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中国精品科技期刊2020

花青素协同酶水解法对翅果油粕蛋白功能性质和结构特性的影响

王江涛, 赵晓瑜, 郭彩霞

王江涛,赵晓瑜,郭彩霞. 花青素协同酶水解法对翅果油粕蛋白功能性质和结构特性的影响[J]. 食品工业科技,2023,44(20):18−26. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100200.
引用本文: 王江涛,赵晓瑜,郭彩霞. 花青素协同酶水解法对翅果油粕蛋白功能性质和结构特性的影响[J]. 食品工业科技,2023,44(20):18−26. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100200.
WANG Jiangtao, ZHAO Xiaoyu, GUO Caixia. Effect of Anthocyanin Synergistic Enzymatic Hydrolysis on Functional and Structural Properties of Elaeagnus mollis Oil Meal Protein[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(20): 18−26. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100200.
Citation: WANG Jiangtao, ZHAO Xiaoyu, GUO Caixia. Effect of Anthocyanin Synergistic Enzymatic Hydrolysis on Functional and Structural Properties of Elaeagnus mollis Oil Meal Protein[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(20): 18−26. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100200.

花青素协同酶水解法对翅果油粕蛋白功能性质和结构特性的影响

基金项目: 山西省基础研究计划(自由探索)(202203021221034);山西大学杏花村学院(山西酿造产业研究院)开放基金(XCSXU-KF-202204)。
详细信息
    作者简介:

    王江涛(1996−),男,硕士研究生,研究方向:食品营养与安全,E-mail:202023117008@email.sux.edu.cn

    通讯作者:

    郭彩霞(1984−),女,博士,副教授,研究方向:食品营养与安全,E-mail:guocx@sxu.edu.cn

  • 中图分类号: TS201.2

Effect of Anthocyanin Synergistic Enzymatic Hydrolysis on Functional and Structural Properties of Elaeagnus mollis Oil Meal Protein

  • 摘要: 以翅果油粕蛋白为原料,在花青素与翅果油粕蛋白相互作用的最适pH条件下,考察不同质量浓度花青素结合法和酶水解法协同作用对翅果油粕蛋白的功能性质、结构性质和抗氧化活性的影响。结果表明:翅果油粕蛋白及其酶解蛋白与花青素结合的最适pH分别为7、3,在最适pH条件下,花青素通过非共价作用与翅果油粕蛋白及其酶解蛋白结合形成复合物,随着花青素质量浓度增加,复合物的起泡性能、乳化性能和抗氧化能力均明显提高,同时花青素-酶解蛋白复合物的性能高于花青素-翅果油粕蛋白复合物以及未加花青素的酶解蛋白。综上所述,花青素结合酶水解法可以有效提高翅果油粕蛋白的功能性质和抗氧化活性,这为翅果油粕蛋白高效利用的提供了一定科学依据。
    Abstract: Using Elaeagnus mollis oil meal protein as raw material, the synergistic effects of different mass concentrations of anthocyanin binding and enzymatic hydrolysis on the functional properties, structural properties and antioxidant activity of Elaeagnus mollis oil meal protein were investigated under the optimum pH conditions for the interaction between anthocyanins and Elaeagnus mollis oil meal protein. The results showed that the optimum pH for the combination of Elaeagnus mollis oil meal protein and its enzymatic protein with anthocyanin was pH7 and pH3, respectively. At optimal pH, anthocyanins form complexes with Elaeagnus mollis oil meal protein or their enzymatic proteins through non-covalent interactions. With the increase of anthocyanin mass concentration, the foaming performance, emulsification performance and antioxidant capacity of the complexes were significantly improved, and the performance of anthocyanin-enzymatic protein complexes was higher than that of anthocyanin-Elaeagnus mollis oil meal protein complexes and enzymatic protein without anthocyanin. In conclusion, the anthocyanin combination method and enzymatic hydrolysis method could effectively improve the functional properties and antioxidant activity of Elaeagnus mollis oil meal protein, which would provide some scientific basis for the efficient utilization of Elaeagnus mollis oil meal protein.
  • 翅果油树(Elaeaguns molis Diels)是我国稀有物种,属胡秃子科胡秃子属,主要分布于山西和陕西等地[12]。翅果油种仁富含油脂、蛋白质、维生素等营养物质,其中蛋白质含量高达32%~36%[3],翅果油种仁蛋白含有17种氨基酸,其中人类必需氨基酸7种,对人体有益的谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量较高,具有很好的保健作用和开发潜能[4]。然而,翅果油粕蛋白在中性条件下的溶解性较差[5],这极大地限制其开发和应用,因此改善翅果油粕蛋白的功能性质十分必要。

    目前,蛋白改性常用的方法有物理法、化学法、酶解法等,其中酶解法通过蛋白酶催化肽键断裂,使大分子蛋白变为小分子多肽,从而提高其体内消化吸收率并且改善植物蛋白功能性质[67]。此外,多酚结合法改善蛋白质的功能性质逐渐成为近年来的研究热点。多酚与蛋白质结合形成复合物,通过相互作用改变蛋白结构从而提高功能性质和生理活性,拓宽蛋白质的应用范围。多酚与蛋白质之间相互作用会受到温度、pH、多酚类型和蛋白类型等因素的影响,其中pH决定多酚与蛋白质间相互作用类型[8],多酚与蛋白质之间的相互作用可以分为共价作用和非共价作用。在碱性条件下,多酚易被氧化成醌,醌类物质会和蛋白质的氨基酸残基发生不可逆的共价结合,而多酚与蛋白质之间的非共价作用是通过疏水相互作用和氢键等相对较弱的作用力发生可逆结合[9]

