In Vitro Digestive Properties of Zein Nanoparticles
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摘要: 为了研究基于天然生物大分子的纳米递送体系在消化过程中物理化学性质的变化，本研究以姜黄素（Curcumin）为芯材，玉米醇溶蛋白（Zein）为壁材，通过反溶剂沉淀法制备了包埋姜黄素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒（CZNPs），通过光谱学方法和电子显微镜对CZNPs的物化性质进行了表征，并在体外模拟消化模型中对CZNPs的消化特性进行了研究。结果表明，当姜黄素与Zein的质量比为1:40时，姜黄素的包埋率最高，为99%±1%，制得的CZNPs为球形纳米颗粒，平均粒径为118.6±0.7 nm、Zeta电位为19.9±3.79 mV，且颗粒之间出现轻微粘连。在体外模拟胃消化过程中，随着消化时间的延长，CZNPs出现明显聚集，其平均粒径增至8000 nm；且部分Zein发生降解，生成小分子量的氨基酸，同时缓慢释放出姜黄素。在后续的模拟肠消化过程中，CZNPs的聚集程度随着消化时间的延长而明显减弱，但Zein没有继续降解，姜黄素的释放也没有明显增大。因此，玉米醇溶蛋白纳米颗粒是一种比较有效的口服递送体系，可能应用于功能性食品和口服药物的开发中。
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关键词:
- 姜黄素 /
- 玉米醇溶蛋白纳米颗粒 /
- 颗粒表征 /
- 体外模拟消化
Abstract: To investigate changes in the physicochemical properties of nano delivery systems that were fabricated by native biomacromolecules during digestion, curcumin and zein were separately used as the core and shell materials in this study, and curcumin-loaded zein nanoparticles (CZNPs) were prepared by the way of inverse solvent precipitation. Firstly, the physicochemical properties of CZNPs were characterized by various spectroscopy and electron microscopy methods. Then, the digestive properties of CZNPs in an in vitro simulated digestion model were investigated. Results showed that the encapsulation efficiency of Cur (99%±1%) was the largest when the mass ratio of Cur and zein was 1:40. Moreover, the obtained CZNPs were spherical nanoparticles with an average particle size of 118.6±0.7 nm and zeta potential of 19.9±3.79 mV. Slight adhesion between CZNPs was also noticed. During in vitro simulated gastric digestion, with the increase of digestive time, significant aggregation occurred and the average particle size of CZNPs increased to 8000 nm. Meanwhile, part of