Optimization of the Extraction Process of Highland Barley β-glucan by Three-phase Partitioning and Its Molecular Weight Distribution
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摘要: 采用超声波结合酶法预处理辅助三相分配法（UCWEPATPP）同时提取青稞中的青稞β-葡聚糖、青稞蛋白和青稞油。在单因素实验的基础上，以青稞β-葡聚糖提取率为指标，通过响应面试验优化UCWEPATPP的提取工艺条件。再使用扫描电镜（SEM）观察青稞提取过程中表面结构的变化，初步分析UCWEPATPP的提取机制。最后，使用高效凝胶排阻色谱仪对得到的青稞β-葡聚糖分子量范围进行测定。结果表明，最佳的UCWEPATPP工艺条件为酶添加量1.0%、超声时间9 min、超声功率140 W、硫酸铵添加量0.5 g/mL、三相提取温度35 ℃、三相提取时间1.5 h、料液比1:14 g/mL、叔丁醇与水相体积比1.3:1，酶解时间2.0 h。在此最优条件下，青稞β-葡聚糖提取率为66.96%±0.05%，青稞油提取率为81.42%±0.15%，青稞蛋白提取率为50.31%±0.23%。扫描电镜结果表明，UCWEPATPP使青稞表面组织结构变得通透、多孔。UCWEPATPP不仅能够同时提取青稞β-葡聚糖、青稞蛋白和青稞油，而且能够降低生产成本，提高青稞资源的利用率。该提取工艺的实际值与预测值拟合度较高，可用于预测青稞β-葡聚糖的提取，且得到的青稞β-葡聚糖分子量范围分布较为集中（1.7×105~3.0×105 Da）。Abstract: Ultrasonic combined with enzymatic pretreatment-assisted three-phase partitioning (UCWEPATPP) was utilized to simultaneously extract the β-glucan, protein and oil from highland barley (Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.). Based on the single-factor experiments, the extraction process conditions of UCWEPATPP were optimized by response surface methodology (RSM) with the extraction rate of highland barley β-glucan as the index. Scanning electron microscope (SEM) was used to observe the change of surface structure during the extraction of highland barley, and the extraction mechanism of UCWEPATPP was preliminarily analyzed. Finally, the molecular weight range of the obtained highland barley β-glucan was determined using a high performance gel size exclusion chromatography. The results showed that the optimal UCWEPATPP process conditions were as follows: Enzyme addition was 1.0%, ultrasonic time was 9 min, ultrasonic power was 140 W, ammonium sulfate addition was 0.5 g/mL, three-phase extraction temperature was 35 ℃, three-phase extraction time was 1.5 h, the liquid ratio was 1:14 g/mL, the volume ratio of tert-butanol to aqueous phase was 1.3:1, the enzymatic hydrolysis time was 2.0 h. Under the optimal conditions, the extraction rate of highland barley β-glucan was 66.96%±0.05%, the extraction rate of highland barley oil was 81.42%±0.15%, and the extraction rate of highland barley protein was 50.31%±0.23%. Scanning electron microscope results showed that UCWEPATPP made the surface tissue structure of highland barley become transparent and porous. UCWEPATPP not only could extract highland barley β-glucan, protein and oil at the same time, but also could reduce the production cost and improve the utilization of highland barley resources. The actual value of the extraction process and the predicted value had a high degree of fit, which was used to predict the extraction of highland barley β-glucan. In addition, the obtained highland barley β-glucan had a relatively concentrated molecular weight distribution (1.7×105~3.0×105 Da).
