Optimization of Protein Extraction and Analysis of Hypoglycemic Activity in Vitro of 6 Different Enzymatic Hydrolysates from Protein Mulberry Leaves
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摘要: 为开发利用蛋白桑叶中蛋白质资源，对其蛋白质提取工艺及酶解物体外降血糖活性进行研究。本研究以蛋白桑叶为原料，采用超声辅助碱提酸沉法提取蛋白桑叶蛋白质。通过单因素实验和响应面法优化提取工艺，以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，分析不同蛋白桑叶蛋白酶解产物体外降血糖活性。结果表明，蛋白桑叶中蛋白质的最佳提取工艺为：氢氧化钠浓度0.125 mol/L、提取温度40 ℃、提取时间40 min和液料比37:1 mL/g。在此优化条件下，得到蛋白质提取率实际值为49.59%±0.45%，所得蛋白质等电点为pH3.5，吸水性为6.49±0.49 g/g，吸油性为2.59±0.06 g/g，乳化活性为7.40±0.17 m2/g，乳化稳定性为72.48%±3.03%。研究考察了蛋白桑叶蛋白质的复合蛋白酶酶解物、风味蛋白酶酶解物、碱性蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物、木瓜蛋白酶酶解物体外降血糖活性，其中中性蛋白酶酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳，其IC50=3.52 mg/mL。本研究认为，此蛋白桑叶蛋白质提取工艺稳定，中性蛋白酶解肽具有较高的体外降血糖活性，为进一步开发蛋白桑叶蛋白质及其多肽资源提供参考。Abstract: The protein extraction process of protein mulberry leaves and hypoglycemic activity in vitro of the enzymatic hydrolysates were studied aiming at further developing and utilizing protein resources in mulberry leaves. Protein mulberry leaf protein (PMLP) was extracted from protein mulberry leaves through the ultrasound-aided alkaline extraction and acid precipitation. The single factor experiments and response surface methodology were applied to optimize the extraction process of PMLP. The inhibitory rate of α-glucosidase was used as the evaluation index to analyze the hypoglycemic activity in vitro of different PMLP enzymatic hydrolysates. The results showed that the optimum extraction conditions of PMLP were as follows: NaOH concentration was 0.125 mol/L, extraction temperature was 40 ℃, extraction time was 40 min and liquid-solid ratio was 37:1 mL/g. Under these conditions, the actual extraction rate of PMLP reached 49.59%±0.45%, the obtained protein isoelectric point was pH3.5, the water holding capacity was 6.49±0.49 g/g, the oil holding capacity was 2.59±0.06 g/g, the emulsifying activity was 7.40±0.17 m2/g, and the emulsion stability was 72.48%±3.03%. The hypoglycemic activity in vitro of the PMLP enzymatic hydrolysates digested by compound protease hydrolysate, flavor protease hydrolysate, alkaline protease hydrolysate, trypsin hydrolysate, neutral protease hydrolysate and papain was investigated. Among the enzyme species examined, the neutral protease hydrolysate of PMLP demonstrated the highest inhibitory effect on α-glucosidase with IC50=3.52 mg/mL. According to results of the study, the extraction process of PMLP was stable, and the PMLP enzymatic hydrolysate digested by neutral protease had strong hypoglycemic activity in vitro, which would provide a reference for the further development of protein mulberry leaf protein and peptides resources.