    花青素(Anthocyanin)是一种天然的水溶性植物色素,属于黄酮类化合物[10],作为天然的抗氧化剂,花青素对氧化应激导致的损伤具有一定的保护作用[11],现有研究表明花青素与蛋白质结合可有效地提高蛋白溶液的功能性质[1213]。然而,目前花青素结合法均是对大分子蛋白进行改性,对于花青素结合法与酶解法协同作用于蛋白,提高其功能性质的研究不足。本文通过花青素与酶水解法协同作用对翅果油粕蛋白进行改性,探究了花青素结合法和酶水解法协同对翅果油粕蛋白功能性质及抗氧化活性的影响,并利用荧光光谱和紫外光谱探究花青素对翅果油粕蛋白及其酶解产物二级结构的影响,为拓宽翅果油粕蛋白在食品行业中的应用范围提供理论依据。

    翅果油粕 山西琪尔康翅果生物制品有限公司;花青素(纯度为95%) 天津尖峰天然研究产物研究开发有限公司;考马斯亮蓝G-250、十二烷基苯磺酸钠(SDS)、甘氨酸、谷胱甘肽(GSH) 北京索莱宝科技有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、β-巯基乙醇、过硫酸铵 上海麦克林生化科技有限公司;1-苯胺基-8-萘基磺酸盐(ANS) 上海贤鼎生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氨-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS) 美国Sigma公司;实验室所用试剂 均为国产分析纯。

    STARTER2100 pH计 奥豪斯仪器有限公司;SC-3614型低速离心机、KDC-140HR型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;HH-S型水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂;DYCZ-24DN型双垂直电泳槽 北京六一仪器厂;LS-55型荧光分光光度计 珀金埃尔默仪器有限公司;UV-2550型紫外-可见光谱仪 日本日立公司。

    将翅果油粕与蒸馏水以料液比1:75混合,用0.1 mol/L NaOH调节pH为11,于55 ℃水浴55 min提取蛋白。冷却至室温后,于4000 r/min离心15 min,收集上清液备用。上清液用0.1 mol/L HCl调节pH为4.5进行酸沉蛋白,30 min后结束酸沉,于4000 r/min离心15 min,收集蛋白进行真空冷冻干燥得到纯度为84.03%的翅果油粕蛋白。

    配制底物浓度为4%的翅果油粕蛋白溶液,选用碱性蛋白酶,在酶添加量为10000 U/g、酶解pH11、酶解温度50 ℃的条件下,酶解50 min,将酶解液冷冻干燥,制得水解度为10%的蛋白酶解物。

    根据李扬等[8]的方法制备复合物。具体步骤为:将样品粉末用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制成1%的蛋白样液,向样液中加入0.05%花青素,充分混合后调节溶液pH分别为3、5、7,室温搅拌2 h,得到花青素与蛋白非共价结合复合物。同样地,将溶液pH调整到9、11,室温搅拌24 h,得到花青素与蛋白共价结合复合物。测定复合物溶液清除DPPH自由基清除能力,选取清除DPPH自由基能力最强的pH作为制备具有较强抗氧化能力花青素-蛋白复合物的最适pH。

    1%蛋白溶液中分别加入0.025%、0.05%、0.1%花青素,充分混合后调节混合溶液pH至花青素结合蛋白的最适pH,室温搅拌2 h,即得到不同质量比的花青素-翅果油粕蛋白复合物(A-P)和花青素-酶解蛋白复合物(A-EP)。其中,P代表翅果油粕蛋白,0.025%、0.05%、0.1%花青素与翅果油粕蛋白形成的复合物用0.025% A-P、0.05% A-P、0.1% A-P表示;EP代表酶解蛋白,0.025%、0.05%、0.1%花青素与酶解蛋白形成的复合物用0.025% A-EP、0.05% A-EP、0.1% A-EP表示。

    根据Lowry等[14]的方法测定翅果油粕蛋白、酶解蛋白及1.2.3中制备的不同质量比的花青素-蛋白复合物的溶解性。将样品配制成浓度为0.25 mg/mL的蛋白溶液,分别调整pH到3、7,室温搅拌30 min,于4000 r/min离心10 min,收集上清液。取0.2 mL上清液与1 mL碱性铜溶液混合,室温放置10 min。加入0.1 mL酚试剂迅速摇匀,继续放置30 min。以蒸馏水为空白对照,于750 nm处测定吸光度值。以牛血清蛋白为标准物作标准曲线(y=0.0034x+0.1183,R2=0.999),上清液吸光度代入标准曲线计算蛋白含量,并按照公式计算溶解性。

    (%)=m1m×100
    (1)

