Effect of Oxygen Concentration in Fermentation on Black Tea Quality and Optimization of Oxygen-enriched Fermentation Process
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摘要: 发酵是红茶品质形成的关键工序，氧是影响发酵的关键因素，解析氧对红茶品质及内含成分的影响具有重要意义。以一芽二叶的‘龙井43’品种为原料，进行低氧发酵（5%），自然发酵（21%）和富氧发酵（36%）处理，通过感官审评结合气相色谱-质谱技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和超高效液相色谱-质谱技术（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）分析了氧浓度对红茶感官品质、非挥发性代谢物和挥发性代谢物的影响，并通过单因素结合响应面试验优化了红茶富氧发酵工艺。结果表明：相比自然发酵，富氧发酵可以显著改善红茶滋味和香气品质（P<0.05）；富氧发酵中关键滋味化合物儿茶素及没食子酸含量显著下降（P<0.05），茶黄素总量及单体含量显著增加（P<0.05），游离氨基酸含量无显著变化（P>0.05）；不同氧浓度发酵中共25种挥发性化合物存在显著差异，包括12种醛类，2种酮类，3种醇类，3种烯类，5种酯类，大部分差异化合物含量随氧浓度升高而增加；红茶富氧发酵优化工艺为：氧气浓度40%、通氧时间1.5 h、发酵时间4 h，优化工艺红茶的茶黄素总量、TF、TF3G、TF3'G和TFDG含量分别为2.86%、0.25%、1.71%、0.24%和0.68%。该研究结果为指导红茶加工和品质调控提供了重要依据。Abstract: Fermentation is a critical process of black tea quality formation and oxygen is the key factor affecting the fermentation, so it is important to analyze the effect of oxygen in fermentation on the quality and metabolites of black tea. One bud and two leaves of 'Longjing 43' tea varieties were used as materials for low oxygen fermentation (5%) , natural fermentation (21%) and oxygen-enriched fermentation (36%) treatments, and the effects of oxygen concentration on sensory quality, non-volatile and volatile metabolites of black tea were analyzed by sensory evaluation combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS), and the parameters of oxygen-enriched fermentation of black tea were optimized by single factor combined with response surface analysis. Results showed that oxygen-enriched fermentation could significantly improve the taste and aroma quality of black tea compared with nature fermentation (P<0.05). Compared with natural fermentation, the content of key taste compounds catechins and gallic acid (GA) decreased significantly (P<0.05), total theaflavins (TFs) and its monomer increased significantly (P<0.05), and amino acids did not change significantly (P>0.05) in oxygen-enriched fermentation. A total of 25 volatile compounds differed significantly in three treatments, including 12 aldehydes, 2 ketones, 3 alcohols, 3 alkenes, and 5 esters, and the content of most differing compounds increased with increasing oxygen concentration. The optimized parameters of oxygen-enriched black tea were: Oxygen concentration of 40%, oxygenation time of 1.5 h, fermentation time of 4 h. And the contents of TFs, TF, TF3G, TF3'G and TFDG of black tea were 2.86%, 0.25%, 1.71%, 0.24% and 0.68%, respectively. The results of this study would provide an important basis for guiding black tea processing and quality control.
