Response Surface and Particle Swarm-Artificial Neural Network Model Optimize the Microwave-assisted Extraction of Paeoniflorin
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摘要: 以赤芍（Paeoniae Radix Rubra）为原料，建立单因素-Box-Behnken试验，探究微波功率、提取时间、提取次数、乙醇浓度和液固比对赤芍总苷提取量的影响，并评价提取物的体外抗氧化活性。通过建立响应面模型和粒子群-人工神经网络模型对微波辅助提取赤芍总苷的工艺进行优化。结果表明：响应面模型和粒子群-人工神经网络模型的决定系数R2分别为0.9099和0.9925，表明粒子群-人工神经网络具有更好的预测能力。采用粒子群-人工神经网络模型优化提取工艺条件：乙醇浓度81%、液固比30 mL/g、提取时间22 s、提取5次、微波功率420 W，在此条件下，赤芍总苷的提取量为378.977±1.982 mg PE/g d.w.；赤芍苷提取物（100 μg/mL）对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分别为87.61%和80.74%，接近阳性对照。提取物还具有一定的还原能力。本研究结果为优化提取工艺提供了新的方法，也为赤芍有效成分作为添加剂的应用提供了理论基础。
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关键词:
- 赤芍总苷 /
- 微波辅助提取 /
- 响应面 /
- 粒子群-人工神经网络 /
- 体外抗氧化活性
Abstract: The effects of the following independent variables-micro intensity, extraction time, ethanol concentration, and solvent-to-solid ratio on the extraction yield of paeoniflorin from Paeoniae Radix Rubra were examined by single factor test and Box-Behnken design. The antioxidant activity in vitro of extractions was also assessed. Then, the paeoniflorin extraction process was optimized using the response surface methodology (RSM) and particle swarm optimization-artificial neural network (PSO-ANN). Results showed that the prediction and optimization performance of PSO-ANN was better than RSM, that with the correlation coefficient R2 was 0.9925 and 0.9099, respectively. The optimized extraction conditions by PSO-ANN were as follows: Ethanol concentration (81% v/v), solvent-to-solid ratio (30 mL/g), extraction time (22 s), extractions (5 times), and micro intensity (420 W). Under the optimized parameters, the extraction yield of paeoniflorin was 378.977±1.982 mg PE/g d.w.. The scavenging rates of paeoniflorin extract (100 μg/mL) on DPPH and ABTS+ free radicals were 87.61% and 80.74% respectively, that closed to the positive control. The extract also had a certain reduction ability. The results of this study provide a new method for optimizing the extraction process, as well as provide a theoretical basis for the application of effective components of Paeoniae Radix Rubra as additives. -