    式中:m:样品中蛋白质含量,mg;m1:上清液中蛋白质含量,mg。

    根据Sze-Tao 等[15]的方法测定翅果油粕蛋白、酶解蛋白及1.2.3中制备的不同质量比的花青素-蛋白复合物的起泡性能。取100 mL蛋白浓度为1 g/mL样品溶液,分别调整溶液pH到3、7,将溶液于10000 r/min的高速分散器中分散2 min,记录泡沫的体积。室温静置30 min后再次记录泡沫体积。按照公式计算起泡性和起泡稳定性。

    (%)=V1V0V0×100
    (2)
    (%)=V2V0V1V0×100
    (3)

    式中:V0:样品溶液的起始体积,mL;V1:分散后0 min泡沫体积,mL;V2:静置30 min后泡沫体积,mL。

    根据Kevin等[16]的方法测定翅果油粕蛋白、酶解蛋白及1.2.3中制备的不同质量比的花青素-蛋白复合物的乳化性能。取100 mL蛋白浓度为1 g/mL样品溶液,分别调整溶液pH到3、7,并按3:1体积比与大豆油混合,混合后于10000 r/min的高速匀浆机中均质2 min。从溶液底部吸取100 μL乳状液,用0.1%的SDS溶液稀释至5 mL。乳状液静置放置10 min,重复上述步骤。以0.1% SDS溶液为空白,测定500 nm处吸光度值。按照公式计算样品的乳化性及乳化稳定性。

    (m2/g)=2×2.303×A00.25×m
    (4)
    (min)=A0×ΔtΔA
    (5)

    式中:A0:乳状液0 min时的吸光度;ΔA:乳状液在0和10 min吸光度之差;Δt:吸取乳状液的间隔时间,10 min。

    根据杨虎等[17]的方法测定样品DPPH自由基清除能力。吸取2 mL 1 mg/mL样液与2 mL DPPH标准溶液混合,为样品组;2 mL样品液和2 mL无水乙醇混合,为对照组;2 mL无水乙醇和2 mL DPPH标准溶液混合,为空白组,3组反应液室温下避光反应20 min,于517 nm处测定吸光度,按照公式计算DPPH自由基清除率,结果以每克样品所具有的清除能力相当于多少毫克GSH计,单位为mg/g。

    DPPH(%)=(1A1A2A3)×100
    (6)

    式中:A1:样品组吸光度;A2:对照组吸光度;A3:空白组吸光度。

    根据邹容等[18]的方法测定样品的ABTS+自由基清除能力。将配制好的ABTS储备液在室温下避光反应12~16 h,用无水乙醇稀释,使其在734 nm处吸光度为0.7±0.02,得ABTS工作液。取0.1 mL 1 mg/mL样液与3.9 mL工作液混合,室温避光反应10 min于734 nm处测定吸光度。同时,用蒸馏水代替样品做同样处理作为空白对照。按照公式计算样品的ABTS+自由基清除率,结果以每克样品所具有的清除能力相当于多少毫克GSH计,单位为mg/g。

    ABTS+(%)=(A0A1A0)×100
    (7)

    式中:A0:空白对照组吸光度;A1:样品组吸光度。

    根据秦丹丹[19]的方法测定样品总还原力。取1 mL 1 mg/mL样液与2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)、2 mL 1%铁氰化钾溶液混匀,50 ℃水浴20 min,快速冷却后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液,混匀后4000 r/min离心10 min。吸取2 mL上清液和2 mL蒸馏水、0.4 mL 0.1%三氯化铁溶液混合,室温反应10 min。以蒸馏水作为空白,在700 nm处测吸光度值。结果以每克样品所具有的清除能力相当于多少毫克GSH计,单位为mg/g。

    根据Laemmli[20]的方法测定样品分子量,具体实验步骤如下:根据表1制备12%分离胶和5%浓缩胶。将分离胶和浓缩胶先后灌入制胶器,待凝固后,将胶体放置于装有电极缓冲液的电泳槽中,浸泡10 min左右,小心拔出梳子。吸取1 mL样品溶液分别与1 mL未含β-巯基乙醇和含有β-巯基乙醇的样品缓冲液混合,沸水浴5 min,于12000 r/min离心2 min,取20 µL上样。保持电压80 V持续电泳,直到样品距离底部0.5~1 cm处停止电泳。电泳结束后,小心取出分离胶于考马斯亮蓝(G-250)染液中。染色结束后,将分离胶转移至脱色缸,使用提前配制的甲醇-冰乙酸脱色液脱色,直到凝胶上蛋白分子量条带清晰可见。

    表  1  分离胶和浓缩胶的制备
    Table  1.  Preparation of the separating gel and stracking gel
    试剂名称12%浓缩胶(mL)5%浓缩胶(mL)
    H2O3.355.675
    30%凝胶储备液41.665
    分离胶缓冲液2.50
    浓缩胶缓冲液02.5
    10%SDS0.10.1
    TEMED0.0050.01
    10%过硫酸铵0.050.05
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    根据Xiong等[21]的方法测定样品本征荧光光谱。将未加花青素的蛋白溶液和复合物溶液均稀释至蛋白浓度为0.5 mg/mL,固定激发波长为280 nm,狭缝宽度为5 nm,连续扫描记录300~500 nm范围内的发射光谱,即为复合物的本征荧光光谱。