zein degraded into amino acids and Cur was released slightly. During the subsequent simulated intestinal digestion, the aggregation of CZNPs reduced with time. However, zein kept stable without continue degradation and the release of Cur didn’t change significantly. Therefore, zein nanoparticles may be an effective oral delivery system with possible applications in the development of functional foods and orally administered drugs. -
姜黄素（Curcumin，Cur）是从姜科、天南星科植物的根茎中提取的一种具有二酮结构的天然多酚类化合物，具有降血脂、防止血液凝结、抗氧化、抗癌、抗菌、消炎等广泛的药理作用[1-2]。但是越来越多的临床应用结果表明，姜黄素存在着溶解度低、稳定性差和吸收率低等缺陷[3]，而且在肠道内姜黄素很容易转化为葡萄糖苷磺酸醛，加速其新陈代谢，缩短半衰期[4]，最终导致姜黄素的生物利用度降低，这大大限制了其在食品和药品中的应用，为了克服这些问题，研究人员已尝试使用递送系统将姜黄素包埋，例如水凝胶、纳米颗粒、乳液、脂质体等。最近的研究发现，利用酪蛋白、乳清蛋白、大豆分离蛋白等食物来源的天然蛋白质聚合物对姜黄素进行包埋也可以提高其稳定性，使其免受外界干扰，同时大幅度提高其生物利用度[5-8]。
玉米醇溶蛋白（Zein）是一种疏水性蛋白，其分子结构中含有大量的非极性氨基酸，约占氨基酸总含量的50%，这使其易溶于65%~95%的醇类水溶液或70%~80%的丙酮溶液，但在水或无水乙醇中不能溶解[9]。研究表明，通过改变溶剂的成分与极性，可诱导玉米醇溶蛋白发生从α-螺旋到β-折叠的构象转变，疏水相互作用将驱动玉米醇溶蛋白分子以反平行的β-折叠形式排列形成长条带状，长条带状的玉米醇溶蛋白卷曲成环或线圈状并不断堆积、环绕、生长，形成玉米醇溶蛋白颗粒[10]。Zein的自组装特性使其形成具有不同功能作用的结构，例如薄膜、纳米颗粒、纤维和胶束等[10]。在Zein的自组装过程中，一些疏水性活性物质，如姜黄素、槲皮素等，可以通过疏水作用、氢键、范德华力和静电相互作用等方式自发地被包埋在玉米醇溶蛋白胶体颗粒内部，从而提高活性物质的稳定性及生物利用率[11]。近年来，关于负载姜黄素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒（Cur-zein nanoparticles，CZNPs）的制备、表征和修饰的研究越来越多。例如Patel等[12]最先利用反溶剂沉淀法制备了Zein-Cur胶体颗粒，并对姜黄素的稳定性和胶体颗粒的粒径及细胞黏附性进行了表征。董潇等[13]又在Zein的改性和制粒、Zein与多糖或其他蛋白质相互作用合成复合粒子以及这些粒子在姜黄素等活性物质输送和乳液稳定等领域做了一系列的研究。此外，研究表明由于其水不溶性，Zein具有一定的抵抗胃蛋白酶消化的能力，因此特别适用于构建口服的纳米缓释递送系统[14]。为了研究CZNPs在胃肠环境内能否以及如何延长姜黄素的保留时间，进而增加姜黄素的生物利用度，有必要了解CZNPs自身在胃肠消化过程中胶体特性的变化，特别是Zein物理化学性质的变化。
因此，本文先通过反溶剂沉淀法制备了CZNPs，并对纳米颗粒的粒径、Zeta电位、形貌、包埋率和组成成分进行了表征，然后探究了CZNPs在模拟胃肠液中的消化特性。本文除了对CZNPs粒径、Zeta电位和形貌的变化进行表征外，还分析了姜黄素的释放和Zein的降解程度。本文的研究结果将为CZNPs在食品、口服药物中的应用提供一定的借鉴意义和参考价值。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