赤芍（Paeoniae Radix Rubra）是一种多年生草本植物，生长在海拔200~4000米处。根据中国药典2005年版，赤芍被定义为芍药的干燥根[1]，卫法监发[2002]51号文件中将赤芍列为可药食同源中草药。赤芍中含有丰富的皂苷和多糖等植物次级代谢产物、挥发性成分，是天然优质抗生素、抗氧化材料和食品添加剂的来源[2]，这些成分可以有效清除自由基，并具有一定的抑菌活性[3]。许多研究表明，富含皂苷的植物可以帮助对抗病原体和预防许多疾病[4-5]。赤芍中的芍药苷是一种单萜苷，是赤芍中研究最广泛的化合物[6]，在抵御植物病原体和避免食草动物的攻击等方面发挥着重要作用[7]，可溶于乙醇和其他极性溶剂[8]。已有的研究表明，芍药苷具有抗炎活性[9]（如治疗类风湿性关节炎、银屑病和哮喘）、抗帕金森[10]、改善骨质疏松[11]、减轻大鼠非酒精性脂肪性肝炎[12]等效用，并能作为一种抗氧化和抗凋亡剂降低毛细胞的耳毒性[13]。
提取植物有效成分并对其进行定量和定性分析都受到溶剂类型和提取方法的影响[14]，一般来说，不同材料中活性成分的萃取效率受到液固比、提取温度、提取时间等多种因素的影响[15]。近年来对总苷类物质常用的提取方法包括超声辅助提取法、索氏提取法、浸渍法、微波辅助提取法、回流提取法和加速溶剂提取法等。其中，微波辅助提取可以高速地从植物材料中提取活性物质，减小了设备的尺寸，有效地提高了提取率，并在一定程度上降低了热梯度，减少热分解。作为一种统计方法，响应面法可以对试验进行设计、建立模型和二次方程来评估自变量的影响，迄今为止，响应面法已经广泛应用于各种领域，对试验进行预测和优化[16-17]。与响应面法不同的是，人工神经网络是一种非线性计算建模的方法，通过模拟生物神经结构，允许系统自我学习和训练，在不了解特定数学模型的情况下解决实际问题[18-19]。人工神经网络作为一种优于响应面法的模型，已经广泛用于优化生物活性成分提取工艺中。已有的研究表明人工神经网络相比响应面法集成可减少70%[20]，并利用了响应面试验数据的人工神经网络模型优化了重金属的气凝胶吸附和天然产物的提取[20-21]。
现有的研究中，将人工神经网络应用于赤芍有效成分提取的研究较少。中草药有效成分的提取一直是近年来研究的热点[22]，赤芍自2002年被列进可药食同源中药名录以来，对赤芍研究仍仅限于药理药性，在食品应用方面鲜有研究。本研究将综合利用响应面法和粒子群人工神经网络模型对微波辅助提取赤芍中赤芍总苷的提取量进行建模优化，基于试验结果和误差分析，比较两种模型的优化能力；通过体外活性试验测定了提取物对自由基的清除能力及总还原能力，并以芍药苷标准品和阳性对照对结果进行评价。本文提出了新的模型优化赤芍有效成分提取工艺，并对赤芍提取物的体外活性进行了评价，为赤芍提取物作为添加剂使用在食品工业及其他轻工业领域中提供了前期理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
赤芍 产于黑龙江省大兴安岭地区呼玛县农业科技产业园区；芍药苷标准品（B21148） 上海源叶生物科技有限公司；抗坏血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（618Q034）、α-葡萄糖苷酶（0.5 Units/mL）、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、对硝基苯酚（PNP） 美国Sigma试剂公司；无水乙醇、浓硫酸、苯酚等 哈尔滨理工科技有限公司。
PH-140A型恒温热风干燥箱 上海一恒仪器有限公司；YP-20002 电子天平 上海越平科学仪器有限公司；G70D20CN1P-D2（S0）型微波炉 格兰仕微波生活电器有限公司；INFINITE M200 PRO酶标仪 美国MoLecular Devices公司；5430R型高速离心机 Edenff中国有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒仪器有限公司；岛津8400s傅里叶红外光谱仪 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
赤芍采摘后，清洗干净，在恒温干燥箱中50~55 ℃温度条件下干燥48 h[23]。干燥后的样品经切片、粉碎、过80目筛后，密封，在阴凉干燥处室温保存。
1.2.2 微波辅助提取赤芍苷工艺的优化
1.2.2.1 赤芍苷提取工艺流程
赤芍粉末→乙醇水溶液浸泡→微波处理→抽滤，得赤芍总苷提取液→冷冻干燥→赤芍总苷粉末
1.2.2.2 单因素实验