    将未加花青素的蛋白溶液和复合物溶液稀释均至蛋白浓度为1 mg/mL,在200~400 nm范围内进行紫外吸收光谱扫描,得紫外吸收光谱。

    所有试验均重复进行3次,结果以平均值±标准差表示。所有的数据使用SPSS Statistics 18.0进行ANOVA差异显著性分析及相关性分析,当P<0.05时,差异性显著。处理完毕后用Origin 8.0作图。

    表2可知,pH在3~11范围内变化时,随着pH的升高,翅果油粕蛋白对DPPH自由基的清除能力逐渐增强,酶解蛋白清除DPPH的能力呈先增强后降低的趋势,且在pH7时最大,GSH当量值为30.05 mg/g,远高于相同pH条件下的翅果油粕蛋白。酶解蛋白的抗氧化能力强,这是由于小分子肽获得氢离子的可用性强[22]。即与天然蛋白相比,小分子量的酶解蛋白终止自由基链式反应能力更强。加入花青素修饰蛋白结构后,形成的花青素-蛋白结合复合物的DPPH自由基清除能力均有所提高,其中花青素-翅果油粕蛋白复合物在pH7制备条件下的DPPH自由基清除能力最强,GSH当量值为43.46 mg/g;花青素-酶解蛋白复合物在pH3制备条件下的DPPH自由基清除能力最强,GSH当量值为142.17 mg/g。为进一步考察花青素添加量对花青素-翅果油粕蛋白复合物和花青素-酶解蛋白复合物的抗氧化能力、功能性质和结构特性的影响,分别选取花青素-翅果油粕蛋白复合物和花青素-酶解蛋白复合物的DPPH自由基清除能力最强的pH制备条件,即pH7和pH3,作为下一步试验的结合pH条件。

    表  2  不同pH条件下花青素与蛋白和酶解产物复合物DPPH自由基清除能力
    Table  2.  DPPH radicial scavenging ability of complexes with protein and hydrolysate under different pH conditions
    pHGSH当量(mg/g)
    翅果油粕蛋白花青素-翅果油粕
    蛋白复合物
    酶解蛋白花青素-酶解
    蛋白复合物
    312.14±2.42b27.60±5.58c29.75±2.05a142.17±13.31a
    512.12±0.49b39.45±0.58ab26.72±0.65a99.14±2.14b
    712.83±3.98b43.46±0.45a30.05±1.40a98.97±3.51b
    915.10±0.30b27.58±2.99c15.12±1.11b78.57±1.78c
    1127.66±0.40a31.21±8.08bc13.22±1.23b72.69±4.81c
    注:表中小写字母不同,表示同列样品间的差异显著(P<0.05);表3同。
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    在pH3和pH7条件下复合物的溶解性如图1所示,由于酶解蛋白较翅果油粕蛋白溶解度更强,花青素-酶解蛋白复合物较花青素-翅果油粕蛋白复合物也具有更好的溶解性。随着花青素质量浓度的而增大,两种复合物的溶解性均有一定程度的降低。Prigent等[23]研究也有相同结果,添加原花青素后,蛋白质溶解度降低,其原因是带电荷的多酚类物质的附着可能会改变蛋白质的电性,从而导致蛋白质溶解性的降低。

    图  1  pH3(A)和 pH7(B)条件下的复合物溶解度
    注:图中小写字母不同,表示差异显著(P<0.05);图2~图3同。
    Figure  1.  Solubility of complex at pH3 (A) and pH7 (B)

    泡沫是分散在气液界面连续相中的亚稳态体系,受到蛋白质溶解度,表面性质和结构构象的影响[24]。花青素-蛋白复合物的起泡性能如图2所示,在pH3和pH7条件下,复合物比未添加花青素的蛋白具有更好的起泡性。pH7,花青素质量浓度0.1%的条件下,花青素-酶解蛋白复合物的起泡性和起泡稳定性达到最大值,分别为157.54%和93.60%。起泡性和起泡稳定性的改善可能是由于多酚与蛋白质形成复合物后固有黏度提高,导致排水速度降低,起泡稳定性增强[25]。多酚与蛋白相互作用导致界面膜结构改变,进而增强了起泡性能[26]

    图  2  pH3(A, C)和pH7(B, D)条件下的复合物起泡性和起泡稳定性
    Figure  2.  Foaming property and foaming stability of complex at pH3 (A, C) and pH7 (B, D)

    图3所示,在pH3制备条件下,复合物的乳化性高于未加花青素的蛋白,而对于酶解蛋白,复合花青素对于乳化性并未有明显的影响。在pH7制备条件下,复合物的乳化性能高于未加花青素的蛋白。在pH7制备条件下,花青素质量浓度0.1%的条件下,花青素-酶解蛋白复合物的乳化性和乳化性能稳定性较好,分别提高至156.60%和81.48%。复合物乳化性能的提升,可能是由于多酚羟基与蛋白质残基结合,改变了蛋白质的构象,导致更多的疏水基团暴露,结合油滴的能力增强,从而增强了乳化性能[25]。综上所述,花青素结合法与酶水解法的协同作用能有效地提高复合物的功能性质。

    图  3  pH3(A,C)和pH7(B,D)条件下的复合物乳化性和乳化稳定性
    Figure  3.  Emulsibility and emulsion stability of complex at pH3 (A, C) and pH7 (B, D)