姜黄素（纯度≥99%） 上海阿拉丁试剂有限公司；玉米醇溶蛋白（纯度≥98%） 美国Sigma-Aldrich公司；吐温−80、乙醇、胃蛋白酶（USP级，1:15000 ）、胰酶（USP级，1:4000 ）、胆盐 上海蓝季生物有限公司；异亮氨酸标准品 上海江莱生物科技有限公司；其他无机化学试剂 国药集团化学试剂有限公司。
Multiskan Sky微孔酶标仪 新加坡赛默飞仪器有限公司；Centrifuge 5810 R离心机 德国Eppendorf生命科学公司；KYC-100B恒温培养摇床 上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-2600可见紫外分光光度计 日本SHMADZU仪器有限公司；TENSOR27傅利叶红外光谱仪 德国BRUKER有限公司；MIRA3场发射扫描电子显微镜 捷克TESCAN有限公司；马尔文Zetasizer Nano ZS 90纳米激光粒度仪 英国Malvern有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CZNPs和未负载姜黄素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒（ZNPs）的制备
参考Chen等[15]的方法制备CZNPs，同时制备了未负载姜黄素的ZNPs作为对照组。具体步骤如下：分别称取0、2、3和4 mg的姜黄素，加入8 mL含有80 mg玉米醇溶蛋白的80%乙醇水溶液中，充分搅拌溶解后，将混合物在磁力搅拌（500 r/min）条件下一次性倒入24 mL含1.42%（w/w）吐温-80的蒸馏水中，并在室温下继续搅拌20 min，然后将混合溶液在40 ℃、95 kPa条件下旋转蒸发10 min，去除混合溶液中的乙醇。加超纯水补充蒸发掉的水分，并将溶液的体积定容为24 mL。将样品溶液转移到50 mL离心管中，以4000 r/min的速度在4 ℃离心10 min，将沉淀与上清液分离，上清液即为纳米颗粒样品溶液，部分样品溶液经冷冻干燥后在−20 ℃中保存，剩余的样品溶液贮藏于4 ℃冰箱中备用。将不同质量姜黄素制备的纳米颗粒样品分别标记为ZNPs、C2ZNPs、C3ZNPs和C4ZNPs。
1.2.2 ZNPs和CZNPs的表征
1.2.2.1 ZNPs和CZNPs的粒径分析和Zeta电位测定
将制备好的纳米颗粒样品溶液用超纯水稀释10倍后，在25 ℃下，使用马尔文Zetasizer Nano ZS 90纳米激光粒度仪确定ZNPs和CZNPs的粒度和Zeta电位[16]。每个样品至少重复测定3次以获得平均值。
1.2.2.2 ZNPs和CZNPs的紫外-可见吸收光谱测定
将ZNPs和C2ZNPs样品溶液加水稀释成质量浓度约为0.1 mg/mL的溶液，然后使用紫外-可见分光光度计在200~700 nm波长范围内测定样品溶液的紫外-可见吸收光谱[17]。
1.2.2.3 姜黄素包埋率的测定
参考Chen等[15]的方法用80%乙醇水溶液配制不同浓度的姜黄素标准品溶液，通过微孔酶标仪在424 nm波长下测定姜黄素标准品溶液的吸光度值，并根据吸光度值绘制标准曲线。本实验得到的姜黄素标准曲线为y=0.0532x+0.0285，相关系数R2=0.9971。另一方面，用80%乙醇水溶液将500 μL CZNPs稀释20倍，充分振荡后在相同条件下测定稀释液在424 nm处的吸光度值。然后将吸光度值代入姜黄素乙醇溶液的标准曲线，求得样品中姜黄素的浓度，并进一步求得样品中姜黄素的含量M，最后根据下述公式计算CZNPs中姜黄素的包埋率（EE）。
EE(%)=M/M0×100 式中：M为CZNPs样品中姜黄素的含量，mg；M0为制备CZNPs样品时，在溶液中加入的姜黄素的质量，mg。
1.2.2.4 ZNPs和CZNPs的形貌观察
将冷冻干燥的样品粉末贴在载物台的导电胶上，并进行喷金，然后在扫描电子显微镜（SEM，MIRA3，捷克）下观察ZNPs和CZNPs样品的形貌和粒径大小。
1.2.2.5 ZNPs和CZNPs的傅里叶变换中红外光谱测定