准确称量赤芍粉末1.00 g，加入乙醇水溶液，室温浸泡30 min后进行间歇性微波辅助提取，提取结束后测定提取液中赤芍总苷的含量。为了确定微波辅助提取的参数范围，研究乙醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%，固定条件为：微波功率490 W、提取4次、提取时间20 s、液固比：30 mL/g）、微波功率（350、420、490、560、630、700 W，固定条件为：乙醇浓度80%、提取4次、提取时间20 s、液固比30 mL/g）、提取次数（2、3、4、5、6，固定条件为：乙醇浓度80%、微波功率420 W、提取时间20 s、液固比30 mL/g）、提取时间（10、15、20、25、30 s，固定条件为：乙醇浓度80%、微波功率420 W、提取5次、液固比30 mL/g）、液固比（10、20、30、40、50 mL/g，固定条件为：乙醇浓度80%、微波功率420 W、提取5次、提取20 s）对赤芍总苷提取量的影响，对以上五种因素进行控制变量实验。
1.2.2.3 响应面法优化微波辅助提取工艺
通过单因素实验的最佳结果进行响应面试验设计（见表1），以赤芍总苷提取量为响应值，建立三因素三水平试验研究提取时间、乙醇浓度和液固比的影响。实验设计采用Design Expert 8.0.6，并将响应变量拟合为二次多项式模型。
表 1 Box-Behnken设计试验因素及编码水平Table 1. Box-Behnken design the test factors and the coding level水平 因素 A
乙醇浓度（%）B
液固比（mL/g）C
提取时间（s）−1 70 10 15 0 80 20 20 1 90 30 25 1.2.2.4 神经网络模型的构建
本研究采用包含输入层、隐藏层和输出层的3层人工神经网络模型[24]。选取乙醇浓度、提取时间和液固比3个变量作为网络的输入层节点，并将其归一化。归一化公式如下：
Dni=2×Di−DminDmax−Dmin−Dmin (1) 式中：Di为训练样本中的第i个输入；Dni是Di的归一化结果；Dmax是训练样本中输入的最大值；Dmin是训练样本中输入的最小值。归一化后，所有的数据被处理到−1~1之间，这种分布的数据更适合神经网络处理。把赤芍总苷的提取量作为输出层节点Y，各个神经元节点处的激活函数为Relu。隐藏层的节点数由经验公式[25]计算可得：
p=√n+q+m (2) 式中：p为隐藏层的神经元数量；n为输入层神经元数量；q为输入层神经元数量；m一般取1~10之间的数，本实验中m取7。人工神经网络模型结构如图1所示。
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图 1 微波提取赤芍总苷的粒子群-神经网络模型Figure 1. Particle swarm optimization-artificial neural network of microwave extract of paeoniflorin一般地，使用平均绝对误差（Mean Absolute Error，MAE），均方根误差（Root Mean Square Error，RMSE）和决定系数（R2）作为模型的评价标准。MAE、RMSE和R2的计算公式如下：
MAE=1nn∑i=1|Ytruth−Ypredict| (3) RMSE=√1nn∑i=1(Ytruth−Ypredict)2 (4) R2=n∑i=1(Ypredict−ˉY)2n∑i=1(Yi−ˉY)2 (5) 式中：n是训练样本的个数；Ytruth为第i次训练中赤芍总苷提取量的真实值；Ypredict为第i次训练中网络模型对赤芍总苷提取量的预测值；¯Y是训练样本中所有赤芍总苷提取量真实值的平均值。采用留出法划分训练集和测试集，即随机地选择数据把数据集划分出两个互斥的集合，训练集和测试集的比例为5:1。
1.2.2.5 粒子群算法优化工艺参数
粒子群优化算法（Particle Swarm Optimization，PSO）是一种有效的全局寻优算法，通过粒子个体间的协作与竞争，实现在复杂空间内搜索最优解[26]。在神经网络训练完成后，用实验数据对该网络进行模拟优化仿真，将人工神经网络模型和粒子群优化算法结合进行仿真实验，优化提取赤芍总苷的工艺参数。使用Python语言构建粒子群算法的运行环境，设初始粒子数pop为500，最大迭代次数为500，惯性因子w为0.9，个人学习因子C1和社会学习因子C2均为2，适应度函数为1.2.2.4中训练好的人工神经网络模型。
1.2.3 赤芍总苷提取量测定
本研究采用香草醛-冰醋酸法[27]测定赤芍总苷的提取量。取2 µL提取液于试管中，70 ℃蒸发乙醇溶剂，然后加入0.2 mL 5%（w/w）香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，混合均匀，在60 ℃水浴中处理15 min，加热结束后再转入冰浴处理5 min，冰浴结束后加入5 mL冰醋酸，混合均匀后在波长560 nm处测定吸光值。制备不同浓度标准品溶液重复上述步骤，得芍药苷标准曲线y=5.6659x−0.0005（R2=0.9992）。按公式（6）计算总赤芍总苷提取量，结果以芍药苷当量（PE）的干重（mg PE/g d.w.）表示。