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桑（Morus alba L.）为桑科桑树落叶乔木或灌木，广泛分布于亚洲和欧洲。桑叶是桑的主要产物，由于其含有丰富的营养价值，在1993年被我国卫生部列为药食两用的农产品，具有防治糖尿病等功效，作为绿色、健康食品被推广[1-4]。基于桑叶广泛的应用价值，近年来我国科研人员通过人工选择与杂交育种，培育出抗逆性品系——蛋白桑。据报道，蛋白桑干桑叶粉中粗蛋白含量在25%~35%之间，含有18种氨基酸，种类齐全，其中动物必需氨基酸占总氨基酸质量分数的43%，是优质的蛋白质资源[5-7]。关于桑叶蛋白的提取加工方法有较广泛的研究，目前桑叶蛋白的提取方式有直接加热法、酸碱沉淀法、盐析法[8]、乳酸发酵法[9]以及泡沫分离[10]等技术，其中酸碱沉淀法[11]由于其廉价、高效的特性，最为工业化生产常用。超声波作为一种辅助提取的技术，其在传播过程中产生的超声效应可使介质的形态、结构等发生一定变化，可大大提高蛋白质的提取率，改善蛋白质功能特性[12-13]。研究发现，超声辅助提取桑叶蛋白质，提取率可达9%[14]以上，然而目前大多研究多采用水或盐溶液作为提取溶剂[8,14]，基于酸碱沉淀及超声波辅助提取两种高效提取方法联用的工艺优化研究较少。
糖尿病是人类健康的重要威胁[15]，α-葡糖苷酶抑制剂可以延长碳水化合物的消化时间，由此降低餐后血糖，是最具临床价值的降血糖药物之一[16]。多肽由于具有降血糖活性好、副作用少等优点，被认为是目前最广泛研究的潜在治疗剂[17-18]。目前从骆驼乳清[19]、鹰嘴豆[20]、蜂王浆[21]、辣木籽[22]中提取分离得到的多肽均有抑制α-葡萄糖苷酶活性，起到辅助降低血糖的作用。
2017年，国家发改委已明确发展功能性蛋白和生物活性肽等保健和健康食品的政策，桑叶是产量大、蛋白质含量高的“药食同源”产品，蛋白桑作为桑中蛋白质优势新资源，具有更加广阔的研究空间。关于桑叶的活性成分提取及活性分析研究，目前主要集中于黄酮、生物碱等次生代谢物[22-24]，其蛋白质及活性肽方面则少有关注。桑叶活性肽制备及体外活性分析方面，贾漫丽等[25]、Sun等[26-28]已就抗氧化、抗炎、心血管调节等方面进行了相关探索。降血糖方面，冯雪等[29]就桑叶多肽维持血糖健康水平情况进行了评价，但桑叶降血糖活性肽制备、体外降血糖相关指标及体内降血糖机制等研究仍较为缺乏。当前新品种资源蛋白桑主要用于动物饲料[5-7]，作为一种优质的蛋白质资源，其蛋白质及多肽的提取及活性评价仍有待深入研究，在人用保健品等方面具有广阔的研究开发价值。
基于此，本研究以新品种资源蛋白桑叶为研究对象，采用超声辅助碱提酸沉法提取蛋白桑叶中蛋白质，利用响应面法优化其提取工艺，对其功能特性进行测定，并通过酶解法酶解蛋白质，以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标，考察不同蛋白酶对蛋白酶解物体外降血糖活性的影响，研究结果为蛋白桑叶蛋白质及多肽资源在降血糖等领域的进一步开发利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
蛋白桑叶 采收于2021年9月，由北京市大兴区黎明村农业生态园提供；Bradford蛋白质定量试剂盒（包含考马斯亮蓝染色剂，1 mg/mL牛血清白蛋白溶液） 天根生化科技（北京）有限公司；大豆油（批准文号：膳食药准字F2009009） 江西益普生药业有限公司；风味蛋白酶（150000 U/g）、碱性蛋白酶（200 U/mg，来源于地衣芽孢杆菌） 上海麦克林生化科技有限公司；胰蛋白酶（≥3000 U/mg，来源于牛胰脏）、木瓜蛋白酶（≥2000 U/mg，以酪蛋白为底物） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿卡波糖、复合蛋白酶（120 U/mg，来源于枯草杆菌，为杆菌蛋白酶复合体）、中性蛋白酶（≥14000 U/g， 来源于米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（26.5 U/mg，来源于酵母）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）、磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline溶液，即PBS溶液，pH6.8，0.01mol/L） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂为分析纯。
800Y型高速多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；HR-500全自动凯氏定氮仪 上海力辰邦西仪器科技有限公司；FE28-Standard型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FD-2A型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；BY-G20型医用离心机 北京白洋医疗器械有限公司；HH-S4A型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；820HTD型数码超声波清洗机 深圳市观益佳科技有限公司；RCD-1A型高速分散器 金坛区西城新瑞仪器厂；Epoch型多功能酶标仪 BioTek Instruments Inc.。
