柘果多糖溶液进行降解，当采用高浓度的柘果多糖（20 mg/mL）进行降解，此时溶液的特性粘度为88.3，在相同的条件下降解的产品分子量不够均一，组间溶液粘度差别过大；浓度过低时（5 mg/mL），此时溶液的特性粘度为25.6，降解产品的溶液相对粘度差别较小，降解不具代表性。由于柘果多糖自身特性，样品的粘度较高，降解浓度在10 mg/mL时溶液已经相对粘稠，特性粘度为55.5，浓度继续增加样品难以溶解，对降解样品的均一程度有一定的影响。
2.2 H2O2与VC比例对降解反应的影响
参考文献的降解方法[10]，多糖在两种试剂的共同作用下迅速降解，20 min内趋于稳定，选择20 min为降解的反应时间。如图1所示，随着过氧化氢浓度的增大，反应液的特性粘度先迅速降低；当过氧化氢浓度与VC浓度的比值大于1时，反应液的特性粘度呈逐渐升高趋势；H2O2/VC在1~2时，反应液的降解较好。如图2所示，当抗坏血酸的浓度升高时，反应液的特性粘度降低，VC/H2O2在1~1.5时，多糖降解程度达到最大，当VC的比例继续升高时，溶液的特性粘度升高，推测可能由于过量的抗坏血酸抑制了多糖的降解[10]。两组单因素结果显示，H2O2与VC的比值范围在0.7~2时，柘果多糖在这一体系中的降解效率较好。
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图 1 不同浓度过氧化氢与10 mmol/L抗坏血酸联合降解多糖溶液的特性粘度Figure 1. The characteristic viscosity of the solution when different concentrations of hydrogen peroxide react with 10 mmol/L ascorbic acid![]()
图 2 不同浓度抗坏血酸与10 mmol/L过氧化氢联合降解多糖溶液的特性粘度Figure 2. The characteristic viscosity of the solution when different concentrations of ascorbic acid react with 10 mmol/L of hydrogen peroxide2.3 H2O2与VC浓度对降解反应的影响
因样品特性原因，在固定H2O2和VC浓度比值为1.5时，研究H2O2和VC二者浓度对降解反应的影响，结果见表2。随着两种试剂浓度增大，多糖溶液降解程度也不断增大，当H2O2和VC浓度分别为7.5和5 mmol/L时，与原多糖相比，溶液相对粘度降低了28.0%，而当两者浓度达到120:80 mmol/L时，溶液相对粘度降低86.9%。
2.4 降解后多糖的理化性质分析
2.4.1 分子量分析
通过高效液相色谱法对多糖进行分子量测定，结果见表2，降解程度较大的样品，均呈现均匀对称的洗脱峰，表明其均具有均一性，且降解程度越大，分子量分布越集中。当降解条件达到120:80 mmol/L时，发现ZGF的分子量并未随之降低，可能是因为过量的抗坏血酸抑制了多糖的降解，推测抗坏血酸浓度过大时，抗坏血酸与超氧阴离子发生的低电位反应导致羟基自由基收率的降低，从而抑制糖溶液的降解[20]。
2.4.2 红外光谱分析
如图3所示，3421.99 cm−1是O-H的伸缩振动吸收峰，为多糖的特征峰。在2927.91 cm−1处有吸收峰，归属于C-H伸缩振动；在1743.10 cm−1处有吸收峰归属于为C=O的对称伸缩振动；在1642.37 cm−1处有一个吸收峰，归属于C=C伸缩振动；在1416.92 cm−1、1018.79 cm−1处有吸收峰，归属于C-O伸缩振动[21]。降解后的柘果多糖其结构并未发生较大变化，与原料糖相比在1743.10 cm−1处的吸收峰有不同程度的增强，表明在降解的过程中出现了羰基，这可能与降解后多糖糖醛酸的含量增多有关[22]。
2.4.3 单糖组成分析
通过离子色谱对原料糖及降解多糖的单糖组成测定，以16种单糖为混标，如表3所示，柘果多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸组成，含微量的盐酸氨基葡萄糖和甘露糖。其中ZGE和ZGF不含盐酸氨基葡萄糖和甘露糖，可能与降解程度有关。降解后产品木糖含量略微降低，鼠李糖含量略微升高，但未成规律性变化，表明这一自由基降解体系具有非选择性[23]。其中半乳糖醛酸的含量在降解后出现显著增高，这一结果与红外光谱分析结果一致。
表 3 柘果原多糖及其不同降解产品的单糖组成摩尔比Table 3. Monosaccharide composition and molar ratio of different molecular weights polysaccharides名称 ZGA ZGB ZGC ZGD ZGE ZGF 鼠李糖 0.033 0.071 0.035 0.034 0.038 0.042 阿拉伯糖 0.254 0.386 0.231 0.219 0.197 0.195 盐酸氨基葡萄糖 0.004 0.010 0.005 0.004 0.000 0.000 半乳糖 0.250 0.255 0.255 0.260 0.169 0.171 葡萄糖 0.312 0.022 0.306 0.313 0.380 0.366 木糖 0.059 0.053 0.056 0.052 0.022 0.023 甘露糖 0.016 0.006 0.012 0.009 0.000 0.000 半乳糖醛酸 0.073 0.197 0.100 0.108 0.195 0.202 2.5 抗氧化活性分析
2.5.1 总抗氧化能力分析
如图4所示，在所测浓度范围内，柘果多糖的总抗氧化能力与多糖浓度呈量效关系。粗多糖ZGA的总抗氧化能力最弱，降解后的多糖总抗氧化能力表现出明显的增强，表明低分子量的多糖可以增强其总抗氧化能力。其中降解产品ZGD的总抗氧化能力最强，推测多糖的生物活性可能与特定的分子量区间及均一程度密切相关[23-24]。