    花青素对翅果油粕蛋白及酶解蛋白抗氧化能力的影响如表3所示,花青素-蛋白复合物的抗氧化能力优于天然翅果油粕蛋白及其酶解蛋白,随着花青素质量浓度增大,复合物抗氧化能力逐渐增强。Almajano等[27]研究报道称当多酚与蛋白质相结合时,与苯环相连的自由羟基可发挥抗氧化能力。同时多酚与蛋白质形成更稳定的反应产物清除自由基。此外,花青素-翅果油粕蛋白复合物在pH7条件的抗氧化能力较强,结合溶解度推测,这是由于较pH3的制备条件而言pH7条件下蛋白及复合物的溶解度更大。而在pH3条件下制备的花青素-酶解蛋白复合物具有更强的抗氧化能力,这可能由于在酸性条件下,花青素结构稳定,表现出较强的抗氧化能力。Li等[28]对不同pH条件下大米蛋白与花青素结合的研究结果相同,在pH3条件下,大米蛋白与花青素结合后具有最强的抗氧化能力,蛋白质二级结构表明pH3条件下大米蛋白具有更强的柔韧性和未折叠的结构,更容易与DPPH和ABTS+自由基反应。综上所述,通过酶解和花青素结合协同作用,在pH3条件下,向酶解翅果油粕蛋白中添加0.1%质量浓度的花青素制备花青素-酶解蛋白复合物可显著的提高翅果油粕蛋白的抗氧化性能。

    表  3  pH3和pH7复合物的抗氧化能力(mg GSH·g−1
    Table  3.  Antioxidant capacity of complex at pH3 and pH7 (mg GSH·g−1)
    样品 pH3.0 pH7.0
    DPPH抗氧化能力 ABTS抗氧化能力 总还原力 DPPH抗氧化能力 ABTS抗氧化能力 总还原力
    P 12.35±3.80c 15.20±4.72d 20.70±1.53d 20.62±3.36c 22.60±0.68d 20.47±0.91d
    0.025% A-P 29.24±4.31b 49.78±3.19c 35.95±0.11c 54.70±0.23b 51.45±4.63c 42.76±0.06c
    0.05% A-P 36.29±6.07b 66.55±3.43b 43.27±0.53b 77.09±1.00a 72.39±0.09b 44.77±0.06b
    0.1% A-P 73.67±1.39a 78.78±0.40a 45.86±0.20a 80.34±0.27a 92.61±0.25a 55.38±0.25a
    EP 34.29±7.73d 34.08±1.31d 43.24±0.28d 30.34±0.5d 42.92±1.90d 42.28±0.55d
    0.025% A-EP 83.71±2.07c 111.07±4.06c 85.43±1.00c 65.94±5.41c 75.04±3.93c 80.96±0.28c
    0.05% A-EP 120.83±1.17b 153.04±4.31b 119.00±0.73b 103.22±0.21b 138.52±7.43b 96.46±0.55b
    0.1% A-EP 148.84±1.78a 181.71±9.00a 142.17±0.48a 141.70±0.05a 162.08±3.94a 133.22±1.11a
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    图4所示为利用SDS-PAGE研究与花青素结合后蛋白亚基的变化,复合物电泳结果图。在非还原和还原条件下,花青素-翅果油粕蛋白复合物在31.0~66.2 kDa的条带强度较翅果油粕蛋白均有所增强,而22.0~14.0 kDa之间的条带强度有所下降,且复合物均为出现新的蛋白条带;花青素-酶解蛋白复合物的条带强度较酶解蛋白也有所增强。这与Sui等[24]研究结果相同,蛋白与多酚通过非共价作用结合,未发生共价交联反应,没有形成股具体配合物,未改变蛋白质四级结构。因此,推测花青素通过疏水相互作用、氢键等非共价作用力,附着在蛋白质的多酚结合位点上,进一步证明了复合物的形成是由非共价作用驱动的。

    图  4  pH3(A,B)和pH7(C,D)条件下的复合物的电泳谱图
    注:电泳图从左往右分别为:M为标准marker;A、C代表非还原条件;B、D代表还原条件;1代表翅果油粕蛋白,2~4分别代表0.025%、0.05%、0.1%花青素蛋白复合物,5代表酶解产物,6~8分别代表0.025%、0.05%、0.1%花青素酶解产物复合物。
    Figure  4.  SDS-PAGE profiles of complex at pH3 (A, B) and pH7 (C, D)

    蛋白质的固有荧光是由于色氨酸和酪氨酸残基在280 nm的激发波长下发射荧光产生的,蛋白质构象的改变、亚基的结合和变性会引起发射光谱的变化[29],因此荧光光谱可用于研究花青素-蛋白复合物结构的变化[10]。在不同pH条件下,添加不同质量浓度花青素的翅果油粕蛋白及其酶解蛋白的内源荧光光谱如图5所示,随着花青素质量浓度的增加,荧光强度逐渐减弱,表明青素与蛋白质之间存在相互作用,促使蛋白质分子构象的改变,荧光强度减弱[30]。Li等[28]的研究呈现相同的结果,通过猝灭机理研究表明,花青素与蛋白之间通过疏水相互作用和氢键结合,导致荧光静态猝灭。此外,随着花青素质量浓度的增大,两种花青素-复合物的最大发射波长均发生了蓝移,表明色氨酸与酪氨酸周围的微环境极性减小,疏水性增强,从而引起蛋白结构的变化[31]。结合紫外光谱分析,花青素与蛋白质结合导致蛋白质结构发生改变,改善了蛋白的功能性质。