将冷冻干燥的ZNPs粉末、C2ZNPs粉末、姜黄素标准品粉末和固体溴化钾混合后研磨成均匀粉末，通过压片机（约15~20 MPa）制备出透亮的薄片，然后将薄片放入傅里叶变换中红外光谱仪（FTIR，TENSOR27）中在4000~400 cm−1波长范围内测定ZNPs、CZNPs和姜黄素的傅里叶变换中红外光谱。
1.2.3 CZNPs的体外消化特性研究
1.2.3.1 体外模拟肠胃消化
采用胃和小肠组成的模型评估CZNPs在体外的消化特性。根据现有报道的方法准备模拟胃液（Simulated gastric fluid，SGF）和模拟肠液（Simulated intestinal fluid，SIF）[18-19]。
胃相：将30 mL CZNPs水溶液与30 mL模拟胃液（SGF：3.2 mg/mL胃蛋白酶和2.0 mg/mL氯化钠）混合，将混合物的pH用盐酸（5.0 mol/L）调节至1.2，然后在37 ℃、200 r/min的恒温培养摇床中孵育，分别在0、30、60 min时从混合溶液中取出5 mL胃消化样品，并立即向取出的胃消化样品溶液及剩余的胃消化样品溶液中滴加氢氧化钠溶液（5.0 mol/L）将样品pH调至7.5，使胃蛋白酶失活。
小肠相：准确吸取30 mL剩余的胃消化样品溶液，加入30 mL模拟肠液（SIF：包含12.0 mg/mL胆盐，2.0 mg/mL胰酶，6.8 mg/mL KH2PO4和8.8 mg/mL NaCl），将二者充分混合。将混合物在37 ℃恒温振荡器中继续孵育并计时，并在90、120、150和180 min时分别收集5 mL肠消化样品，并立即在100 ℃金属浴中加热5 min，使胰蛋白酶失活。
按照C2ZNPs溶液中姜黄素的浓度为0.0825 mg/mL来设置对照组，称取2.475 mg姜黄素粉末，加入3 mL无水乙醇中，充分溶解后加入27 mL含有1.42%（w/w）吐温−80的蒸馏水，配成浓度为0.0825 mg/mL、体积为30 mL的姜黄素乙醇水溶液。按照上述步骤进行模拟胃肠消化实验。
1.2.3.2 纳米颗粒在消化过程中粒径、Zeta电位和微观形貌的变化
模拟消化结束后，将各个时间点移取的1.5 mL消化液样品以15000 r/min转速离心15 min，并分别收集上清液和沉淀。将沉淀加1.5 mL水重新分散，且10倍稀释后测定粒径和Zeta电位，方法同1.2.2.1。另外，参考1.2.2.4中描述的方法表征消化后纳米颗粒的微观结构。
1.2.3.3 胃肠消化液中游离姜黄素含量的测定
参考1.2.2.3所述的方法测定整个胃肠消化过程中各个时间点（0、30、60、90、120、150、180 min）取得的消化液样品上清液中姜黄素的含量。
1.2.3.4 胃肠消化液中氨基酸含量的测定
参考邵金良等[20]报道的茚三酮比色法测定消化液上清液中氨基酸的含量。配制1 mg/mL的异亮氨酸标准品溶液，分别取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL标准品溶液于玻璃试管中，用蒸馏水定容至10 mL。取1 mL各个浓度的异亮氨酸标准品溶液，加入1 mL pH为8.0的缓冲溶液和1 mL茚三酮显色液，混匀后于100 ℃沸水浴中加热15 min，加热结束后立即用流动水冷却，并在570 nm波长处测定各反应液的吸光度值，由吸光度值绘制异亮氨酸标准曲线（y=0.031272x−0.96279，相关系数R2=0.9999）。取1 mL各个时间点的消化液上清液，并按照制作标准曲线的方法测定上清液中氨基酸含量（用异亮氨酸当量表示）。
1.3 数据处理
所有实验均至少平行进行3次，实验数据以平均±标准差（SD）表示。采用单因素方差分析，均值比较采用Duncan多重检验，P<0.05为显著性。本文中的所有的实验数据图都是使用Origin 2021软件完成的。
2. 结果与分析
2.1 ZNPs和CZNPs的表征
2.1.1 ZNPs和CZNPs的平均粒径和Zeta电位及包埋率