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图 4 不同分子量柘果多糖的总抗氧化能力Figure 4. Total antioxidant capacity of different molecular weights polysaccharides2.5.2 还原能力分析
如图5所示，柘果粗多糖及降解产品还原能力的大小在所测的浓度范围内，还原能力均与浓度呈正比。据报道低分子量的多糖具有较多的还原末端，其还原能力会较强[25]。还原能力ZGB<ZGC<ZGF<ZGE<ZGD，可能与其分子量逐步减小有关。在还原反应体系中，样品能将Fe3+还原成Fe2+，继续加入FeCl3会进一步生成普鲁士蓝（Fe4[Fe（CN）6]3），在700 nm处测定其最大吸收值，吸光值的大小即反应了样品还原能力的大小[15]。但粗多糖的还原能力并非最弱，还原能力通常还与还原酮类物质相关，一种方式是通过供氢打破自由基链式反应，另一种方式是直接与过氧化氢前体反应阻止过氧化氢的产生，从而促使机体不会过量产生自由基，达到抗氧化的目的。推测柘果粗多糖中可能含有一定量的酮基结构[26-27]。
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图 5 不同分子量柘果多糖的还原能力Figure 5. The reducing power of different molecular weights polysaccharides2.5.3 DPPH自由基清除活性分析
由图6可以看出，所有样品的浓度在达到5.0 mg/mL时DPPH·清除率趋于平稳，柘果粗多糖（ZGA）与降解柘果多糖（ZGB、ZGC、ZGD、ZGE、ZGF）的DPPH•清除率分别为93.97%、85.18%、89.20%、87.44%、82.41%和89.20%。
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图 6 不同分子量柘果多糖的DPPH自由基清除能力Figure 6. DPPH radical scavenging ability of different molecular weights polysaccharides多糖的抗氧化活性主要与其分子量、糖醛酸含量、硫酸化程度、单糖组成及糖苷键的连接方式等密切相关[28]。其中，糖醛酸的存在可以活化氢原子显著增强多糖的抗氧化能力，低分子量多糖因含有更多的活性羟基，从而赋予多糖更强的抗氧化能力[29]。降解后的多糖组分表现出的强抗氧化能力可能是由于其分子量降低及半乳糖醛酸含量变高等综合作用的结果[28-30]。本研究中粗多糖的DPPH·清除率略大于降解多糖组分，推测可能是由于粗多糖中含有其他抗氧化物质（黄酮类、多酚等小分子物质）。经过降解后的多糖分子量均一，几乎不含其他小分子物质及杂质，抗氧化活性更多来源于多糖本身[29]。
2.5.4 羟基自由基清除活性的分析
羟基被认为是最活跃的自由基，它可以与生物机体内脂肪、蛋白质、核酸等几乎所有的生物大分子反应，诱导细胞的凋亡或癌变，诱发严重的机体损伤。因此，清除羟基自由基对于保护机体免于自由基导致的损伤十分关键[31]。
由图7可知，柘果多糖对羟基自由基的清除率与其浓度呈量效关系。当浓度为2.5 mg/mL时，柘果粗多糖（ZGA）与降解柘果多糖（ZGB、ZGC、ZGD、ZGE、ZGF）的羟基自由基清除率分别为55.12%、80.19%、84.82%、86.14%、85.81%和81.85%。降解多糖的清除羟基自由基能力明显高于柘果粗多糖，且有显著性差异。羟基自由基的清除能力与多糖的羟基数量及氨基基团有关，由此可见经过降解后的多糖，活性部位暴露。推测降解后的多糖暴露出更多的活性羟基，从而与柘果粗多糖相比有更强的清除活性[32]。
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图 7 不同分子量柘果多糖的羟基自由基清除能力Figure 7. Hydroxyl radical scavenging ability of different molecular weights polysaccharides3. 讨论与结论
据研究，植物体内存在的VC可以还原O2产生过氧化氢，并与植物体内的金属离子和产生的过氧化氢发生芬顿反应，产生·OH，·OH可以降解细胞壁多糖，从而促进植物的生长和发育[33]。在本文中联合使用微量过氧化氢和抗坏血酸就引起柘果多糖快速降解，这是因为羟基自由基虽然是O2的还原产物，但却是非常强的氧化剂。本研究从柘木果实中提取分离出柘果多糖，模拟了植物体内的这种反应，依据样品特性，采用单因素实验的方法筛选出较适宜柘果多糖降解的比例为H2O2:VC=1.5:1，并依此倍数增加二者浓度，降解生成了5个多糖样品。
对降解后的低分子量多糖进行理化性质分析，结果发现，降解程度越高，特性粘度越低，多糖的分子量越低。单糖组成结果显示，柘果多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸及少量盐酸氨基葡萄糖和甘露糖组成。降解后的多糖单糖组成并未发生改变，较粗多糖相比低分子量的多糖半乳糖醛酸含量相对增加，这可能与降解后的多糖活性增强有关[34]。其余单糖的摩尔比并未成规律性变化，这表明过氧化氢与抗坏血酸对多糖的降解具有非选择性，与文献报道结果一致[10]。
柘果多糖在降解后抗氧化活性显著增强，其中低分子量多糖ZGD在总抗氧化能力、还原能力、DPPH·和·OH清除能力方面都表现出良好的抗氧化活性，与粗多糖相比，ZGD的总抗氧化活性提高了42.7%，还原活性提高了10.8%，·OH清除能力提高了56.3%，DPPH·清除能力无显著增强，清除率为87.4%。这不仅与降解后的多糖糖醛酸含量增加有关，还可能是特定的分子量区间、活性基团、多糖的结构等综合作用的结果[35-37]。本研究为柘果多糖的开发利用及多糖的降解提供实验依据，为更好的开发柘木资源、深入研究其构效关系奠定基础。