    图  5  pH3(A,B)和pH7(C,D)条件下的复合物内源荧光光谱
    Figure  5.  Fluorescence spectra of the complex at pH3 (A, B) and pH7 (C, D)

    花青素与翅果油粕蛋白及其酶解蛋白复合物的紫外吸收光谱图如图6所示,两种花青素-蛋白复合物溶液在275 nm附近有明显的吸收峰,随着花青素质量浓度增大,复合物溶液紫外吸收带的强度增强,表明疏水氨基酸与花青素的芳香基团之间可能存在疏水相互作用[28]。此外,根据275 nm处的吸收峰是由于蛋白质分子中的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环π-π*跃迁引起的[29],这可能是由于花青素与蛋白质中的色氨酸残基结合,形成新的共轭体系,增加了π-π*跃迁所需能量,导致复合物的紫外吸收增强。紫外吸收光谱结果表明,花青素与翅果油粕蛋白及酶解蛋白之间通过相互作用形成了复合物,这与荧光光谱分析结果一致。

    图  6  pH3(A,B)和pH7(C,D)件下的复合物的紫外全波长扫描
    Figure  6.  UV of the complex at pH3 (A, B) and pH7 (C, D)

    本文研究了花青素结合对翅果油粕蛋白及其酶解蛋白功能性质、结构性质和抗氧化活性的影响。实验结果表明,花青素结合法可有效的改善翅果油粕蛋白及其酶解蛋白的乳化性能,起泡性能和抗氧化能力。这可能是由于花青素与蛋白存在氢键和疏水作用等非共价作用,形成了复合物,导致蛋白质结构发生变化,提高了蛋白质的功能性质。随添加花青素质量浓度的增大,复合物的乳化性,乳化稳定性,起泡性,起泡稳定性和抗氧化能力不断增强。且花青素-酶解蛋白复合物的功能性质和抗氧化能力强于花青素-翅果油粕蛋白复合物,远高于翅果油粕蛋白。以上结论表明,花青素结合法和酶水解协同作用能够进一步改善翅果油粕蛋白的功能性质和抗氧化能力,为翅果油粕蛋白的高效利用提供了一定的科学依据。

  • 图  1   pH3(A)和 pH7(B)条件下的复合物溶解度

    注:图中小写字母不同,表示差异显著(P<0.05);图2~图3同。

    Figure  1.   Solubility of complex at pH3 (A) and pH7 (B)

    图  2   pH3(A, C)和pH7(B, D)条件下的复合物起泡性和起泡稳定性

    Figure  2.   Foaming property and foaming stability of complex at pH3 (A, C) and pH7 (B, D)

    图  3   pH3(A,C)和pH7(B,D)条件下的复合物乳化性和乳化稳定性

    Figure  3.   Emulsibility and emulsion stability of complex at pH3 (A, C) and pH7 (B, D)

    图  4   pH3(A,B)和pH7(C,D)条件下的复合物的电泳谱图

    注:电泳图从左往右分别为:M为标准marker;A、C代表非还原条件;B、D代表还原条件;1代表翅果油粕蛋白,2~4分别代表0.025%、0.05%、0.1%花青素蛋白复合物,5代表酶解产物,6~8分别代表0.025%、0.05%、0.1%花青素酶解产物复合物。

    Figure  4.   SDS-PAGE profiles of complex at pH3 (A, B) and pH7 (C, D)

    图  5   pH3(A,B)和pH7(C,D)条件下的复合物内源荧光光谱

    Figure  5.   Fluorescence spectra of the complex at pH3 (A, B) and pH7 (C, D)

    图  6   pH3(A,B)和pH7(C,D)件下的复合物的紫外全波长扫描

    Figure  6.   UV of the complex at pH3 (A, B) and pH7 (C, D)

    表  1   分离胶和浓缩胶的制备

    Table  1   Preparation of the separating gel and stracking gel

    试剂名称12%浓缩胶(mL)5%浓缩胶(mL)
    H2O3.355.675
    30%凝胶储备液41.665
    分离胶缓冲液2.50
    浓缩胶缓冲液02.5
    10%SDS0.10.1
    TEMED0.0050.01
    10%过硫酸铵0.050.05
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    表  2   不同pH条件下花青素与蛋白和酶解产物复合物DPPH自由基清除能力

    Table  2   DPPH radicial scavenging ability of complexes with protein and hydrolysate under different pH conditions

    pHGSH当量(mg/g)
    翅果油粕蛋白花青素-翅果油粕
    蛋白复合物
    酶解蛋白花青素-酶解
    蛋白复合物
    312.14±2.42b27.60±5.58c29.75±2.05a142.17±13.31a
    512.12±0.49b39.45±0.58ab26.72±0.65a99.14±2.14b
    712.83±3.98b43.46±0.45a30.05±1.40a98.97±3.51b
    915.10±0.30b27.58±2.99c15.12±1.11b78.57±1.78c
    1127.66±0.40a31.21±8.08bc13.22±1.23b72.69±4.81c
    注:表中小写字母不同,表示同列样品间的差异显著(P<0.05);表3同。
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    表  3   pH3和pH7复合物的抗氧化能力(mg GSH·g−1