由表1可知，ZNPs、C2ZNPs、C3ZNPs和C4ZNPs的平均粒径分别为124.7±1.3、118.6±0.7、111.1±0.5和103.5±0.4 nm，即随着制备体系中姜黄素的添加量从0 mg增加到4 mg，纳米颗粒的平均粒径减小了约20 nm，这可能是因为疏水性姜黄素分子与富含疏水性氨基酸（如脯氨酸）的Zein分子之间发生了很强的相互作用，如疏水相互作用、静电作用和氢键等，使Zein在自组装过程中肽链之间结合得更紧密，并最终导致纳米颗粒的粒径减小[21]。ZNPs、C2ZNPs、C3ZNPs的Zeta电位无显著差异（P>0.05），而C4ZNPs的Zeta电位显著降低（P<0.05），这可能是因为姜黄素的添加量较大时，较多带有负电的姜黄素附着在玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面，使C4ZNPs的电位有明显降低[22]。上述实验结果与Patel等[23]的研究结果相似。
表 1 ZNPs和CZNPs的平均粒径和Zeta电位Table 1. Average diameter and Zeta potential of ZNPs and CZNPs样品名称 ZNPs C2ZNPs C3ZNPs C4ZNPs 平均粒径（nm） 124.7±1.3d 118.6±0.7c 111.1±0.5b 103.5±0.4a Zeta电位（mV） 19.5±4.75b 19.9±3.79b 21.5±5.7b 13.3±4.18a 注：同行不同小写字母表示不同组间纳米颗粒差异显著（P<0.05）；表2同。 由表2可知，C2ZNPs，C3ZNPs和C4ZNPs的包埋率分别为99.00%±1.0%，65.07%±1.4%和52.00%±1.5%，即加入2 mg姜黄素制备的CZNPs包埋率最高，而当姜黄素的添加量增加到3和4 mg时，CZNPs的包埋率逐渐减少。这可能是因为随着姜黄素添加量的增高，较多的姜黄素沉淀在溶液中，而没有被包埋在Zein基质中[23]。因此，在后续的表征和体外消化实验中，选取C2ZNPs作为实验材料。
表 2 CZNPs中姜黄素的包埋率Table 2. Encapsulation efficiency of Cur in CZNPs样品名称 C2ZNPs C3ZNPs C4ZNPs 包埋率（%） 99.00±1.0c 65.07±1.4b 52.00±1.5a 2.1.2 ZNPs和CZNPs的紫外-可见吸收光谱
图1是姜黄素乙醇溶液、ZNPs溶液和C2ZNPs溶液在200~700 nm波长范围内的紫外-可见吸收光谱。由图1可以看出，姜黄素的最大吸收峰位于424 nm波长处，该吸收峰源于酮-烯醇式姜黄素分子的π—π*跃迁[24]。ZNPs的吸收峰出现在214 nm，主要是由蛋白肽键上C=O的n—π*跃迁引起[25]。C2ZNPs的紫外-可见吸收光谱上同时出现了姜黄素和ZNPs的吸收峰，且姜黄素的吸收峰强度明显降低，说明姜黄素与Zein成功复合在了一起且被包埋进了纳米颗粒中。另外，姜黄素的吸收峰向右红移了约5 nm，进一步表明其与Zein分子之间存在着一定的相互作用。
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图 1 Cur、C2ZNPs、ZNPs溶液的紫外-可见吸收光谱Figure 1. UV visible absorption spectra of Cur, C2ZNPs and ZNPs solutions2.1.3 ZNPs和C2ZNPs的微观结构
在SEM显微镜下观察冷冻干燥的ZNPs和C2ZNPs样品并拍得如图2A和B所示的图像。由图2可以看出，ZNPs和C2ZNPs是分布比较均匀的球形或椭球形颗粒，但是C2ZNPs颗粒间有明显的粘连。这可能是因为姜黄素不仅被包埋在纳米颗粒内部，也有少量附着在纳米颗粒表面，使纳米颗粒的疏水性增加，导致C2ZNPs颗粒之间形成比ZNPs更严重的粘连[26]。
2.1.4 ZNPs和C2ZNPs的傅里叶红外光谱分析
图3显示了在3500~1000 cm−1范围内姜黄素、C2ZNPs和ZNPs的FTIR光谱。对于姜黄素来说，其光谱上3311.2 cm−1处的吸收峰归因于苯环上羟基基团的拉伸，而在1511.9 cm−1处的峰归因于C-C和C-O基团的振动[27]。在ZNPs的光谱中，3315.0、1666.2和1544.7 cm−1处的峰分别归因于-OH拉伸、C-O拉伸（酰胺Ⅰ带）和C-N拉伸与N-H弯曲模式（酰胺Ⅱ带）耦合[28]。当Zein与姜黄素结合时，酰胺Ⅰ带的峰位置从1666.2 cm−1移动到1662.3.cm−1，羟基的峰位置从3315.0、3311.2 cm−1移动到3305.4 cm−1，姜黄素光谱中在1511.9 cm−1处出现的特征峰在C2ZNPs光谱中没有出现，表明两种组分通过疏水性相互作用和形成氢键等方式结合在一起[29]，这与Chen等[15]的研究结果相一致。