1.2 实验方法
1.2.1 蛋白桑叶预处理
将新鲜蛋白桑叶洗净，晾干，挑选完整、无病变蛋白桑叶，剪去叶柄后阴干（于避免阳光直射的通风处，25~30 ℃条件下自然晾干）；阴干蛋白桑叶于高速粉碎机粉碎后过4号筛，−4 ℃保存备用。
1.2.2 蛋白质含量测定
参考GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质含量的测定》中自动凯氏定氮法，并在此基础上根据实际情况进行方法改进，测定蛋白桑叶中蛋白质含量。精确称取充分混匀的蛋白桑叶粉末0.5 g至消化管中，加入0.4 g硫酸铜、6 g硫酸钾及20 mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温达到420 ℃后继续消化1 h至消化管中液体呈绿色透明状，冷却后于自动凯氏定氮仪（使用前加入40%氢氧化钠溶液，含有以1份0.1%甲基红乙醇溶液及5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液的混合指示剂的2%的硼酸溶液）上实现自动加液、蒸馏过程。以盐酸标准滴定溶液滴定至终点，记录数据。
试样中蛋白质的含量的计算公式如下：
试样中蛋白质的含量(g/100g)=(V1−V2)×C×0.0140m×F×100 (1) 式中，V1，试液消耗盐酸标准滴定液的体积（mL）；V2，试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积（mL）；C，盐酸标准滴定液浓度（mol/L）；m，蛋白桑叶粉质量（g）；F，氮换算为蛋白质的系数，6.25。
1.2.3 蛋白质提取液制备
1.2.3.1 蛋白桑叶中蛋白质提取方法
参考文献[30-32]方法，取一定量蛋白桑叶粉溶于适量一定浓度的氢氧化钠溶液中，于特定温度，超声功率480 W条件下进行超声辅助提取。蛋白桑叶蛋白提取液在9000 r/min条件下离心15 min，收集上清液。将收集到的桑叶蛋白溶液用1 mol/L 盐酸调节体系pH调节至等电点3.5，静置30 min，6000 r/min离心10 min，收集沉淀，蒸馏水洗涤，冷冻干燥，得到桑叶蛋白粉。
1.2.3.2 单因素实验
以氢氧化钠浓度0.1 mol/L，液料比40:1 mL/g，提取时间20 min，提取温度40 ℃，为基础条件。考察氢氧化钠浓度（0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 mol/L）、提取温度（25、30、35、40、45、50 ℃）、提取时间（20、30、40、50、60 min）、液料比（20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g）4个因素对蛋白提取效率的影响，每组实验重复3次。
1.2.3.3 响应面试验
根据单因素实验结果，选择氢氧化钠浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和液料比（D）4个因素为自变量，以桑叶蛋白质提取率为响应值，进行Box-Behnken的中心组合试验方案的设计，并进行验证。试验设计方案见表1。
表 1 Box-Behnken试验设计因素和水平Table 1. Box-Behnken trial design factors and levels因素 水平 −1 0 1 A氢氧化钠浓度（mol/L） 0.1 0.125 0.15 B提取温度（℃） 40 45 50 C提取时间（min） 30 40 50 D液料比（mL/g） 30:1 40:1 50:1 1.2.3.4 蛋白桑叶中蛋白质提取率测定
以Bradford试剂盒方法蛋白检测桑叶蛋白质提取液中蛋白含量，计算桑叶蛋白提取率。吸取5 μL蛋白质提取上清液，加入10 μL PBS溶液及285 μL考马斯亮蓝溶液于96孔板中混匀，于波长595 nm处测定蛋白质提取液吸光值。以1 mg/mL牛血清白蛋白为标准蛋白质制作标准曲线，并建立回归方程：y=0.1314x+0.0095，R2=0.9991，其中，y为所吸取蛋白质提取液中蛋白质含量（μg），x为吸光度值。桑叶蛋白提取率的计算公式如下：
桑叶蛋白提取率(%)=m1m2×100 (2) 式中，m1，蛋白桑叶蛋白质提取液上清中蛋白质含量（mg）；m2，样品中蛋白质含量（mg）。
1.2.4 蛋白质等电点测定
参照文献[11]方法，蛋白质提取液冷却至室温后，取15 mL用1 mol/L HCl调解体系pH分别为2.5、3、3.5、4、4.5、5.0，静置30 min，6000 r/min离心10 min，Bradford法测定上清中蛋白质浓度，浓度最小的点对应pH值视为桑叶蛋白溶液等电点。
1.2.5 桑叶蛋白质功能特性的测定
1.2.5.1 吸水性（WHC）的测定
参考孙崇臻等[8]、乔璐[30]的方法，取100 mg桑叶蛋白粉于15 mL离心管，与10 mL去离子水混合均匀，室温静置30 min，于25 ℃，4000 r/min条件下离心30 min，去上清，将离心管倒置10 min后称重。
吸水性（WHC）的计算公式如下：
WHC(g/g)=m2−m1−m0m0 (3) 式中，m2，最终总重（g）；m1，离心管重（g）；m0，桑叶蛋白粉重（g）。
1.2.5.2 吸油性（OAC）的测定