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Keywords:
- black tea /
- fermentation /
- oxygen /
- sensory quality /
- metabolites
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红茶是世界上生产和消费量最大的茶叶，约占世界茶叶生产和消费总量的80%，以其醇厚浓甜的滋味和高爽的香气特点深受消费者喜爱[1-3]。发酵是红茶加工的关键工序，对红茶汤色、香气和滋味品质形成起重要作用。红茶发酵的实质是内源氧化酶与多酚类化合物充分接触，在氧气的参与下，发生酶促氧化聚合、缩合等反应，形成茶黄素、茶红素等水溶性氧化产物，并伴随着芳香物质、氨基酸、糖类、蛋白质等品质成分的剧烈变化，最终形成红茶特有的色、香、味[4-6]。发酵工艺参数如温度、相对湿度、pH、供氧状况等均会影响红茶品质[7-10]。氧气作为氧化反应的底物对红茶品质特征形成必然存在较大影响，因此研究发酵过程中氧对红茶品质形成及代谢物变化的影响对指导红茶生产加工、品质调控具有重要意义。
氧化反应是红茶发酵的主要反应。茶叶中的儿茶素在发酵过程中被多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）氧化成各种氧化产物，如茶黄素（theaflavins，TFs）、聚酯型儿茶素（theasinesins，TSs）、茶红素（thearubigins，TRs）和茶褐素（thearubigins，TBs）等[11-13]，TFs和TRs通常被认为是红茶的特征成分。发酵过程中氨基酸含量呈现出先增加后减少的趋势，发酵前期因蛋白质分解导致氨基酸含量不断增加[14]，延长发酵时间，氨基酸除自身偶联氧化外，可通过脱氨及脱羧作用形成苯乙醇、苯乙醛等芳香物质[15-16]。红茶发酵过程可形成醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、内酯、酚酸类等400余种芳香物质[17]。随着红茶发酵进行，醇类、醛类、酮类等含量上升，而酸类、酯类、酚类等含量逐渐减少，因此发酵叶青草气散失，并伴随浓郁的果甜花香产生[18-21]。因此，解析氧气参与的氧化反应对茶多酚、茶色素、氨基酸以及挥发性物质含量的影响可分析发酵中氧对红茶品质的贡献。
红茶加工一般采用自然发酵，主要是利用空气中自然存在的氧（21%）进行发酵，且当通风条件较差时，随着氧气的消耗，氧浓度会下降至20%。一般当红茶发酵中氧浓度高于21%时，可认为是富氧发酵。红茶发酵过程中采取间歇供氧方式制得的红茶叶底红亮，可提升香气品质[22]。发酵中通氧时间对挥发性化合物存在影响，成品茶中醇类、醛类、酮类均随着发酵中通氧时间延长而增加，酯类物质变化规律则与之相反，香气组分种类随通氧量的增加而增加但相对含量却有所降低[23]。通常富氧发酵多以恒定的氧气流速通入发酵箱内，而发酵中实际氧浓度并不明晰，因此不同氧浓度对内含成分和感官品质的影响尚缺乏研究。本文利用可以实现氧浓度控制的发酵平台，进行3个不同氧浓度的发酵实验（5%，21%和36%），分析氧对红茶品质和代谢物变化的影响机制，进而优化富氧发酵中氧浓度、通氧时间和发酵时间等工艺参数，为指导红茶生产加工提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
甲醇、乙腈、甲酸 色谱纯，Sigma公司；儿茶素标准品（表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素（epicatechin，EC）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素（catechin，C））、茶黄素标准品（茶黄素（Theaflavin，TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF3G）、茶黄素-3'-没食子酸酯（Theaflavin-3'-gallate，TF3'G）、茶黄素-3,3'-双没食子酸酯（theaflavin-3,3'-digallate，TFDG）） Sigma公司；咖啡碱（caffeine，CAF）标准品、没食子酸（gallic acid，GA） 上海源叶生物科技有限公司。
6CR-35型揉捻机、6CQ-8型茶鲜叶处理平台 长沙湘丰智能装备股份有限公司；6CHM-901型烘干机 浙江春江茶叶机械有限公司；6CHT-16型茶叶烘焙提香机 浙江珠峰机械有限公司；MA-150C型红外水分测定仪、RHXL3SD型温湿度记录仪 日本Omron公司；LGJ-50C型四环冻干机 北京四环科学仪器厂有限公司；Sartorius Quintix224-1CN 型分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ES108-LCD在线气体检测仪 深圳市无眼界科技有限公司；UPLC-MS，H-CLASS/QDa超高效液相色谱质谱联用仪 美国Waters 公司；CAR/PDMS萃取头（85 μm，1 cm） 美国宾夕法尼亚州Supelco 公司；GC×GC-TOFMS仪器 美国明尼苏达州LECO公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