X(mg\;PE/g\;d.w.)=(A+0.0005)×N×V5.6659×m (6) 式中：X为样品中赤芍总苷提取量（mg PE/g d.w.）；A为显色反应后的吸光值；N为稀释倍数；V为提取液体积（mL）；m为原料样品质量（g）。
1.2.4 傅里叶红外光谱分析
赤芍总苷红外分析采用KBr压片法，准确称取样品1.0 mg，干燥的KBr 150.0 mg，研磨混合均匀，在压片机上用5~10×104 kPa压力压成透明薄片，用KBr片做空白。利用傅里叶红外光谱仪进行扫描，测定样品的红外透过率，扫描范围：400~4000 cm−1，分辨率：4 cm−1，扫描次数：30。
1.2.5 赤芍苷体外活性分析
1.2.5.1 对DPPH自由基的清除能力
检测对DPPH自由基清除能力是评价抗氧化活性的标准测量方法[28]。将100 μL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液与100 μL不同浓度的赤芍苷溶液混合，在37 ℃黑暗中保存30 min[29]。DPPH乙醇溶液在还原反应中由紫色变为黄色。反应结束后在517 nm处测定吸光度。以抗坏血酸作为阳性对照。清除DPPH自由基的活性计算如下：
抑制率(%)=(1−At−AiA0)×100 (7) 式中：At为样品的吸光度值；A0为乙醇代替样品的吸光度值；Ai为空白样品的吸光度值。
1.2.5.2 对ABTS+自由基的清除能力
ABTS+自由基的清除能力采用Rafaila等的方法进行[30]。将7 mmol/L的ABTS-乙醇溶液与等体积的2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，将混合物置于30 °C暗处中，静置16 h产生ABTS自由基；静置结束后用无水乙醇稀释ABTS母液，要求稀释之后的溶液在734 nm处的吸光度为0.70±0.02。将稀释后的ABTS母液和样品溶液以比例为10:3加入48孔板中，混合溶液在30 °C暗处反应30 min，记录在734 nm条件下的吸光值。以抗坏血酸作为阳性对照。清除ABTS+自由基的活性计算如下：
抑制率(%)=(1−AiA0)×100 (8) 式中：Ai为样品的吸光度值；A0为乙醇代替样品的吸光度值。
1.2.5.3 总还原能力
采用铁氰化钾还原法对样品的总还原能力进行了评价。将PBS（0.2 mol/L pH6.6）、样品和1%的铁氰化钾溶液以体积比1:1:1加入到试管中，充分混合后置于50 ℃水浴锅中反应20 min；冷却后，加入2 mL 10%三氯乙酸，混合均匀，取100 μL上清液于48孔板中，加入400 μL去离子水和50 μL 0.1%三氯化铁溶液，在黑暗中保存30 min。反应结束后在700 nm处测定吸光值，吸光值越高，还原率越高。以抗坏血酸为阳性对照。
1.3 数据处理
所有试验均进行三次，结果用平均值±标准差表示；响应面试验设计和数据分析采用Design Expert 8.0.6进行；用Python语言构建神经网络；使用软件SPSS 22中单因素方差分析方法对数据进行95%置信区间的相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 微波辅助提取赤芍总苷工艺的优化
2.1.1 单因素条件对提取过程的影响
2.1.1.1 乙醇浓度对赤芍总苷提取量的影响
选择适当的萃取溶剂对目标化合物的萃取效率有非常显著的影响。皂苷在甲醇和乙醇[31-32]中都有较好的溶解性，考虑到环境影响和甲醇的性质，优先选用乙醇作为提取溶剂。乙醇浓度对赤芍总苷的影响结果如图2（a）所示，赤芍总苷在乙醇浓度为80%时达到最大值（371.96 mg PE/g d.w.）。当乙醇浓度从60%增加到80%时，赤芍总苷提取量随之增加；乙醇浓度在高于80%后，提取量开始下降。出现这种情况可能因萜苷类物质极性较大，属于亲水性物质[33]，随着乙醇浓度的增加，溶剂的极性下降，根据相似相容原理，溶剂极性降低，萜苷类物质溶出量下降。
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图 2 提取工艺各因素对赤芍总苷提取量的影响注：a：乙醇浓度；b：微波功率；c：提取次数；d：提取时间；e：液固比。Figure 2. Influence of various factors of the extraction process on the extraction amount of paeoniflorin2.1.1.2 微波功率对赤芍总苷提取量的影响
为了验证微波对提取过程的影响，通过试验研究了不同微波功率下的提取量，结果如图2（b）所示，随着功率从350 W增加到700 W，提取量先升高后下降，在420 W时有最高点；功率超过420 W后，随着功率的增加，提取量降低，可能的原因是细胞破坏率和传质速率增加，导致有效成分被分解，产率下降[34]。
2.1.1.3 提取次数和提取时间对赤芍总苷提取量的影响