    Table  3   Antioxidant capacity of complex at pH3 and pH7 (mg GSH·g−1)

    样品 pH3.0 pH7.0
    DPPH抗氧化能力 ABTS抗氧化能力 总还原力 DPPH抗氧化能力 ABTS抗氧化能力 总还原力
    P 12.35±3.80c 15.20±4.72d 20.70±1.53d 20.62±3.36c 22.60±0.68d 20.47±0.91d
    0.025% A-P 29.24±4.31b 49.78±3.19c 35.95±0.11c 54.70±0.23b 51.45±4.63c 42.76±0.06c
    0.05% A-P 36.29±6.07b 66.55±3.43b 43.27±0.53b 77.09±1.00a 72.39±0.09b 44.77±0.06b
    0.1% A-P 73.67±1.39a 78.78±0.40a 45.86±0.20a 80.34±0.27a 92.61±0.25a 55.38±0.25a
    EP 34.29±7.73d 34.08±1.31d 43.24±0.28d 30.34±0.5d 42.92±1.90d 42.28±0.55d
    0.025% A-EP 83.71±2.07c 111.07±4.06c 85.43±1.00c 65.94±5.41c 75.04±3.93c 80.96±0.28c
    0.05% A-EP 120.83±1.17b 153.04±4.31b 119.00±0.73b 103.22±0.21b 138.52±7.43b 96.46±0.55b
    0.1% A-EP 148.84±1.78a 181.71±9.00a 142.17±0.48a 141.70±0.05a 162.08±3.94a 133.22±1.11a
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  • [1] 梁月. 翅果油树( Elaeagnus mollis Diels)简介[J]. 国际沙棘研究与开发,2012,10(2):21

    LIANG Y. An introduction to the samara oil tree ( Elaeagnus mollis Diels)[J]. International Seabuckthorn Research and Development,2012,10(2):21.

    [2] 国家环境保护局, 中科院植物所. 中国珍稀濒危保护植物名录[M]. 北京:科学出版社, 1987(7):23−28

    State Environmental Protection Administration, Chinese Academy of Sciences, State Environmental Protection Administration. List of rare and endangered protected plants in China[M]. Beijing:Science Press, 1987(7):23−28.

    [3] 冯宝英, 杨坪荣. 翅果油树种仁化学成分分析研究[J]. 山西林业科技,1989(4):6−9

    FENG B Y, YANG P R. Study on chemical constituents of seed kernel of Elaeagnus mollis[J]. Shanxi Forestry Science and Technology,1989(4):6−9.

    [4] 冯笑笑. 翅果油树种仁蛋白制备及其活性肽研究[D]. 太原:山西大学, 2017

    FENG X X. Study on protein preparation and active peptides from Elaeagnus mollis Diels seed kernels[D]. Taiyuan:Shanxi University, 2017.

    [5] 冯笑笑, 李娟, 陈侨侨, 等. 翅果油树种仁蛋白氨基酸组成分析及营养价值评价[J]. 食品科学,2016,37(22):160−165 doi: 10.7506/spkx1002-6630-201622024

    FENG X X, LI J, CHEN J J, et al. Amino acid composition and nutritional evaluation of proteins extracted from Elaeagnus mollis Diels seed kernels[J]. Food Science,2016,37(22):160−165. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201622024

    [6] 林巍, 翟丽萍, 刘晓兰, 等. 酶解对紫花芸豆清蛋白功能性质的影响[J]. 食品工业,2019,40(7):163−166

    LIN W, ZHAI L P, LIU X L, et al. Effects of hydrolysis on functional properties of albumin from purple kidney bean[J]. The Food Industry,2019,40(7):163−166.

    [7]

    XU X F, WEI L, LIU C M, et al. Effect of limited enzymatichydrolysis on structure and emulsifying properties of rice glutelin[J]. Food Hydrocolloids,2016,61:251−260. doi: 10.1016/j.foodhyd.2016.05.023

    [8] 李杨, 孙红波, 董济萱, 等. 花青素与大豆分离蛋白非共价/共价作用对其界面功能性质的影响[J]. 食品科学,2018,39(6):32−38 doi: 10.7506/spkx1002-6630-201806006

    LI Y, SUN H B, DONG J X, et al. Effects of non-covalent/covalent Interactions between anthocyanins and soybean protein isolate on its interfacial function[J]. Food Science,2018,39(6):32−38. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201806006

    [9]

    THUMMANOON P, SOOTTAWAT B, SUTTING P. Effect of phenolic compounds on protein cross-linking and properties of film from fish myofibrillar protein[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2012,51(5):774−782. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2012.07.010

    [10]

    LI J, WANG B, HE Y, et al. A review of the interaction between anthocyanins and proteins[J]. Food Science and Technology International,2021,27(5):470−482. doi: 10.1177/1082013220962613

    [11]

    RAHAT U, MEHTAB K, SHAHID A, et al. Natural Antioxidant anthocyanins a hidden therapeutic candidate in metabolic disorders with major focus in neurodegeneration[J]. Nutrients,2019,11(6):1195. doi: 10.3390/nu11061195

    [12]

    LI C H, DAI T T, CHEN J, et al. Protein-polyphenol functional ingredients:The foaming properties of lactoferrin are enhanced by forming complexes with procyanidin[J]. Food Chemistry,2021,339:128145. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.128145

    [13]

    PU J, GIUSTI M M. Characterization of anthocyanin-rich waste from purple corncobs (Zea mays L.) and its application to color milk[J]. Agricultural and. Food Chemistry, 2005, 53 (22): 8775–8781.