茶鲜叶按照红茶标准工艺进行加工，其工序如图1所示，基本工序为：萎凋、揉捻、发酵、干燥。具体工艺参数及实验处理如下：采摘自中国农业科学院茶叶研究所嵊州基地的一芽二叶龙井43鲜叶40 kg，均匀摊放在可控温控湿的萎凋室中进行萎凋，设置萎凋温度28 ℃，萎凋相对湿度60%，萎凋时间14 h，萎凋结束时鲜叶含水量约60%；萎凋结束后，将萎凋叶混匀，在35型揉捻机中进行揉捻，转速35 r/min，程序加压（空揉10 min、轻揉10 min、中揉10 min、重揉5 min），循环1次，揉捻时间为70 min；揉捻结束后，将揉捻叶混匀，均匀分成3等份，在6CQ-8型号的茶叶处理实验平台中进行发酵处理，设置发酵温度30 ℃，相对湿度90%，发酵时间3 h。发酵处理分为3组，富氧组通过氧气罐向实验平台均匀输送氧气，通过ES108-LCD在线气体检测仪实时监测氧浓度并通过电磁阀门进行反馈调节，控制氧浓度在36%左右；低氧组通过氮气罐向实验平台均匀输送氮气，通过ES108-LCD在线气体检测仪实时监测氧浓度并通过电磁阀门进行反馈调节，控制氧浓度在5%左右；对照组（CK）采用自然发酵（氧浓度在21%左右），通过ES108-LCD在线气体检测仪实监测氧浓度并记录。发酵结束后分别取3个实验处理样品采用毛火120 ℃、15 min，足火90 ℃、30 min烘干，制得成品茶。所制成品茶进行感官评价，非挥发性及挥发性代谢物检测。
1.2.2 感官审评
茶叶样品的感官评估由3名专业机构培训和认证并专门从事茶叶感官审评五年以上的评茶员（2名男性和1名女性）进行。茶叶样品的感官评估按照国家标准GB/T 23776-2018茶叶感官审评方法执行，评价红茶外形、汤色、香气、滋味、叶底5项，各审评因子的权数分别为25%、10%、25%、30%、10%。对评茶员感官评审结果打分汇总计算均值，作为茶叶样品感官审评结果。
1.2.3 非挥发性代谢物检测
茶多酚总量测定：参考国标《GB/T 8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中福林酚检测方法进行测定；
游离氨基酸总量测定：参考国标《GB/T 8314-2013 茶 游离氨基酸总量测定》中茚三酮检测方法进行测定；
TFs测定：采用系统分析法进行测定，参考程启坤[24]的检测方法进行适当修改；
可溶性糖总量：采用硫酸蒽酮比色法测定[25]，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，计算可溶性糖总量；标准曲线公式为：Y=1.5372X+0.22；其中Y表示吸光度，X为葡萄糖浓度（mg/mL），R2值为0.9961；
儿茶素、茶黄素、咖啡碱和没食子酸单体检测：参考Chen等[26]检测方法，采用UPLC-MS，色谱柱为Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），以标准品为对照进行定性定量。称取0.2 g冻干均匀磨碎样品于10 mL离心管中，加入70 ℃预热甲醇溶液5 mL，70 ℃水浴浸提10 min，冷却至室温后3500 r/min离心10 min，上清液转移至10 mL容量瓶，残渣重复以上操作，合并提取液定容至10 mL，摇匀，过膜待检。以0.1%甲酸溶液为A相，纯乙腈溶液为B相。参数设置如下：柱温箱温度30 ℃，样品管理器温度15 ℃。流动相洗脱梯度条件如下：0~3 min，90% B相；3~6 min，90%~83% B相；6~12 min，83%~73% B相；12~15 min，73%~50% B 相；15~15.5 min，50% B相；15.5~16 min，50%~90% B相；16~20 min，90% B相，流速350 μL/min，进样量2 μL。QDA质谱检测则采用负离子模式进行，质量范围为m/z 50~950，全扫描记录；去溶剂化温度设置为600 ℃，源温度设置为120 ℃；采样锥孔电压设置为15 V，毛细管电压设置为0.8 kV。
1.2.4 挥发性代谢物检测
称取1.0 g冻干均匀磨碎样品放入20 mL带盖玻璃瓶中，加入5 mL沸水，60 ℃条件下恒温振荡3 min后，插入CAR/PDMS萃取头吸附60 min。然后在250 ℃下解吸附5 min。进样时先用甲醇稀释1000倍，进样量为1 μL。GC的主要参数：传输线温度为250 ℃；载气为氦气（99.9%），流速为1.0 mL/min；分流比10:1；调制解调时间间隔为5 s；一维气相柱的升温程序为：50 ℃保持2 min，8 °C/min上升到265 ℃，保持5 min；二维柱的升温程序为：55 ℃保持2 min，8 °C/min上升到270℃，保持5 min。MS的主要参数：电离电压为1390 V；扫描范围33~500 m/z；电子碰撞电离电压为−70 eV；离子源温度为220 ℃；界面温度为270 ℃。各挥发性代谢物分别用 NIST08 标准谱库进行检索匹配，碎片比对，并结合相关文献报道、各成分的相对保留时间等进行定性。依据峰面积数值变化结合统计分析进行不同处理差异挥发性代谢物鉴定及变化分析。
1.2.5 单因素实验
在明确发酵中氧可以通过调控内含物质变化影响红茶品质的基础上，采用单因素分析氧浓度、通氧时间和发酵时间对红茶茶黄素含量和感官得分的影响，茶黄素含量采用上文中液相色谱法测定，感官审评方法如上所述。
固定通氧时间3 h，发酵时间3 h，考察不同氧气浓度（5%、21%、36%、51%、66%）对茶黄素含量和感官得分的影响。
固定通氧时间3 h，氧气浓度36%，考察不同发酵时间（0、1、2、3、4、5 h）对茶黄素含量和感官得分的影响。
固定发酵时间3 h，氧气浓度为36%，考察不同通氧时间（0、1、2、3、4 h）对茶黄素含量和感官得分的影响。
1.2.6 响应面试验
在单因素实验的基础之上，以氧气浓度（A）、通氧时间（B）、发酵时间（C）为自变量，感官得分为响应指标进行响应面试验（response surface methodology, RSM）设计，RSM因素水平见表1。