参考乔璐[30]的方法，取100 mg桑叶蛋白粉于15 mL离心管，与10 mL大豆油混合均匀，室温静置30 min，于25 ℃，4000 r/min条件下离心30 min，去上清，将离心管倒置10 min后称重。
吸油性（OAC）的计算公式如下：
OAC(g/g)=m2−m1−m0m0 (4) 式中，m2为最终总重（g）；m1为离心管重（g）；m0为桑叶蛋白粉重（g）。
1.2.5.3 乳化性（EAI）及其稳定性（ESI）的测定
参考Wang等[13]、邓爱华等[33]的方法，配制质量分数为1%的蛋白质溶液，与适量大豆油按照体积比3:1的比例搅拌混合，在10000 r/min速度下均质2 min。于0 min和静置10 min时从容器底部取50 µL乳浊液，与5 mL质量分数为0.1%的SDS溶液混合均匀，用紫外分光光度计于波长500 nm处分别于0 min（A0）和10 min（A10）时测定吸光度值。
乳化性和乳化稳定性的计算公式如下：
EAI(m2/g)=2×2.303×A0×DFC×φ×θ×10000 (5) ESI(%)=A10A0×100 (6) 式中，DF，样品稀释倍数（100）；C，蛋白质质量浓度（g/mL）；φ，光程（设定为0.01）；θ，乳状液的油体积分数（0.25）。
1.2.6 不同蛋白酶对蛋白桑叶中蛋白质的酶解及体外降血糖活性检测
参考孙崇臻等[34]的方法，桑叶蛋白粉用蒸馏水分散，配制10 mg/mL的蛋白溶液。调节温度至酶解所需温度，预热10 min，以1 mol/L 氢氧化钠溶液及1 mol/L 盐酸溶液调节蛋白溶液至所需 pH，控制加酶量为底物浓度的5%，酶解时间2 h，在最适条件下酶解，酶解过程中每15 min调节一次pH。酶解结束后，95 ℃灭活10 min以终止反应。酶解液6000 r/min离心15 min，冷冻干燥，−20 ℃冻存。考察复合蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶对桑叶蛋白酶解产物体外降血糖活性影响，酶解条件见表2。
酶种类 酶解温度（℃） pH 复合蛋白酶 55 8.0 风味蛋白酶 50 7.0 碱性蛋白酶 50 8.0 胰蛋白酶 37 8.0 中性蛋白酶 45 7.0 木瓜蛋白酶 55 6.5 以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标，检测桑叶蛋白酶解产物体外降血糖活性。
α-葡萄糖苷酶抑制率检测：参考Su等[35]的方法，于96孔板中加入20 µL不同浓度的样品溶液，10 µL 0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶（以pH=6.8的PBS缓冲液为溶剂）和50 µL PBS（pH=6.8）缓冲液，充分混匀，37 ℃反应20 min。再加入5 mmol/L p-NPG溶液50 µL作为底物，37 ℃反应30 min。加入140 µL 1 mol/L碳酸钠溶液终止反应，于405 nm处测吸光值。阳性对照组加入20 µL不同浓度的阿卡波糖溶液与10 µL α-葡萄糖苷酶溶液，样品背景组加入20 µL样品溶液与10 µL PBS缓冲液，阴性对照组加入20 µL PBS缓冲液与10 µL α-葡萄糖苷酶溶液，阴性背景组加入30 µL PBS缓冲液，其余操作与上述相同。
α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式如下：
α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(1−A2−A1A4−A3)×100 (7) 式中，A1，样品背景组吸光值；A2，样品组或阳性对照组吸光值；A3，阴性背景组吸光值；A4，阴性对照组吸光值。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次，结果取平均值，实验结果由平均值±SD表示。采用SPSS20.0软件进行分析和计算IC50值，组间差异比较采用单因素ANOVA检验来比较其差异显著性。响应面模型的建立通过Design Expert 8.0.6软件进行计算和分析处理。作图通过Graphpad Prism 8.0.1进行处理。
2. 结果与分析
2.1 蛋白桑叶蛋白质提取单因素考察结果
2.1.1 氢氧化钠浓度对蛋白桑叶蛋白质提取率的影响
由图1可知，氢氧化钠浓度为0.125 mol/L时，蛋白质提取率达到峰值48.35%，当氢氧化钠浓度超过0.125 mol/L达到0.15 mol/L时，蛋白质提取率趋于平缓，这是由于一定碱性范围内，随着碱液浓度的升高，蛋白质分子与水的作用力增强，使蛋白质在水中的溶解性增强[11,35]。而当氢氧化钠浓度超过0.15 mol/L后蛋白质提取率急剧下降，这可能和氢氧化钠浓度过高加快了美拉德反应，引起可溶性蛋白质与还原糖反应，导致蛋白质变性和水解有关[36]。综合考虑，选择氢氧化钠浓度为0.125 mol/L进行后续响应面试验较为合适。
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2.1.2 提取温度对蛋白桑叶蛋白质提取率的影响
由图2可知，在25~45 ℃的温度范围内，随着温度的升高，蛋白质提取率逐渐上升，在温度为45 ℃时，达到峰值47.54%，温度继续升高，蛋白质提取率下降。这可能是由于在适当的温度范围内，温度的升高会增加溶液中分子的动能和扩散速率，有助于蛋白质在水中的溶解，而当提取温度超过45℃时，由于温度过高，蛋白质的空间构象被破坏，使得蛋白质疏水基团展开暴露，蛋白质逐渐变性絮凝，无法跟随溶剂提取出来[36]。综合考虑，选择45 ℃为最佳超声温度。
2.1.3 提取时间对蛋白桑叶蛋白质提取率的影响