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图 3 Cur、C2ZNPs、ZNPs的傅里叶变换中红外光谱注：a：Cur；b：C2ZNPs；c：ZNPs。Figure 3. Fourier transform infrared spectra of Cur, C2ZNPs and ZNPs2.2 ZNPs和C2ZNPs的体外消化特性
在消化过程中，纳米递送载体可能会因为pH的急剧变化发生絮凝，也可能在消化酶的作用下发生降解。因此，本研究通过分析胃肠消化过程中ZNPs和C2ZNPs平均粒径、Zeta电位、形貌的变化以及消化液上清液中游离姜黄素的含量、游离氨基酸的含量[30]等指标来表征C2ZNPs的体外消化特性，从而进一步确定Zein作为口服活性物质载体的可行性。
2.2.1 消化过程中ZNPs和C2ZNPs粒径与Zeta电位
在pH为7.5的条件下测定了消化不同时间后ZNPs和C2ZNPs的粒径和Zeta电位，结果分别如图4和图5所示。
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图 5 不同消化时间点ZNPs和C2NPs的Zeta电位Figure 5. Zeta potential of ZNPs and C2ZNPs at different digestive time由图4可以看出，与模拟消化液孵育不同时间后，ZNPs和C2ZNPs的平均粒径均显著增大。特别是C2ZNPs，在模拟胃液中孵育60 min以及在模拟肠液中继续孵育至90 min时，其平均粒径分别增大至原来的80倍和60倍，这可能与下述原因有关：pH的剧烈变化使Zein的溶解性和稳定性降低，纳米颗粒发生了聚集[31]；在盐酸和蛋白酶的作用下，部分Zein分子发生降解，自组装纳米颗粒的微观结构受到了影响[32]；包埋在C2ZNPs内部的姜黄素分子在消化过程中被逐渐释放出来，由于姜黄素在酸性条件（模拟胃液）下的溶解度很小，释放出来的姜黄素可能从溶液中析出而吸附在纳米颗粒表面，使纳米颗粒的疏水性增大，进而发生聚集[32]。随着C2ZNPs在模拟肠液中的消化时间进一步延长，其平均粒径明显减小，120 min后，与ZNPs在模拟肠液中的平均粒径相差不大，这可能是因为在模拟胃液中由姜黄素引起的聚集作用在模拟肠液的碱性条件下逐渐减弱[33]。
由图5可以看出，ZNPs和C2ZNPs的Zeta电位经体外模拟消化后由正的变为负的，这主要是因为消化结束后消化液的pH被调至7.5，略高于Zein的等电点（约6.5），使得纳米颗粒表面的净电荷为负[34]。虽然ZNPs和C2ZNPs在大部分消化时间点的Zeta电位的绝对值都大于20 mV，但是C2ZNPs在模拟胃液消化60 min和在模拟肠液消化30 min时Zeta电位的绝对值很小，表明其在这两个时间点的稳定性最差，可能发生比较严重的聚集。该结果与图4的结果一致。
2.2.2 模拟胃肠消化结束后ZNPs和C2ZNPs的微观形貌
模拟胃肠消化结束后，通过SEM观察了ZNPs与C2ZNPs微观形貌的变化。由图6A和B可以看出，ZNPs与C2ZNPs在模拟胃消化60 min结束后，纳米颗粒之间都出现了明显的聚集、黏着和融合，形成了粒径较大的不规则颗粒，而且C2ZNPS比ZNPs融合得严重，形成的颗粒粒径也更大[35]。ZNPs在模拟肠液中继续消化至180 min后，其微观形貌与胃消化结束时的微观形貌基本一致；而C2ZNPs在模拟肠液中继续消化至180 min后，虽然颗粒之间仍有黏连，但其粒径与模拟胃消化结束时的粒径相比，明显减小。上述结果与粒径测定的结果一致，而且与Zou等[36]报道的结果相似。