由图2（c、d）所示，随着萃取时间从10 s增加到20 s，萃取次数从2次增加到5次，赤芍总苷的提取量明显增加。随着提取时间和提取次数的进一步增加，提取量下降，可能由于提取时间过长，有效成分被分解，提取量降低[35]。提取时间与微波释放量有关，时间越长，微波释放量越多，影响提取结果，微波间歇提取有益于缓解连续微波处理对目标提取物分解的影响[35]。
2.1.1.4 液固比对赤芍总苷提取量的影响
液固比对赤芍总苷提取量的影响如图2（e）所示。在液固比从10 mL/g提高到20 mL/g时，提取量达到最高点，液固比超过20 mL/g时提取量并不会增加，反而有所降低，出现这种情况可能是因为在有效成分提取过程中，较高的溶剂体积需要更多乙醇和水的含量，导致溶剂中吸收更多的微波能量，因为水的介电特性，溶剂越多，吸收的微波热量更多，也可能导致目标化合物受热分解，从而降低产量[36]。
2.1.2 响应面模型试验结果
2.1.2.1 响应面模型建立与分析
基于单因素实验结果，在微波功率为420 W及提取次数5次的条件下，对微波提取赤芍总苷工艺进行优化，通过Box-Behnken 8.0.6进行试验设计、数据处理及拟合性分析。
通过Box-Behnken设计，共得到17组试验，每组试验设计及试验结果如表2所示。
表 2 Box–Behnken试验编码变量及结果Table 2. Box–Behnken design coded variables and measured values试验号 A 乙醇浓度 B 液固比 C 提取时间 Y 赤芍总苷提取量
（mg PE/g d.w.）1 −1 −1 0 331.409±4.500 2 1 −1 0 363.971±6.281 3 −1 1 0 346.117±2.598 4 1 1 0 359.247±4.999 5 −1 0 −1 344.897±6.949 6 1 0 −1 348.645±3.807 7 −1 0 1 354.263±5.871 8 1 0 1 366.865±2.584 9 0 −1 −1 359.962±4.312 10 0 1 −1 358.775±2.542 11 0 −1 1 356.735±4.110 12 0 1 1 369.483±5.146 13 0 0 0 369.654±6.580 14 0 0 0 372.101±6.799 15 0 0 0 370.654±3.718 16 0 0 0 373.378±2.984 17 0 0 0 365.825±2.133 通过对表2中的试验结果和表1中的因素对应水平进行多元回归拟合得到乙醇浓度（A）、液固比（B）、提取时间（C）的回归方程：
Y=370.32+7.76A+2.69B+4.38C−4.86AB+2.21AC+3.48BC−13.85A2−6.28B2−2.80C2
回归模型方差分析如表3所示。从F值和图3可以推断，各因素对总赤芍总苷提取量的影响为A（乙醇浓度）>C（提取时间）>B（液固比）。相关系数（R2）值为0.9099，表明该模型具有显著性（P<0.05）；CV值（1.46%）说明实测值具有良好的可靠性和较高的精度；“失拟项P值”为0.0531>0.05，失拟项不显著，说明方程拟合充分，可以较好地表示各个因素与响应值之间的关系。
表 3 回归模型方差分析Table 3. Analysis of variance of regression model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 1936.21 9 215.13 7.85 0.0064** A-乙醇浓度 481.15 1 481.15 17.57 0.0041** B-液固比 58.02 1 58.02 2.12 0.1889 C-提取时间 153.71 1 153.71 5.61 0.0497* AB 94.4 1 94.4 3.45 0.1058 AC 19.6 1 19.6 0.72 0.4256 BC 48.55 1 48.55 1.77 0.2248 A2 808.12 1 808.12 29.5 0.0010** B2 166.19 1 166.19 6.07 0.0433* C2 33.04 1 33.04 1.21 0.3084 残差 191.74 7 27.39 失拟项 158.46 3 52.82 6.35 0.0531 纯误差 33.28 4 8.32 综合 2127.95 16 注：**表示为极其显著（P<0.01），*表示为显著（P<0.05）。 ![]()
图 3 各因素对赤芍苷提取量的交互作用Figure 3. Interactions of various factors on the extraction amount of paeoniflorin2.1.2.2 响应面验证试验