表 1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1. Factors and levels of Box-Behnken experiments design水平 A氧气浓度（%） B通氧时间（h） C发酵时间（h） −1 26 1 3 0 36 1.5 3.5 1 46 2 4 1.3 数据处理
单因素方差分析采用SPSS 软件（one-Way ANOVA，LSD多重检验 ）；柱形图、折线图、热图绘制采用Origin 2022b软件；挥发性成分的香型通过TGSC（The Good Scents Company）网站（www.thegoodscentscompany）查询。
2. 结果与分析
2.1 发酵氧浓度对红茶感官品质的影响
不同氧浓度发酵红茶感官审评结果如表2所示。由表可知，不同氧浓度发酵红茶感官品质存在较大差异，其中36%氧浓度发酵红茶品质最优，其香气和滋味品质均显著高于（P<0.05）21%和5%氧浓度发酵红茶；5%氧浓度发酵红茶感官品质最差，滋味青涩，叶底多青张。结果表明，红茶发酵中提高氧浓度可以改善红茶滋味和香气品质。推测不同氧浓度发酵中内含成分的差异导致了红茶感官品质的变化，为解析发酵中提高氧浓度改善红茶滋味及香气品质的机制，本实验进一步对非挥发性及挥发性代谢物变化进行比较分析。
表 2 不同氧浓度发酵处理红茶成品茶感官审评结果Table 2. Sensory evaluation of black tea with different oxygen concentration fermentation实验处理 外形（25%） 汤色（10%） 香气（25%） 滋味（30%） 叶底（10%） 总分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 低氧 紧结 84.5±0.41a 较红亮 88±0.41ab 青 82.5±0.41c 较浓，带生涩 84±0.82c 多青张 78±0.82b 83.55±0.53c 对照 紧结 83.75±0.61a 较红亮 87.5±0.82a 有甜香，较高 85.5±0.41b 醇爽 86±0.00b 较红亮，带青张 82.5±0.41a 84.98±0.21b 富氧 紧结 83.75±0.20a 较红亮 88.5±0.41a 甜香 86.5±0.41a 甜爽 88±0.41a 较红亮 83.5±0.41a 86.16±0.33a 注：同列中不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著；表7同。 2.2 发酵氧浓度对非挥发性代谢物的影响
如表3所示，不同氧浓度发酵红茶非挥发性代谢物存在较大差异。低氧、对照和富氧组多酚含量分别为28.93%、23.19%和19.94%；随氧浓度升高，茶多酚总量呈显著下降趋势（P<0.05），相比对照组，低氧组多酚增加24.76%，富氧组多酚含量下降13.98%。由表3可知，随氧浓度升高，儿茶素各单体含量呈显著下降趋势（P<0.05）。相比对照组，富氧组的EGCG、ECG、EGC、EC分别下降48.59%、26.59%、25.03%和10.94%。EGCG下降比例最大，ECG和EGC接近，EC下降比例最小，表明氧浓度对不同结构的儿茶素影响存在差异。红茶发酵中，儿茶素在PPO和POD的催化下与氧气反应生成邻醌，邻醌可进一步与儿茶素聚合形成TFs、TSs以及其他高聚物[11-13]，因此提高发酵中氧气浓度可以显著提升儿茶素氧化速率促进其消耗，而不同儿茶素消耗量的差异可能与PPO和POD对不同结构儿茶素催化效率存在差异有关。
表 3 不同氧浓度发酵对红茶理化成分含量的影响Table 3. Influences of different oxygen concentration on the changes of contents理化成分 含量（%） 低氧 对照 高氧 茶多酚 28.93±1.4a 23.19±0.907b 19.94±0.756c GA 0.54±0.002a 0.47±0.002b 0.4±0.002c EGC 2.68±0.346a 2.89±0.305a 2.17±0.233a EGCG 5.2±0.111a 2.69±0.229b 1.39±0.075c ECG 2±0.037a 1.48±0.039b 1.09±0.019c C 0.74±0.014a 0.74±0.019a 0.48±0.078b CAF 2.8±0.05a 3.03±0.16a 2.82±0.039a TFs 1.276±0.067c 2.111±0.045b 2.434±0.033a TF 0.131±0.003c 0.179±0.019b 0.2±0.011a TF3G 0.793±0.056c 1.278±0.019b 1.46±0.033a TF3'G 0.134±0.008c 0.176±0.002b 0.195±0.005a TFDG 0.218±0.004c 0.478±0.009b 0.579±0.006a 可溶性糖 15.49±0.242a 14.81±0.361a 14.44±0.338b 游离氨基酸 2.12±0.08a 2.09±0.027a 2.01±0.041a 注：同行中不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。 由表3可知，随发酵中氧浓度升高，茶黄素总量及各单体含量呈显著上升趋势（P<0.05）。相比对照组，低氧处理中TFs降低了39.57%，其中TF、TF3G、TF3'G和TFDG分别显著降低了27.04%、37.98%、23.62%和54.37%（P<0.05）；相比对照组，富氧处理中TFs显著增加了15.32%（P<0.05），其中TF、TF3G、TF3'G和TFDG分别显著增加了11.94%、14.23%、10.84%和21.13%（P<0.05）。结果表明，发酵中氧浓度增加可以显著促进茶黄素的积累。茶黄素由儿茶素氧化聚合形成，因此提高发酵中氧气浓度在促进儿茶素消耗的同时可以促进茶黄素的积累，儿茶素消耗的差异也导致了茶黄素单体的增加比例存在较大差异。