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图 6 模拟胃肠消化结束后ZNPs和C2ZNPs的扫描电子显微镜照片注：A：模拟胃消化结束后ZNPs；B：模拟胃消化结束后C2ZNPs；C：模拟肠消化结束后ZNPs；D：模拟肠消化结束后C2ZNPs。Figure 6. SEM micrographs of ZNPs和C2ZNPs at the end of simulated gastrointestinal digestion2.2.3 消化液中姜黄素含量随消化时间的变化
由图7可以看出，姜黄素乙醇溶液跟模拟胃液混合后，随着胃消化时间延长，上清液中姜黄素的浓度逐渐降低；当胃消化产物与模拟肠液混合后，随着肠消化时间延长，上清液中姜黄素的浓度逐渐升高，这可能与姜黄素在不同pH条件下的溶解度有关。我们先前的研究表明，姜黄素在酸性条件下溶解度很小，随着pH增大，溶解度增大[11]。因此，当姜黄素乙醇溶液与强酸性胃液（pH1.2）混合后，随着时间延长，越来越多的姜黄素沉淀出来，导致姜黄素在消化液中的残留量减少。而当胃消化产物与模拟肠液混合后，溶液的pH被调整至7.5，随着时间延长，原来沉淀的姜黄素被重新溶解，导致消化液中姜黄素的含量增大。然而对于C2ZNPs纳米颗粒来说，在整个消化过程中消化液中姜黄素含量变化不大，而且明显低于姜黄素乙醇溶液中姜黄素的含量，说明C2ZNPs能够起到缓释的作用，这可能有利于其通过胞吞的方式被小肠上皮细胞吸收[37]。
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图 7 C2ZNPs和姜黄素乙醇溶液消化不同时间后消化液中姜黄素的含量Figure 7. Amount of Cur in digestive solutions of C2ZNPs and Cur ethanol solution at different digestive time2.2.4 消化液中氨基酸含量的变化
由图8可以看出，C2ZNPs与模拟胃液混合且消化30 min后，消化液中氨基酸含量（用异亮氨酸当量表示）明显升高，当消化时间继续延长至60 min时，消化液中氨基酸的含量轻微升高。这可能是因为在前30 min时，C2ZNPs中的Zein在胃蛋白酶的作用下发生部分降解，形成了分子量较小的氨基酸[38]；而在60 min时，由于C2ZNPs聚集黏着严重，形成了不规则的大颗粒，颗粒的表面积减小，胃蛋白酶与Zein的结合机会和作用位点减少，氨基酸的生成速度减弱。随后，上述胃消化产物与模拟肠液混合，在前30 min，消化液中氨基酸的含量迅速升高，而在后续的90 min，含量基本不变。在模拟胃、肠两个消化阶段，Zein水解程度的差异可能与胃蛋白酶和胰蛋白酶的特异性作用位点及水解度不同有关。通过查阅文献资料发现，相较于胰蛋白酶（水解位点为精氨酸和赖氨酸），胃蛋白酶的水解位点（主要集中在苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和亮氨酸）更加广泛[39-40]。因此，虽然C2ZNPs在模拟肠消化阶段分散性增大，但Zein在胰蛋白酶作用下的水解程度很小，因此氨基酸的含量在后续90 min没有明显增大，而前30 min氨基酸含量增大可能是因为Zein经胃消化产生的低分子量蛋白被胰蛋白酶进一步降解为氨基酸。
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图 8 C2ZNPs消化不同时间后消化液中氨基酸含量Figure 8. Content of amino acids in digestive fluid after C2ZNPs digestion for different times3. 结论
本研究通过反溶剂沉淀法成功制备了包埋姜黄素的Zein纳米颗粒CZNPs，确定了当姜黄素与Zein的质量比为1:40时，姜黄素的包埋率最高，为99%±1%。制得的CZNPs是平均粒径为118.6±0.7 nm，Zeta电位为19.9±3.79 mV的球形纳米颗粒。在体外模拟胃消化过程中，随着消化时间的延长，CZNPs会出现明显的聚集，平均粒径增大至微米级；Zein在胃蛋白酶的作用下降解为低分子量多肽和氨基酸，且姜黄素被缓慢释放。在后续的模拟肠消化过程中，CZNPs的聚集程度随着消化时间的延长明显减弱，且Zein保持稳定，没有被胰蛋白酶继续降解，这可能有利于其通过胞吞的方式被小肠上皮细胞吸收，增大姜黄素的生物利用率，但是该推论还有待通过细胞实验和动物实验进行验证。另外，纳米递送载体在消化液中的稳定性与其对功能活性成分的保护作用和功能活性成分的最终生物利用率息息相关，在后续的研究中，我们将通过修饰、改性等方法增强CZNPs在消化液（特别是胃液）中的稳定性。