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图 1 不同浓度过氧化氢与10 mmol/L抗坏血酸联合降解多糖溶液的特性粘度
Figure 1. The characteristic viscosity of the solution when different concentrations of hydrogen peroxide react with 10 mmol/L ascorbic acid
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图 2 不同浓度抗坏血酸与10 mmol/L过氧化氢联合降解多糖溶液的特性粘度
Figure 2. The characteristic viscosity of the solution when different concentrations of ascorbic acid react with 10 mmol/L of hydrogen peroxide
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图 4 不同分子量柘果多糖的总抗氧化能力
Figure 4. Total antioxidant capacity of different molecular weights polysaccharides
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图 5 不同分子量柘果多糖的还原能力
Figure 5. The reducing power of different molecular weights polysaccharides
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图 6 不同分子量柘果多糖的DPPH自由基清除能力
Figure 6. DPPH radical scavenging ability of different molecular weights polysaccharides
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图 7 不同分子量柘果多糖的羟基自由基清除能力
Figure 7. Hydroxyl radical scavenging ability of different molecular weights polysaccharides
表 1 过氧化氢与抗坏血酸的浓度比例
Table 1 Concentration ratio of hydrogen peroxide to ascorbic acid
第一组 第二组 H2O2（mmol/L） 1 5 10 20 40 10 10 10 10 10 VC（mmol/L） 10 10 10 10 10 3 5 10 15 20 
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表 2 柘果多糖的降解条件、特性粘度及分子量
Table 2 Degradation conditions, characteristic viscosity and molecular weight of thepolysaccharide
组分名称 ZGA ZGB ZGC ZGD ZGE ZGF 过氧化氢（mmol/L） − 7.5 15 30 60 120 抗坏血酸（mmol/L） − 5 10 20 40 80 特性粘度（dL/g） 55.5 40.0 29.7 22.1 12.0 7.3 降解率（%） − 28.0 46.5 60.2 78.4 86.9 重均分子量/Mw（Da） 1.215×105 7.649×104 4.497×104 4.042×104 3.760×104 4.230×104 数均分子量/Mn（Da） 7.658×104 4.989×104 3.048×104 2.761×104 2.596×104 2.895×104 峰位分子量/Mp（Da） 9.242×104 5.986×104 3.637×104 3.290×104 3.093×104 3.454×104
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表 3 柘果原多糖及其不同降解产品的单糖组成摩尔比
Table 3 Monosaccharide composition and molar ratio of different molecular weights polysaccharides
名称 ZGA ZGB ZGC ZGD ZGE ZGF 鼠李糖 0.033 0.071 0.035 0.034 0.038 0.042 阿拉伯糖 0.254 0.386 0.231 0.219 0.197 0.195 盐酸氨基葡萄糖 0.004 0.010 0.005 0.004 0.000 0.000 半乳糖 0.250 0.255 0.255 0.260 0.169 0.171 葡萄糖 0.312 0.022 0.306 0.313 0.380 0.366 木糖 0.059 0.053 0.056 0.052 0.022 0.023 甘露糖 0.016 0.006 0.012 0.009 0.000 0.000 半乳糖醛酸 0.073 0.197 0.100 0.108 0.195 0.202
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