由表3可知，低氧、对照和富氧组GA含量存在显著差异（P<0.05），分别为0.54%， 0.47%和0.4%；相比对照组，富氧处理中GA含量下降14.24%，低氧处理中含量增加14.77%。由表3可知，红茶发酵中随氧浓度增加，游离氨基酸含量和可溶性糖含量呈轻微下降趋势。其中相比对照组，富氧处理中游离氨基酸含量下降了3.78%，可溶性糖下降了2.48%；相比对照组组，低氧组处理中氨基酸增加了1.42%，可溶性糖增加了4.62%。氨基酸和可溶性糖在常温下性质较为稳定，因此发酵中提升氧气浓度对氨基酸和可溶性糖的影响较小。
儿茶素、GA、TFs、氨基酸等是红茶的关键滋味化合物[16,23]。儿茶素具有苦涩味，同时也是红茶茶汤浓度和强度不可缺少的部分；GA约占茶叶干重的0.5%~1.4%，具有酸味和涩味，其含量过高会影响红茶滋味品质。红茶发酵中儿茶素被大量氧化，形成TFs、TSs等氧化产物，再进一步氧化为TRs、TBs，形成红茶的独特品质，有研究表明TFs与红茶品质呈高度正相关[17]。游离氨基酸约占茶叶干重的1%~4%，是茶叶鲜味和甜味形成的重要物质[27-28]。富氧发酵相比自然发酵，呈苦、涩及酸味的儿茶素和GA含量显著降低，具有鲜味的TFs含量显著增加，以及与鲜爽度相关的游离氨基酸无显著减少。这些内含成分的差异使得富氧发酵红茶苦涩味降低，鲜爽味增加，这可能是其滋味品质改善的主要原因。
2.3 发酵氧浓度对挥发性代谢物的影响
GC-MS对挥发性代谢物进行检测分析，3组中共检测到挥发性代谢物109种，其中包括醛类31种，酮类14种，醇类20种，烯类13种，酯类17种，酸类5种，其他化合物9种。为进一步明确发酵中氧浓度对红茶挥发性化合物的影响，本研究进行了正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis OPLS-DA）（图2A）。结果发现，模型X轴方向累积解释率为R2X=0.608，模型Y方向累积解释率为R2Y=0.994，模型的累积解释率Q2=0.935，表明可以根据挥发性化合物的含量进行不同氧浓度发酵处理的分离和预测，进一步说明，发酵氧浓度对红茶挥发性化合物含量产生了影响。模型中变量投影重要性因子（variable important for the projection，VIP）大于1的挥发性成分作为模型判别和预测的重要贡献物质（即差异性化合物），发现VIP>1的挥发性成分共25种，包括12种醛类、2种酮类、3种醇类、3种烯类、5种酯类，差异挥发性化合物的热图见图2B。在差异挥发性化合物中，高氧组与对照组相比，5种香气物质下调，其中2-己烯醛、（E,E）-2,4-己二烯醛、庚醛、α-紫罗酮和α-蒎烯含量下降，其他香气物质含量均增加；对照与低氧组相比，6种香气物质下调，18种香气物质上调，1-十六烷醇无变化，其中香叶基丙酮、2-乙基-己醇、水芹烯、辛酸甲酯、乙酸苯乙酯和Z,Z-3-己烯酸-3-己烯酯含量下降，其他香气物质含量均增加。
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图 2 不同发酵处理红茶挥发性成分含量OPLS-DA图（A）和差异化合物热图（B）Figure 2. OPLS-DA score plot (A) of volatile component contents in tea with different fermentation treatments and heat map (B) of different contents通过峰面积对比分析不同氧浓度处理的差异挥发性物质含量变化比例。与对照组相比，富氧组的正己醛（绿叶香）增加了5.77%，（E）-2-庚烯醛（清香、绿叶香）增加了27.06%，（E,E）-2,4-壬二烯醛（果香）增加了75.57%，α-亚乙基-苯乙醛（甜香、蜜香）增加了66.14%，反式-2,4-癸二烯醛（柑橘香、坚果香）增加了125.66%，苯甲醛（甜香、樱桃香）增加了18.34%，苯乙醛（蜜香、甜香）增加了21.93%，十一醛（花香、柑橘香、清香）增加了39.13%，香叶基丙酮（清香、果香）增加了42.14%，苯乙烯（甜香）增加了12.30%，水芹烯（木质香、花香）增加了34.51%，己酸甲酯（香蕉香）增加了18.79%，辛酸甲酯（甜香）增加了31.65%，乙酸苯乙酯（蜜香、玫瑰香）增加了264.90%，Z,Z-3-己烯酸-3-己烯酯（番茄叶香）增加了60.06%，二氢猕猴桃内酯（坚果香）增加了6.68%。与对照组相比，低氧组的正己醛下降了42.64%，2-己烯醛下降了71.19%，苯甲醛下降了28.60%，苯乙醛下降了35.31%，庚醛下降了55.98%，（E）-2-庚烯醛下降了59.85%，（E,E）-2,4-壬二烯醛下降了7.97%，α-亚乙基-苯乙醛下降了62.18%，十一醛下降了9.96%，α-紫罗酮下降了9.23%，CIS-4-庚烯醇下降了31.80%，苯乙烯下降了32.22%，α-蒎烯下降了97.40%，乙酸甲酯下降了19.84%，二氢猕猴桃内酯下降了41.77%。
结果表明，发酵中提高氧气浓度对挥发性物质含量具有显著影响，其中大部分差异化合物呈显著上调趋势，且显著增加的挥发性化合物大多具有果香、甜香、花香等对红茶香气有正向贡献的特征，这可能是富氧发酵显著改善香气品质的主要原因。茶叶中香气化合物的形成主要来源于加工过程中类胡萝卜素、脂肪酸、糖苷前体的次生代谢和美拉德反应[29]。本研究差异化合物中，2-己烯醛具果香，由脂肪酸降解途径形成，其含量增加5.77%；香叶基丙酮具清香和果香，由胡萝卜素降解途径形成，含量增加42.14%；二氢猕猴桃内酯具坚果香，由胡萝卜素降解途径形成，含量增加6.68%。因此，富氧发酵中挥发性物质含量增加可能是氧气浓度提高促进了胡萝卜素的降解、脂肪酸氧化等香气形成途径导致的。