    [14]

    LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent[J]. The Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):265−275. doi: 10.1016/S0021-9258(19)52451-6

    [15]

    SZE-TAO K W C, SATHE S K. Functional properties and in vitro digestibility of almond (Prunus dulcis L.) protein isolate[J]. Chemical Communications, 2000, 69(2):153−160.

    [16]

    KEVIN N P, JOHN E K. Emulsifying properties of proteins:Evaluation of a turbidimetric technique[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1978,26(3):716−723. doi: 10.1021/jf60217a041

    [17] 杨虎, 张生堂, 高国强. 玫瑰黄酮的提取及其清除DPPH自由基活性研究[J]. 食品科学,2012,33(24):152−155 doi: 10.7506/spkx1002-6630-201224031

    YANG H, ZHANG S T, GAO G Q. Extraction and DPPH radical scavenging activity of flavonoids from rose flower buds[J]. Food Science, 2012,33(24):152−155. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201224031

    [18] 邹容, 游玉明, 陈泽雄, 等. 干燥方式对金银花多酚组分及其抗氧化活性的影响[J]. 食品科学,2016,37(5):78−83

    ZHOU R, YOU Y M, CHEN Z X, et al. Extraction and DPPH radical scavenging activity of flavonoids from rose flower buds[J]. Food Science,2016,37(5):78−83.

    [19] 秦丹丹. 干制方式对无花果品质的影响及无花果茶的研制[D]. 太原:山西大学, 2018

    ZHOU R, YOU Y M, CHEN Z X, et al. Effects of drying methods on quality of Ficus carica L. fruit and preparation of fig tea[D]. Taiyuan:Shanxi University, 2018.

    [20]

    LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-t4[J]. Nature,1970,227(5259):680−685. doi: 10.1038/227680a0

    [21]

    XIONG T, XIONG W, GE M, etal. Effect of high intensity ultrasound on structure and foaming properties of pea protein isolate[J]. Food Research International,2018,109:260−267 doi: 10.1016/j.foodres.2018.04.044

    [22]

    GUAN, H N, DIAO X Q, JIANG F, et al. The enzymatic hydrolysis of soy protein isolate by corolase pp under high hydrostatic pressure and its effect on bioactivity and characteristics of hydrolysates[J]. Food Chemistry,2018,245(15):89−96.

    [23]

    PRIGENT S, VORAGEN A, KONINGSVELD G, et al. Interactions between globular proteins and procyanidins of different degrees of polymerization[J]. Journal of Dairy Science,2009,92(12):5843−5853. doi: 10.3168/jds.2009-2261

    [24]

    SUI X N, SUN H B, QI B K, et al. Functional and conformational changes to soy proteins accompanying anthocyanins:Focus on covalent and non-covalent interactions[J]. Food Chemistry,2017,245(15):871−878.

    [25]

    ZHAO Y, WANG X, LI D, et al. Effect of anionic polysaccharides on conformational changes and antioxidant properties of protein-polyphenol binary covalently-linked complexes[J]. Process Biochemistry,2020,89:89−97. doi: 10.1016/j.procbio.2019.10.021

    [26]

    SILVIO R D, MARIANA V S, ANA M R P. Green tea polyphenols-whey proteins nanoparticles:Bulk, interfacial and foaming behavior[J]. Food Hydrocolloids,2015,50:108−115.

    [27]

    ALMAJANO M P, DELGADO M E, GORDON M H. Changes in the antioxidant properties of protein solutions in the presence of epigallocatechin gallate[J]. Food Chemistry,2007,101(1):126−130.

    [28]

    LI T, WANG L, CHEN Z X, et al. Functional properties and structural changes of rice proteins with anthocyanins complexation[J]. Food Chemistry,2020,331:127336. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127336

    [29] 赵旭红, 夏彩芬, 周紫薇, 等. 花青素对牛血清白蛋白的光谱特性及构象的影响[J]. 食品工业科技,2021(3):1−14 doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020060126

    ZHAO X H, XIA C F, ZHOU C W, et al. Effects of anthocyanins on spectral properties and conformation of bovine serum album[J]. Science and Technology of Food Industry,2021(3):1−14. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020060126

    [30]

    HE W J, MU H B, LIU Z M, et al. Effect of preheat treatment of milk proteins on their interactions with cyanidin-3-O-glucoside[J]. Food Research International,2018,107:394−405. doi: 10.1016/j.foodres.2018.02.064

    [31]

    JIANG L Z, LIU Y J, LI L, et al. Covalent conjugates of anthocyanins to soy protein:Unravelling their structure features and in vitro gastrointestinal digestion fate[J]. Food Research International,2019,120:603−609. doi: 10.1016/j.foodres.2018.11.011

图(6)  /  表(3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-10-18
  • 网络出版日期:  2023-08-20
  • 刊出日期:  2023-10-11

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