由图3可知，在20~40 min内，随着提取时间的增长，蛋白桑叶蛋白质提取率整体呈上升趋势，在超声提取40 min时达到峰值45.12%，超过40 min后蛋白质提取率逐渐下降。超声波产生的机械效应可以使蛋白质短时间内快速溶出，但长时间超声也可能导致蛋白质结构被破坏，使得蛋白质溶出减少[36]。综合考虑，提取时间为40 min时可获得较大的蛋白质提取率。
2.1.4 液料比对蛋白桑叶蛋白质提取率的影响
由图4可知，在液料比10:1~40:1 mL/g的范围内，随着液料比的增加，蛋白桑叶蛋白质呈现上升趋势，在液料比为40:1 mL/g时达到峰值43.82%。当液料比超过40:1 mL/g后，蛋白质提取率逐渐下降。这可能是由于当溶剂用量较小时，蛋白桑叶粉未完全溶解，溶液较为粘稠，不利于蛋白质的析出[37]，随着溶剂体积不断变大，体系黏度逐渐变低，传质过程加快，蛋白质提取率升高。但当液体体积过大，蛋白质溶出水平已达到最大，再增加液体体积反而使提取率降低。综合考虑，选择最适液料比为40:1 mL/g进行后续响应面试验。
2.2 蛋白桑叶蛋白质提取响应面试验
2.2.1 响应面试验设计与结果
根据超声波辅助碱法提取桑叶蛋白质的单因素实验结果，选择氢氧化钠浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和液料比（D）4个因素为响应面设计中的关键因素，以桑叶蛋白质提取率为响应值，进行Box-Behnken的中心组合试验方案的设计，共计29次试验，结果见表3。
表 3 超声波辅助碱法提取蛋白桑叶蛋白质响应面试验设计方案与结果Table 3. Design and results of ultrasound-aided alkaline extraction of protein mulberry leaf protein (PMLP) response surface test实验号 A氢氧化钠
浓度B提取
温度C提取
时间D液料比 蛋白质
提取率（%）1 1 0 1 0 44.90±0.13 2 0 0 −1 1 42.43±0.29 3 −1 0 0 −1 45.94±1.01 4 −1 0 −1 0 44.90±0.26 5 −1 0 0 1 40.38±0.42 6 0 −1 1 0 48.09±0.28 7 0 −1 0 −1 47.63±1.40 8 1 1 0 0 45.99±0.75 9 0 1 1 0 44.45±0.55 10 0 0 0 0 48.18±1.25 11 0 1 0 −1 43.15±0.15 12 0 0 0 0 48.01±0.93 13 0 0 0 0 48.83±0.75 14 0 −1 0 1 43.24±0.81 15 0 0 1 −1 43.26±0.28 16 0 1 −1 0 47.84±1.35 17 −1 −1 0 0 47.12±0.51 18 1 −1 0 0 48.03±1.28 19 0 −1 −1 0 46.91±0.38 20 −1 1 0 0 43.35±0.64 21 1 0 0 −1 44.51±1.04 22 1 0 −1 0 48.44±1.22 23 0 0 1 1 43.20±1.15 24 −1 0 1 0 44.28±0.93 25 0 1 0 1 44.00±0.74 26 0 0 0 0 50.12±0.48 27 0 0 0 0 48.68±1.00 28 1 0 0 1 44.95±0.98 29 0 0 −1 −1 46.18±1.17 利用Design-Expert 8.0.6分析软件对试验结果进行多元回归分析，得到蛋白桑蛋白质提取率（Y）预测模型：
Y=48.76+0.9A−1.02B−0.71C−1.04D+0.43AB−0.73AC+1.5AD−1.14BC+1.31BD+0.92CD−1.67A2−0.79B2−1.4C2−3.41D2
由表4可知，模型极显著（P<0.01），失拟项不显著（P=0.8509），模型决定系数R2=0.9577，说明回归方程有较高拟合度和相关性，模型预测值能较好地反映实际值，可以对超声波辅助碱法提取桑叶蛋白质提取率进行分析和预测。模拟项的A、B、C、D、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2达到极显著水平（P<0.01），AC、CD达到显著水平（P<0.05）。各因素对蛋白质提取率的影响顺序分别是：液料比（D）>提取温度（B）>氢氧化钠浓度（A）>提取时间（C）。
表 4 超声波辅助碱法提取桑叶蛋白质响应面试验结果方差分析Table 4. Analysis of variance of response surface test results of PMLP extraction by ultrasonic-assisted alkali method来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 153.44 14 10.96 25.69 <0.0001 ** A 9.81 1 9.81 23.00 0.0003 ** B 12.48 1 12.48 29.27 <0.0001 ** C 6.05 1 6.05 14.18 0.0021 ** D 12.96 1 12.96 30.38 <0.0001 ** AB 0.75 1 0.75 1.75 0.2066 AC 2.13 1 2.13 5.00 0.0422 * AD 9.00 1 9.00 21.10 0.0004 ** BC 5.22 1 5.22 12.24 0.0035 ** BD 6.86 1 6.86 16.09 0.0013 ** CD 3.40 1 3.40 7.98 0.0135 * A2 17.99 1 17.99 42.17 <0.0001 ** B2 4.04 1 4.04 9.47 0.0082 ** C2 12.79 1 12.79 29.98 <0.0001 ** D2 75.22 1 75.22 176.33 <0.0001 ** 残差 5.97 14 0.43 失拟项 3.21 10 0.32 0.47 0.8509 误差 2.76 4 0.69 综合 159.41 28 R2 0.9625 Radj2 0.9251 注：“*”表示差异显著（P<0.05）；“**”表示差异极显著（P<0.01）。 2.2.2 交互作用分析