2.4 发酵工艺对红茶品质及茶黄素含量的影响
氧气是氧化反应的底物，适宜的氧气浓度可以促进茶黄素的形成和积累。由图3A可知，5%、21%、36%、51%、66%氧浓度条件下，茶黄素总含量和感官得分均呈先增后降的变化趋势。这是因为随氧浓度增加，茶多酚可更多的氧化形成茶黄素，而氧浓度继续升高会使茶黄素进一步聚合形成茶红素和茶褐素，导致其含量下降[11-13]，随氧浓度增加发酵程度由轻到重，进而影响其感官得分变化。氧浓度36%时其茶黄素含量为2.43%，显著高于其他处理（P<0.05）；氧浓度36%时，感官得分最高为86.75，显著高于其他处理（P<0.05）。因此确定红茶发酵中氧气浓度在响应面优化中的因素水平为26%、36%、46%。 ![]()
图 3 不同工艺参数对红茶茶黄素和感官得分的影响注：图中不同小写字母表示差异显著P<0.05。Figure 3. Effects of parameters on black tea theaflavins contents and sensory scores由图3B可知，通氧时间0、1、2、3、4 h时茶黄素含量和感官得分均呈先增后降的变化趋势，这是因为随通氧时间延长，前期可以促进儿茶素等茶多酚氧化形成茶黄素，而后期则促进茶黄素和其他物质的进一步聚合，从而呈现茶黄素含量先高后低的变化趋势，内含成分的变化趋势导致了其感官得分的先增后降。其中通氧时间为1和2 h时茶黄素含量为2.43%、2.47%，显著高于其他处理（P<0.05）；通氧时间为2 h时感官得分为85.75，显著高于其他处理（P<0.05）。因此确定红茶发酵中通氧时间在响应面优化中的因素水平为1、1.5、2 h。 发酵时间是影响红茶发酵程度的重要因素。由图3C可知，发酵时间为0、1、2、3、4、5 h时茶黄素含量和感官得分均呈先增后降的变化趋势。这是因为随着发酵时间延长，茶黄素进一步聚合转化导致其含量降低，重度发酵也导致香气和滋味品质下降。发酵时间为4 h时茶黄素为2.31%，显著高于其他处理（P<0.05）；发酵3 h得分为86分，显著高于其他处理（P<0.05）。因此确定红茶发酵中发酵时间在响应面优化中的因素水平为3、3.5、4 h。 2.5 富氧发酵工艺优化
根据单因素结果，选择氧气浓度为26%、36%、46%，通氧时间1、1.5、2 h，发酵时间3、3.5、4 h进行响应面优化。响应面实验结果如表4所示，回归模型方差分析见表5，回归模型中F值为28.48，P<0.01，表明该模型之间存在极显著的差异，可以用于预测响应值，R2=0.9734，该模型可以用于分析红茶不同发酵条件的感官品质。根据方差分析结果，在该实验中影响红茶品质的因素为：氧气浓度>通氧时间>发酵时间。氧气浓度，通氧时间和发酵时间两两交互作用的响应面图如图4所示。在响应面图中，若图形趋于陡峭，则说明因素交互作用的影响越显著。由图4可见，响应面曲面图较为平缓，其中图A等高线图接近圆形，这表明3个因素的交互作用均不显著，与方差分析结果一致。根据响应面结果提出最优工艺参数为：氧气浓度40.45%、通氧时间1.42 h、发酵时间4.00 h，依据实际操作需求将富氧发酵工艺参数调整为：氧气浓度40%、通氧时间1.5 h、发酵时间4.00 h。依据优化的富氧发酵工艺参数进行验证实验，以不通氧处理为对照，感官审评结果如表6所示，优化工艺感官审评总得分89.45，明显高于对照工艺，且新工艺加工红茶香气和滋味品质均有明显提升；茶黄素含量检测结果如表7所示，优化工艺TFs为2.86%，TF、TF3G、TF3'G和TFDG含量分别为0.25%、1.71%、0.24%和0.68%，均显著高于对照组茶黄素含量（P<0.05），结果表明，优化富氧发酵工艺参数可以改善红茶品质，提高茶黄素含量。
表 4 响应面试验结果Table 4. Response surface experimental results实验号 因素 感官得分（分） A 氧气浓度 B 通氧时间 C 发酵时间 1 −1 1 0 84.3 2 −1 −1 0 84.5 3 1 1 0 84.8 4 1 −1 0 85 5 −1 0 −1 85.6 6 1 0 −1 86.8 7 0 0 0 89.4 8 0 0 0 89.1 9 0 1 −1 88.1 10 0 0 0 88.9 11 0 −1 −1 88.3 12 1 0 1 87.3 13 −1 0 1 86.8 14 0 1 1 87.2 15 0 0 0 89 16 0 −1 1 88.4 17 0 0 0 88.6 表 5 回归模型方差分析Table 5. Variance analysis of regression model方差源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 Model 47.88 9 5.32 28.48 <0.0001 ** A-氧气浓度 0.9113 1 0.9113 4.88 0.0629 B-通氧时间 0.4050 1 0.4050 2.17 0.1844 C-发酵时间 0.1013 1 0.1013 0.5421 0.4447 AB 0.0000 1 0.0000 0.0000 1.0000 AC 0.1225 1 0.1225 0.6558 0.447 BC 0.2500 1 0.2500 1.34 0.2853 A² 34.50 1 34.50 184.71 <0.0001 ** B² 9.32 1 9.32 49.88 0.0002 ** C² 1.00 1 1.00 5.36 0.0538 残差 1.31 7 0.1868 失拟项 0.9675 3 0.3225 3.79 0.1152 总和 49.18 16 R2 0.9734 注：“*”表示对结果影响显著差异（P<0.05），“**” 表示对结果影响极显著差异（P<0.01）。 ![]()