根据Design Expert 8.0.6软件计算出赤芍总苷提取量的最佳条件为乙醇浓度（v/v）82.94%、液固比23.78 mL/g、提取时间25 s、微波功率420 W、提取5次，在此条件下得到的赤芍总苷提取量预测值为374.535 mg PE/g d.w.。根据实际情况选择工艺条件为：乙醇浓度（v/v）83%、液固比24 mL/g、提取时间25 s、微波功率420 W、提取5次，在此条件下得到赤芍总苷提取量为370.231±2.725 mg PE/g d.w.，与预测值接近，表明建立响应面模型可以很好地预测赤芍总苷提取工艺。
2.1.3 粒子群-人工神经网络模型试验
2.1.3.1 人工神经网络构建的结果与分析
本研究使用Python语言和Scikit-learn机器学习工具构建人工神经网络。Scikit-learn中的MLPRegressor方法建立神经网络回归算法，隐藏层节点设置为9个，最大迭代次数为500，损失函数为平方误差（Square Error，SE），正则化系数α为0.0002，优化方法为L-BFGS（Limited Memory BFGS）[25]。
由图4可以看出，在测试集中神经网络的预测值和真实值基本吻合，训练集中R2为0.9999，测试集中R2为0.8534，全体数据集中R2为0.9852。表明本实验构建的神经网络的预测性能良好，可以作为优化赤芍总苷提取工艺参数的可靠依据。
2.1.3.2 使用粒子群算法计算最优提取工艺
设响应面中的数据作为原始数据，人工神经网络作为适应度函数，以赤芍总苷的提取量作为算法的输出，结合粒子群优化算法和人工神经网络对提取工艺参数进行全局寻优，找到最优的提取工艺参数。
由图5可知，迭代次数达到140次后最大提取值开始平稳。经过粒子群算法得到的最优工艺参数为：赤芍总苷的预计提取量为380.067 mg PE/g d.w.，提取时间为22.35 s，液固比30 mL/g，乙醇浓度为80.76%，微波功率420 W，提取次数5次。考虑方便实际操作过程，选择最佳工艺为提取时间22 s，液固比30 mL/g，乙醇浓度为81%，微波功率420 W，提取次数5次。在最佳工艺下重复实验3次，取平均值得到赤芍总苷提取量为378.977±1.982 mg PE/g d.w.，预测值和实验值相差0.287%，比响应面方法高出24.957%，更加准确。
2.1.3.3 对比粒子群-人工神经网络和响应面方法的预测结果
对比响应面方法和粒子群-人工神经网络方法的工艺参数结果。根据公式（3）~（5），计算两种方法的MAE，RMSE和R2，结果如表4所示。
表 4 预测结果的比较Table 4. Comparison of the predicted results模型 MAE RMSE R2 响应面 2.9244 11.09685441 0.9099 粒子群+人工神经网络 0.5234 10.64600003 0.9925 由表4和图6可知，神经网络方法的MAE和RMSE均小于响应面的MAE和RMSE，并且人工神经网络的R2比响应面法的R2更接近于1，表明人工神经网络模型对结果的预测比响应面模型具有更高的精度。
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图 6 赤芍总苷提取量的真实值和预测值的对比注：a：响应面预测值；b：神经网络预测值。Figure 6. Comparison of true value and predicted value of saponin extraction2.1.3.4 对比粒子群-人工神经网络和响应面方法的优化结果
两种模型优化提取工艺的比较表5所示，对比粒子群人工神经网络方法和响应面的优化工艺参数，粒子群-人工神经网络方法相比响应面方法有着更小的相对误差，证明粒子群-人工神经网络方法的结果更加准确，结果更可信，该方法可以为提取赤芍总苷工艺参数的确定提供方法参考。
表 5 优化结果的比较Table 5. Comparison of the optimization results优化方法 乙醇浓度（%） 液固比（mL/g） 萃取时间（s） 提取次数 微波功率（W） 赤芍总苷提取量预测值（mg PE/g d.w.） 相对误差 响应面 83 24 25 5 420 374.535 1.15% 粒子群-人工神经网络 81 30 22 5 420 380.067 0.29% 2.2 傅里叶红外光谱分析
为了鉴定提取的赤芍总苷，对芍药苷标准品和赤芍总苷进行傅里叶红外光谱分析，结果如图7所示。提取赤芍总苷样品与芍药苷标准品比较，二者有相近的吸收峰。3300~3393 cm−1处的峰是典型O-H的伸缩振动峰[37]，2858~2927 cm−1和1278 cm−1处的峰是典型的C-H的伸缩振动峰，1701~1737 cm−1处的峰是典型C=O的振动吸收峰[37]，1460~1467 cm−1处的峰是典型的COOH或CH=O的振动吸收峰，1074~1172 cm−1的峰是典型的C-O和C-O-C的伸缩振动峰，712 cm−1处的峰是典型的芳香环上的C-H平面振动峰[37]。从图中可以看出，提取样品芳香环的特征峰不明显，其原因可能是受到提取时的微波功率等条件影响被热解[37]。
2.3 赤芍总苷体外抗氧化活性分析