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青稞（Hordeum vulgare L .var.nudum Hook.f.）属禾本科小麦族大麦属一年生草本植物，广泛种植于西藏、青海以及甘肃等地区[1-2]。在我国，青稞常被研磨成青稞粉并作为食物成分添加到面条、面包、饼干和休闲食品中[3]。青稞具有一般谷物所不具备的诸多优势（高蛋白、低糖、高维生素），且富含黄酮、β-葡聚糖、青稞油等活性物质[4]。有研究表明青稞β-葡聚糖具有较为显著的辅助降血糖作用，可将其作为一种新食品原料应用于饮料中[5]。青稞蛋白与红景天苷结合后具有较强的抗氧化能力[6]。此外，通过超临界CO2技术萃取制得的青稞麸皮油可以调节实验性高血脂症大鼠的血脂水平，预防动脉粥样硬化的发生，具有较强的开发潜力和应用价值[7]。
传统提取青稞β-葡聚糖的方法主要有冷凝回流提取、碱提醇沉提取、微波辅助提取、酶法提取和超声波提取等，但都存在提取时间较长或产品得率不高的缺点[8-10]。酶法提取是利用特异性的生物酶对物料细胞壁进行酶解，快速释放出物料中的有效成分，具有提取得率高、绿色环保等优点[11]。超声波提取利用超声波与物料的机械摩擦、空化、解聚、放热等作用，使物料在提取溶剂中瞬间产生的空穴崩解，细胞破碎，从而加快细胞胞内外的物质交换效率，缩短生产操作时间[12]。三相分配法是一种将粗提物或悬浮液与固体盐和有机溶剂混合，同时形成三个不同相（上层相为叔丁醇层，主要含有脂类、色素等非极性化合物，中间沉淀相为蛋白质层，下层水相为水层，含有一些极性化合物，如多糖）的提取方法，因其具有安全、绿色、高效、适用性强且工业生产成本低等优势，已被应用于从天然产物中同时提取和纯化酶、脂类、蛋白质、多糖等目标物质[13]。
目前，国内外研究主要集中于对青稞中的β-葡聚糖、蛋白质或油脂等单一有效成分进行提取，而少有同时提取三种活性成分的工艺报道出现。若能使用三相分配法对青稞中的β-葡聚糖、蛋白质和油脂进行同时提取，不仅可以提高青稞资源的利用率，还能降低生产成本，增加产品经济效益。因此，本课题组结合超声波结合酶法和三相分配法的优点，利用超声波结合酶法预处理辅助三相分配法同时提取青稞中的β-葡聚糖、蛋白质和油脂，并以青稞β-葡聚糖提取率为指标通过单因素实验和响应面试验对超声波结合酶法预处理辅助三相分配法的提取工艺进行优化，为同时提取青稞β-葡聚糖、青稞蛋白和青稞油提供参考，也为青稞的精深加工和综合利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
青稞（带皮） 纳曲青稞酒业有限公司，品种为喜玛拉22号；β-葡聚糖标准品（纯度≥95%） Sigma公司；α-淀粉酶（酶活力≥5000 U/g，A109182） 阿拉丁有限公司；纤维素酶（酶活力≥50000 U/g，327T011） 索莱宝科技有限公司；混联β-葡聚糖检测试剂盒 Megazyme公司；叔丁醇、硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白（BSA） Sigma-Aldrich公司。
TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用有限公司；AB135-S分析天平 梅特勒-托利多公司；DAWN高效凝胶排阻色谱仪 美国怀亚特技术公司；JY98-IIIN触摸式超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；JSM-6701F场发射扫描电镜 日本电子公司。
1.2 实验方法
1.2.1 青稞前处理
参考邓俊琳等[14]的研究，称取适量的青稞（带皮），粉碎后过80目筛，收集筛下物。
1.2.2 青稞基本成分的测定
青稞中粗脂肪含量测定参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；粗蛋白含量测定参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；β-葡聚糖含量的测定参照邓俊琳等[14]的方法；灰分含量的测定参照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；水分含量的测定参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。
1.2.3 超声波结合酶法预处理辅助三相分配法（UCWEATPP）同时提取β-葡聚糖、青稞蛋白和青稞油