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图 1 Cur、C2ZNPs、ZNPs溶液的紫外-可见吸收光谱
Figure 1. UV visible absorption spectra of Cur, C2ZNPs and ZNPs solutions
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图 3 Cur、C2ZNPs、ZNPs的傅里叶变换中红外光谱
注：a：Cur；b：C2ZNPs；c：ZNPs。
Figure 3. Fourier transform infrared spectra of Cur, C2ZNPs and ZNPs
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图 5 不同消化时间点ZNPs和C2NPs的Zeta电位
Figure 5. Zeta potential of ZNPs and C2ZNPs at different digestive time
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图 6 模拟胃肠消化结束后ZNPs和C2ZNPs的扫描电子显微镜照片
注：A：模拟胃消化结束后ZNPs；B：模拟胃消化结束后C2ZNPs；C：模拟肠消化结束后ZNPs；D：模拟肠消化结束后C2ZNPs。
Figure 6. SEM micrographs of ZNPs和C2ZNPs at the end of simulated gastrointestinal digestion
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图 7 C2ZNPs和姜黄素乙醇溶液消化不同时间后消化液中姜黄素的含量
Figure 7. Amount of Cur in digestive solutions of C2ZNPs and Cur ethanol solution at different digestive time
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图 8 C2ZNPs消化不同时间后消化液中氨基酸含量
Figure 8. Content of amino acids in digestive fluid after C2ZNPs digestion for different times
表 1 ZNPs和CZNPs的平均粒径和Zeta电位
Table 1 Average diameter and Zeta potential of ZNPs and CZNPs
样品名称 ZNPs C2ZNPs C3ZNPs C4ZNPs 平均粒径（nm） 124.7±1.3d 118.6±0.7c 111.1±0.5b 103.5±0.4a Zeta电位（mV） 19.5±4.75b 19.9±3.79b 21.5±5.7b 13.3±4.18a 注：同行不同小写字母表示不同组间纳米颗粒差异显著（P<0.05）；表2同。 
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表 2 CZNPs中姜黄素的包埋率
Table 2 Encapsulation efficiency of Cur in CZNPs
样品名称 C2ZNPs C3ZNPs C4ZNPs 包埋率（%） 99.00±1.0c 65.07±1.4b 52.00±1.5a
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