图5显示，氢氧化钠浓度和时间，氢氧化钠浓度和液料比，温度和时间，温度和液料比，时间和液料比交互作用响应面曲面较陡，即氢氧化钠浓度和时间，氢氧化钠浓度和液料比，温度和时间，温度和液料比，时间和液料比交互作用显著。其余各因素对蛋白质提取率交互作用不显著，这与方差分析结果一致。
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图 5 各因素对蛋白质提取率交互作用的响应面Figure 5. Response surface of the interactive effects of each factor on protein extraction rate2.2.3 验证实验
以蛋白桑叶蛋白质提取率为指标，拟合出的最佳蛋白质提取工艺为氢氧化钠浓度0.125 mol/L、提取温度40.31 ℃、提取时间40.20 min和液料比36.70:1 mL/g。此实验条件下提取率为49.40%。为了便于操作，修整工艺参数为氢氧化钠浓度0.125 mol/L、提取温度40 ℃、提取时间40 min和液料比37:1 mL/g。在此优化条件下，得到蛋白质提取率实际值为49.59%±0.45%，与理论值基本一致。杨晶等[11]对不同浸提剂度桑叶蛋白质溶出率的影响进行比较，发现碱提有利于蛋白质溶出。李盼盼[38]对提取银杏蛋白进行研究，发现与常规碱溶酸提方法相比，超声辅助碱法的蛋白提取率提高了15.42%，可见超声波辅助提取可大大提高蛋白质的提取率。此外，本研究与邓翔等[39]所采取的微波辅助碱提取法提取桑叶蛋白比较（提取率为35.84%），蛋白质提取率也有所提高。综上所述，本研究采取超声辅助碱提法提取蛋白桑叶蛋白，在蛋白质提取率方面具有较大的优势，可为实际蛋白质提取提供依据。
2.3 蛋白桑叶蛋白等电点测定
由图6可知，经盐酸溶液酸沉后，离心得到上清液中蛋白质含量存在明显差异。随着pH增大，上清液中蛋白质浓度呈先下降后上升的趋势，在pH为3.5时达到最低值0.03 mg/mL。说明在此pH大部分蛋白质已变性沉淀，故选定pH为3.5时沉淀蛋白质。
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图 6 蛋白桑叶蛋白等电点的测定结果Figure 6. Isoelectric point determination of the protein mulberry leaf protein （PMLP）2.4 蛋白桑叶蛋白质功能特性测定
吸水性指蛋白质吸收并保留水分的能力，被保留的水是指结合水、流体动力学水和物理截留水的总和，吸油性指蛋白质对油的吸附能力。如表5所示，本蛋白桑叶蛋白吸水性为6.49±0.49 g/g，吸油性为2.59±0.06 g/g，略高于孙崇臻等[8]通过超声辅助水提酸沉法得到的桑叶清蛋白（吸水性为2.00±0.00 mL/g，吸油性为2.34±0.15 mL/g）。蛋白质乳化性即蛋白质维持例如油、水等两种及以上互不相溶的液体，经机械搅拌或添加乳化剂，形成乳浊液的功能，乳化稳定性即指蛋白质维持乳浊液状态的能力。本研究中，蛋白桑叶蛋白的乳化活性为7.40±0.17 m2/g，乳化稳定性为72.48%±3.03%，高于宁军权等[40]采用超声辅助碱提法得到的桑叶蛋白（乳化活性为4.0 m2/g，乳化稳定性为43.6%）。
表 5 蛋白桑叶蛋白功能特性（ˉx ±s，n=3）Table 5. Functional properties of the PMLP (ˉx ±s, n=3)性质 数值 吸水性（WHC，g/g） 6.49±0.49 吸油性（OAC，g/g） 2.59±0.06 乳化性（EAI，m2/g） 7.40±0.17 乳化稳定性（ESI，%） 72.48±3.03 本实验得到蛋白桑叶蛋白功能性质与前人研究有所差异，整体水平相对较高，这可能与桑叶品种、蛋白质种类及提取方法不同有关。此外，pH、离子强度、蔗糖浓度、温度等均对桑叶蛋白质功能特性有所影响。王芳等[14]发现通过超声辅助盐提法提取得到的桑叶蛋白，当pH远离桑叶蛋白等电点时，其吸水性、乳化性及乳化稳定性均有增强；当氯化钠浓度（浓度）升高，桑叶蛋白的持水性逐渐增强，但浓度过高则会导致桑叶蛋白的乳化性和乳化稳定性逐渐下降；蔗糖的加入会增加桑叶蛋白的持水性；一定温度范围（4~80 ℃）内，桑叶蛋白的吸油性与温度呈正相关。以上因素对蛋白桑叶蛋白质的功能特性的影响，仍可进一步考察。
2.5 桑叶蛋白的酶解及不同蛋白酶酶解产物体外降血糖活性检测