图 4 通氧时间、氧气浓度和发酵时间的交互作用的响应面图Figure 4. Response surface of the interaction between oxygen time, oxygen concentration and fermentation表 6 优化富氧发酵工艺参数验证结果Table 6. Optimization of aerobic fermentation process parameters validation实验处理 外形（25%） 汤色（10%） 香气（25%） 滋味（30%） 叶底（10%） 总分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 对照 紧结 84 较红亮 89 甜香，略青 90 醇、较爽 87 较红亮，带青张 86 87.1 优化工艺 紧结 85 红亮 94 甜香 92 甜爽 90 较红亮 88 89.45 表 7 优化工艺样品与对照样品茶黄素含量Table 7. TFs contents of optimized and control samples实验处理 茶黄素含量（%） 总量 TF TF3G TF3’G TFDG 对照 2.31±0.02b 0.21±0.01b 1.39±0.02b 0.21±0.01b 0.51±0.01b 优化工艺 2.86±0.05a 0.25±0.02a 1.71±0.02a 0.24±0.00a 0.68±0.02a 3. 结论
本文进行了红茶不同氧浓度发酵处理，感官审评结合理化检测分析了氧对红茶品质及挥发性和非挥发性代谢物的影响。研究结果表明，相比自然发酵，富氧发酵可以显著改善红茶滋味和香气品质；富氧发酵中关键滋味化合物儿茶素及GA含量显著下降（P<0.05），TFs及各单体含量显著增加（P<0.05），游离氨基酸含量无显著变化（P>0.05）；不同氧浓度发酵中共25种挥发性化合物存在显著差异，包括12种醛类，2种酮类，3种醇类，3种烯类，5种酯类，大部分差异化合物含量随氧浓度升高而增加；红茶富氧发酵优化工艺参数为：氧气浓度40%、通氧时间1.5 h、发酵时间4 h，优化工艺红茶的茶黄素总量、TF、TF3G、TF3'G和TFDG含量分别为2.86%、0.25%、1.71%、0.24%和0.68%。研究结果为指导红茶加工和品质调控提供了重要依据。
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图 2 不同发酵处理红茶挥发性成分含量OPLS-DA图（A）和差异化合物热图（B）
Figure 2. OPLS-DA score plot (A) of volatile component contents in tea with different fermentation treatments and heat map (B) of different contents
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图 3 不同工艺参数对红茶茶黄素和感官得分的影响
注：图中不同小写字母表示差异显著P<0.05。
Figure 3. Effects of parameters on black tea theaflavins contents and sensory scores
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图 4 通氧时间、氧气浓度和发酵时间的交互作用的响应面图
Figure 4. Response surface of the interaction between oxygen time, oxygen concentration and fermentation
表 1 Box-Behnken 试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
水平 A氧气浓度（%） B通氧时间（h） C发酵时间（h） −1 26 1 3 0 36 1.5 3.5 1 46 2 4 
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表 2 不同氧浓度发酵处理红茶成品茶感官审评结果
Table 2 Sensory evaluation of black tea with different oxygen concentration fermentation
实验处理 外形（25%） 汤色（10%） 香气（25%） 滋味（30%） 叶底（10%） 总分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 低氧 紧结 84.5±0.41a 较红亮 88±0.41ab 青 82.5±0.41c 较浓，带生涩 84±0.82c 多青张 78±0.82b 83.55±0.53c 对照 紧结 83.75±0.61a 较红亮 87.5±0.82a 有甜香，较高 85.5±0.41b 醇爽 86±0.00b 较红亮，带青张 82.5±0.41a 84.98±0.21b 富氧 紧结 83.75±0.20a 较红亮 88.5±0.41a 甜香 86.5±0.41a 甜爽 88±0.41a 较红亮 83.5±0.41a 86.16±0.33a 注：同列中不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著；表7同。