2.3.1 对自由基的清除能力
通过常见的抗氧化实验评价赤芍总苷在20~100 μg/mL浓度范围内的抗氧化能力，标准品和样品对DPPH和ABTS+自由基的清除能力分别如图8（a）和图8（b）所示。结果表明，标准品、样品和阳性对照对DPPH自由基的清除能力呈现浓度依赖性。标准品、样品和阳性对照在20~100 μg/mL浓度范围内对ABTS+自由基的抑制能力也具有相同的趋势。结果表明，赤芍中的赤芍总苷提取物对自由基有抑制作用。
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图 8 赤芍总苷体外抗氧化活性试验结果注：a：对DPPH自由基的清除能力；b：对ABTS+自由基的清除能力；c：总还原能力。Figure 8. Results of in vitro antioxidant activity of paeoniflorin对DPPH自由基清除试验中，标准品和样品相比，在100 μg/mL浓度下，样品抑制率较高（87.61%），接近于阳性对照（94.63%），标准品抑制率为80.52%；标准品、样品和抗坏血酸的IC50分别为：38.03、11.16和4.01 μg/mL，对DPPH自由基的清除能力排序为抗坏血酸>样品>标准品。
对ABTS+自由基清除试验中，标准品、样品和抗坏血酸的IC50分别为155.26、70.46和10.77 μg/mL，对ABTS+自由基清除能力排序为抗坏血酸>样品>标准品。在浓度为20 μg/mL时，样品对ABTS+自由基的清除能力明显低于抗坏血酸；在最高浓度为100 μg/mL时，样品组对ABTS+自由基的清除能力接近抗坏血酸，符合实验预期。
现有的研究表明赤芍总苷对DPPH、ABTS+自由基的半抑制率分别为10.08 μg/mL、5.67 μg/mL[38]，较本研究结果高，这可能是由于研究赤芍品种和来源不同，植物有效成分会受到多种因素的影响，比如物种、生长区域、种植模式和药材制备等[39]。
2.3.2 总还原能力分析
采用铁氰化钾还原法对赤芍总苷总还原能力进行了评价。反应体系中的Fe3+被还原为Fe2+，在700 nm处有吸收峰，因此反应溶液在700 nm波长处吸收率可以代表Fe2+的浓度，间接代表还原能力。
总还原能力结果如图8（c）所示。在试验浓度最大时，样品与标准品之间的差异不大，抗坏血酸在最大浓度（1000 μg/mL）下的总还原能力为样品的1.8倍，所有实验组的吸光值均呈现浓度依赖性，相同浓度下的三个实验组的总还原能力排序为抗坏血酸>标准品>样品。与阳性对照相比，样品的总还原能力要弱得多。
体外抗氧化活性试验结果表明，样品组的结果略高于标准品，可能是由于存在内源性协同效应，样品中含有少量的多糖[1]和多酚物质（15.224 mg/g）。
3. 结论
本研究通过响应面法和粒子群-人工神经网络模型建立了赤芍总苷的最佳微波提取条件，两种模型在本试验中都展现了足够的可靠性，相比之下，粒子群-人工神经网络模型中对赤芍总苷提取量的预测相对误差较小，决定系数更高，能更有效的优化提取工艺参数，最佳工艺提取条件：乙醇浓度81%、液固比30 mL/g、提取时间22 s、提取5次、微波功率420 W，在此条件下得到赤芍总苷提取量为378.977±1.982 mg PE/g d.w.。通过对DPPH、ABTS+自由基和总还原能力体外抗氧化活性测定，证实了赤芍总苷具有一定的抗氧化活性，但可能因本研究使用的原材料生长地点或品种等因素，致使本研究的赤芍总苷抗氧化性能低于已有的研究结果，此部分还需进一步研究证实。
总的来说，粒子群-人工神经网络是一种高效的优化和预测提取工艺的数学模型。本研究提出的赤芍总苷的抗氧化性为下一步以赤芍总苷作为可食用包装膜添加剂的研究提供了理论基础。
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图 1 微波提取赤芍总苷的粒子群-神经网络模型
Figure 1. Particle swarm optimization-artificial neural network of microwave extract of paeoniflorin
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图 2 提取工艺各因素对赤芍总苷提取量的影响
注：a：乙醇浓度；b：微波功率；c：提取次数；d：提取时间；e：液固比。
Figure 2. Influence of various factors of the extraction process on the extraction amount of paeoniflorin
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图 3 各因素对赤芍苷提取量的交互作用
Figure 3. Interactions of various factors on the extraction amount of paeoniflorin