6种蛋白酶酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率随浓度变化的趋势图及IC50值如图7与表6所示。由图7可得，6种酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率均随浓度增加呈上升趋势，且在1.25~10 mg/mL范围内增长幅度较大，浓度超过10 mg/mL后趋于平缓。其中中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解物在浓度为5 mg/mL时抑制率超过50%，在浓度为20 mg/mL时抑制率分别达到90.38%及86.32%。结合表6分析，中性蛋白酶解物对α-葡萄糖苷酶抑能力高于木瓜蛋白酶酶解物。6种蛋白酶酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制能力的大小依次为：中性蛋白酶酶解物（IC50=3.52 mg/mL）>木瓜蛋白酶酶解物（IC50=4.64 mg/mL）>胰蛋白酶酶解物（IC50=5.65 mg/mL）>碱性蛋白酶酶解物（IC50=5.76 mg/mL）>风味蛋白酶酶解物（IC50=5.81 mg/mL）>复合蛋白酶酶解物（IC50=6.38 mg/mL）。以上6种蛋白桑叶蛋白酶解物均高于蜂王浆蛋白肽（IC50=6.94 mg /mL）[21]，其中中性蛋白酶酶解物及木瓜蛋白酶酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制能力高于辣木籽降糖肽（IC50=5.56 mg/mL）[22]。本实验就不同蛋白桑蛋白酶酶解产物体外α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，6种蛋白酶酶解物中，中性蛋白酶酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制能力最强，具有较好的研究潜力，为进一步在降血糖领域开发蛋白桑蛋白质及多肽资源提供了理论支持，后续可进一步对酶解工艺进行优化、分离纯化及体内活性评价，对糖尿病的防治具有重要意义。
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图 7 不同蛋白酶对蛋白桑叶蛋白酶解物α-葡萄糖苷酶抑制率影响Figure 7. Effect of different proteases on the rate of α-glucosidase inhibition of the PMLP enzymatic hydrolysates表 6 蛋白桑叶蛋白不同蛋白酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制能力比较Table 6. Comparison of α-glucosidase inhibition of different PMLP enzymatic hydrolysates样品 IC50（mg/mL） 阿卡波糖 0.283 复合蛋白酶酶解物 6.38 风味蛋白酶酶解物 5.81 碱性蛋白酶酶解物 5.76 胰蛋白酶酶解物 5.65 中性蛋白酶酶解物 3.52 木瓜蛋白酶酶解物 4.64 3. 结论
本研究选择通过超声辅助碱提酸沉法提取蛋白桑叶蛋白，探究、优化得到最佳工艺条件为：氢氧化钠浓度0.125 mol/L、提取温度40 ℃、提取时间40 min和液料比37:1 mL/g。在此优化条件下，得到蛋白质提取率实际值为49.59%±0.45%，所得蛋白等电点为pH=3.5，吸水性为6.49±0.49 g/g，吸油性为2.59±0.06 g/g，乳化活性为7.40±0.17 m2/g，乳化稳定性为72.48%±3.03%。通过进一步对蛋白桑叶蛋白的酶解及体外降血糖活性检测得出，不同蛋白酶酶解物的体外降血糖活性不同，其中中性蛋白酶酶解物对α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳，其IC50=3.52 mg/mL。本研究认为此蛋白桑叶蛋白质提取工艺稳定，可为实际蛋白质提取提供依据。功能特性方面，本研究中蛋白桑叶蛋白质自然状态下的吸水性、吸油性、乳化活性及乳化稳定性相对前人研究结果较优，在食品领域拥有较好的使用前景。关于蛋白桑叶降血糖活性肽的制备，本实验目前仅对蛋白酶的种类进行了考察，后续将以此条件为基础，进一步对中性蛋白酶酶解物酶解工艺进行优化，为蛋白桑叶蛋白质及多肽资源在降血糖等领域的进一步开发利用提供理论依据。
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图 5 各因素对蛋白质提取率交互作用的响应面
Figure 5. Response surface of the interactive effects of each factor on protein extraction rate
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图 6 蛋白桑叶蛋白等电点的测定结果
Figure 6. Isoelectric point determination of the protein mulberry leaf protein （PMLP）
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图 7 不同蛋白酶对蛋白桑叶蛋白酶解物α-葡萄糖苷酶抑制率影响
Figure 7. Effect of different proteases on the rate of α-glucosidase inhibition of the PMLP enzymatic hydrolysates
表 1 Box-Behnken试验设计因素和水平
Table 1 Box-Behnken trial design factors and levels
因素 水平 −1 0 1 A氢氧化钠浓度（mol/L） 0.1 0.125 0.15 B提取温度（℃） 40 45 50 C提取时间（min） 30 40 50 D液料比（mL/g） 30:1 40:1 50:1 