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表 3 不同氧浓度发酵对红茶理化成分含量的影响
Table 3 Influences of different oxygen concentration on the changes of contents
理化成分 含量（%） 低氧 对照 高氧 茶多酚 28.93±1.4a 23.19±0.907b 19.94±0.756c GA 0.54±0.002a 0.47±0.002b 0.4±0.002c EGC 2.68±0.346a 2.89±0.305a 2.17±0.233a EGCG 5.2±0.111a 2.69±0.229b 1.39±0.075c ECG 2±0.037a 1.48±0.039b 1.09±0.019c C 0.74±0.014a 0.74±0.019a 0.48±0.078b CAF 2.8±0.05a 3.03±0.16a 2.82±0.039a TFs 1.276±0.067c 2.111±0.045b 2.434±0.033a TF 0.131±0.003c 0.179±0.019b 0.2±0.011a TF3G 0.793±0.056c 1.278±0.019b 1.46±0.033a TF3'G 0.134±0.008c 0.176±0.002b 0.195±0.005a TFDG 0.218±0.004c 0.478±0.009b 0.579±0.006a 可溶性糖 15.49±0.242a 14.81±0.361a 14.44±0.338b 游离氨基酸 2.12±0.08a 2.09±0.027a 2.01±0.041a 注：同行中不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。
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表 4 响应面试验结果
Table 4 Response surface experimental results
实验号 因素 感官得分（分） A 氧气浓度 B 通氧时间 C 发酵时间 1 −1 1 0 84.3 2 −1 −1 0 84.5 3 1 1 0 84.8 4 1 −1 0 85 5 −1 0 −1 85.6 6 1 0 −1 86.8 7 0 0 0 89.4 8 0 0 0 89.1 9 0 1 −1 88.1 10 0 0 0 88.9 11 0 −1 −1 88.3 12 1 0 1 87.3 13 −1 0 1 86.8 14 0 1 1 87.2 15 0 0 0 89 16 0 −1 1 88.4 17 0 0 0 88.6
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表 5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
方差源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 Model 47.88 9 5.32 28.48 <0.0001 ** A-氧气浓度 0.9113 1 0.9113 4.88 0.0629 B-通氧时间 0.4050 1 0.4050 2.17 0.1844 C-发酵时间 0.1013 1 0.1013 0.5421 0.4447 AB 0.0000 1 0.0000 0.0000 1.0000 AC 0.1225 1 0.1225 0.6558 0.447 BC 0.2500 1 0.2500 1.34 0.2853 A² 34.50 1 34.50 184.71 <0.0001 ** B² 9.32 1 9.32 49.88 0.0002 ** C² 1.00 1 1.00 5.36 0.0538 残差 1.31 7 0.1868 失拟项 0.9675 3 0.3225 3.79 0.1152 总和 49.18 16 R2 0.9734 注：“*”表示对结果影响显著差异（P<0.05），“**” 表示对结果影响极显著差异（P<0.01）。
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表 6 优化富氧发酵工艺参数验证结果
Table 6 Optimization of aerobic fermentation process parameters validation
实验处理 外形（25%） 汤色（10%） 香气（25%） 滋味（30%） 叶底（10%） 总分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 评语 得分（分） 对照 紧结 84 较红亮 89 甜香，略青 90 醇、较爽 87 较红亮，带青张 86 87.1 优化工艺 紧结 85 红亮 94 甜香 92 甜爽 90 较红亮 88 89.45
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表 7 优化工艺样品与对照样品茶黄素含量
Table 7 TFs contents of optimized and control samples
实验处理 茶黄素含量（%） 总量 TF TF3G TF3’G TFDG 对照 2.31±0.02b 0.21±0.01b 1.39±0.02b 0.21±0.01b 0.51±0.01b 优化工艺 2.86±0.05a 0.25±0.02a 1.71±0.02a 0.24±0.00a 0.68±0.02a
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