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图 6 赤芍总苷提取量的真实值和预测值的对比
注：a：响应面预测值；b：神经网络预测值。
Figure 6. Comparison of true value and predicted value of saponin extraction
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图 8 赤芍总苷体外抗氧化活性试验结果
注：a：对DPPH自由基的清除能力；b：对ABTS+自由基的清除能力；c：总还原能力。
Figure 8. Results of in vitro antioxidant activity of paeoniflorin
表 1 Box-Behnken设计试验因素及编码水平
Table 1 Box-Behnken design the test factors and the coding level
水平 因素 A
乙醇浓度（%）B
液固比（mL/g）C
提取时间（s）−1 70 10 15 0 80 20 20 1 90 30 25 
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表 2 Box–Behnken试验编码变量及结果
Table 2 Box–Behnken design coded variables and measured values
试验号 A 乙醇浓度 B 液固比 C 提取时间 Y 赤芍总苷提取量
（mg PE/g d.w.）1 −1 −1 0 331.409±4.500 2 1 −1 0 363.971±6.281 3 −1 1 0 346.117±2.598 4 1 1 0 359.247±4.999 5 −1 0 −1 344.897±6.949 6 1 0 −1 348.645±3.807 7 −1 0 1 354.263±5.871 8 1 0 1 366.865±2.584 9 0 −1 −1 359.962±4.312 10 0 1 −1 358.775±2.542 11 0 −1 1 356.735±4.110 12 0 1 1 369.483±5.146 13 0 0 0 369.654±6.580 14 0 0 0 372.101±6.799 15 0 0 0 370.654±3.718 16 0 0 0 373.378±2.984 17 0 0 0 365.825±2.133
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表 3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 1936.21 9 215.13 7.85 0.0064** A-乙醇浓度 481.15 1 481.15 17.57 0.0041** B-液固比 58.02 1 58.02 2.12 0.1889 C-提取时间 153.71 1 153.71 5.61 0.0497* AB 94.4 1 94.4 3.45 0.1058 AC 19.6 1 19.6 0.72 0.4256 BC 48.55 1 48.55 1.77 0.2248 A2 808.12 1 808.12 29.5 0.0010** B2 166.19 1 166.19 6.07 0.0433* C2 33.04 1 33.04 1.21 0.3084 残差 191.74 7 27.39 失拟项 158.46 3 52.82 6.35 0.0531 纯误差 33.28 4 8.32 综合 2127.95 16 注：**表示为极其显著（P<0.01），*表示为显著（P<0.05）。
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表 4 预测结果的比较
Table 4 Comparison of the predicted results
模型 MAE RMSE R2 响应面 2.9244 11.09685441 0.9099 粒子群+人工神经网络 0.5234 10.64600003 0.9925
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表 5 优化结果的比较
Table 5 Comparison of the optimization results
优化方法 乙醇浓度（%） 液固比（mL/g） 萃取时间（s） 提取次数 微波功率（W） 赤芍总苷提取量预测值（mg PE/g d.w.） 相对误差 响应面 83 24 25 5 420 374.535 1.15% 粒子群-人工神经网络 81 30 22 5 420 380.067 0.29%
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