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酶种类 酶解温度（℃） pH 复合蛋白酶 55 8.0 风味蛋白酶 50 7.0 碱性蛋白酶 50 8.0 胰蛋白酶 37 8.0 中性蛋白酶 45 7.0 木瓜蛋白酶 55 6.5
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表 3 超声波辅助碱法提取蛋白桑叶蛋白质响应面试验设计方案与结果
Table 3 Design and results of ultrasound-aided alkaline extraction of protein mulberry leaf protein (PMLP) response surface test
实验号 A氢氧化钠
浓度B提取
温度C提取
时间D液料比 蛋白质
提取率（%）1 1 0 1 0 44.90±0.13 2 0 0 −1 1 42.43±0.29 3 −1 0 0 −1 45.94±1.01 4 −1 0 −1 0 44.90±0.26 5 −1 0 0 1 40.38±0.42 6 0 −1 1 0 48.09±0.28 7 0 −1 0 −1 47.63±1.40 8 1 1 0 0 45.99±0.75 9 0 1 1 0 44.45±0.55 10 0 0 0 0 48.18±1.25 11 0 1 0 −1 43.15±0.15 12 0 0 0 0 48.01±0.93 13 0 0 0 0 48.83±0.75 14 0 −1 0 1 43.24±0.81 15 0 0 1 −1 43.26±0.28 16 0 1 −1 0 47.84±1.35 17 −1 −1 0 0 47.12±0.51 18 1 −1 0 0 48.03±1.28 19 0 −1 −1 0 46.91±0.38 20 −1 1 0 0 43.35±0.64 21 1 0 0 −1 44.51±1.04 22 1 0 −1 0 48.44±1.22 23 0 0 1 1 43.20±1.15 24 −1 0 1 0 44.28±0.93 25 0 1 0 1 44.00±0.74 26 0 0 0 0 50.12±0.48 27 0 0 0 0 48.68±1.00 28 1 0 0 1 44.95±0.98 29 0 0 −1 −1 46.18±1.17
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表 4 超声波辅助碱法提取桑叶蛋白质响应面试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance of response surface test results of PMLP extraction by ultrasonic-assisted alkali method
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 153.44 14 10.96 25.69 <0.0001 ** A 9.81 1 9.81 23.00 0.0003 ** B 12.48 1 12.48 29.27 <0.0001 ** C 6.05 1 6.05 14.18 0.0021 ** D 12.96 1 12.96 30.38 <0.0001 ** AB 0.75 1 0.75 1.75 0.2066 AC 2.13 1 2.13 5.00 0.0422 * AD 9.00 1 9.00 21.10 0.0004 ** BC 5.22 1 5.22 12.24 0.0035 ** BD 6.86 1 6.86 16.09 0.0013 ** CD 3.40 1 3.40 7.98 0.0135 * A2 17.99 1 17.99 42.17 <0.0001 ** B2 4.04 1 4.04 9.47 0.0082 ** C2 12.79 1 12.79 29.98 <0.0001 ** D2 75.22 1 75.22 176.33 <0.0001 ** 残差 5.97 14 0.43 失拟项 3.21 10 0.32 0.47 0.8509 误差 2.76 4 0.69 综合 159.41 28 R2 0.9625 Radj2 0.9251 注：“*”表示差异显著（P<0.05）；“**”表示差异极显著（P<0.01）。
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表 5 蛋白桑叶蛋白功能特性（
ˉx ±s，n=3）Table 5 Functional properties of the PMLP (
ˉx ±s, n=3)性质 数值 吸水性（WHC，g/g） 6.49±0.49 吸油性（OAC，g/g） 2.59±0.06 乳化性（EAI，m2/g） 7.40±0.17 乳化稳定性（ESI，%） 72.48±3.03
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表 6 蛋白桑叶蛋白不同蛋白酶解产物对α-葡萄糖苷酶抑制能力比较
Table 6 Comparison of α-glucosidase inhibition of different PMLP enzymatic hydrolysates
样品 IC50（mg/mL） 阿卡波糖 0.283 复合蛋白酶酶解物 6.38 风味蛋白酶酶解物 5.81 碱性蛋白酶酶解物 5.76 胰蛋白酶酶解物 5.65 中性蛋白酶酶解物 3.52 木瓜蛋白酶酶解物 4.64
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