精确称取50 g青稞粉和0.5 g复合酶（α-淀粉酶:纤维素酶=1:1）于5000 mL三口圆底烧瓶中，然后加入到10倍体积的纯净水，摇匀，水浴升温至55 ℃后用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节pH至6.0，酶解一段时间，再升温反应体系至95 ℃灭活酶，静置冷却后使用超声探头在一定功率下超声一段时间，然后加入200 g硫酸铵和750 mL叔丁醇，在30 ℃水浴锅中动态提取1.5 h。最后在20 ℃条件下以9000 r/min转速离心10 min，得到分层的三相。分别分离并处理三相得到β-葡聚糖、青稞蛋白和青稞油。
1.2.4 UCWEATPP单因素实验
精确称取50 g青稞粉，参考姚思含等[15]的方法并结合课题组预实验的结果设定料液比1:10 g/mL，叔丁醇与水相的体积比1:1，酶添加量1.2%，酶解时间1.5 h，超声时间9 min，超声功率160 W，硫酸铵添加量0.4 g/mL，三相提取温度35 ℃，三相提取时间1.5 h为青稞β-葡聚糖单因素提取实验过程中的固定条件。以料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL），叔丁醇与水相体积比（0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1），酶添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%），酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），超声时间（3、6、9、12、15 min），超声功率（120、140、160、180、200 W），硫酸铵添加量（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/mL），三相提取温度（20、25、30、35、40 ℃），三相提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）9个变量分别替代单因素实验中的相应常规变量，从而研究各个因素对青稞β-葡聚糖提取率的影响。
1.2.5 Plackett-Burman试验筛选影响青稞β-葡聚糖提取率的关键因素
根据1.2.4中单因素实验的结果，以青稞β-葡聚糖提取率为响应值，对料液比、叔丁醇与水相体积比、酶添加量、酶解时间、超声时间、超声功率、硫酸铵添加量、三相提取温度、三相提取时间9个变量进行筛选，并在每个单因素中设定最低（−1）和最高（1）两个水平，共计进行12组实验。Plackett-Burman试验各个因素及水平情况见下表1。
表 1 Plackett-Burman试验因素水平Table 1. Factors and levels of Plackett-Burman experimental因素 编号 低水平（−1） 高水平（1） 料液比（g/mL） X1 1:10 1:20 叔丁醇与水相体积比 X2 1:1 2:1 酶添加量（%） X3 0.8 1.2 酶解时间（h） X4 1.5 2.5 超声时间（min） X5 6 12 超声功率（W） X6 120 160 硫酸铵添加量（g/mL） X7 0.4 0.6 三相提取温度（℃） X8 30 40 三相提取时间（h） X9 1.0 2.0 1.2.6 响应面试验优化UCWEPATPP提取工艺
参考姚思含等[15]的方法，按公式（1）计算青稞油提取率：
依据Plackett-Burman试验结果，选取料液比（A）、叔丁醇与水相体积比（B）和酶解时间（C）为自变量，设定青稞β-葡聚糖提取率为响应值，设计三因素三水平响应面优化试验，响应面试验设计表见下表2。
表 2 UCWEPATPP提取工艺响应面试验设计因素与水平Table 2. Factors and levels of response surface test for UCWEPATPP extraction process水平 A料液比（g/mL） B叔丁醇与水相体积比 C酶解时间（h） −1 1:10 1:1 1.5 0 1:15 1.5:1 2.0 1 1:20 2:1 2.5 1.2.7 青稞油提取率的测定
Y(%)=M1M2×100 (1) 式中：Y为青稞油提取率，%；M1为青稞油质量，g；M2为青稞粉中粗脂肪的质量，g。
1.2.8 青稞蛋白提取率测定
青稞蛋白提取率测定参照Wang等[16]的方法。以BSA为对照品建立标准回归方程，采用考马斯亮蓝G-250法测定青稞蛋白样品中蛋白质含量。计算公式见公式（2）。
Y1(%)=A1A2×100 (2) 式中：Y1为青稞蛋白提取率，%；A1为UCWEPATPP提取获得的蛋白质样品中蛋白质质量，g；A2为青稞中粗蛋白的质量，g。
1.2.9 青稞β-葡聚糖提取率测定
按照邓俊琳等[14]的方法，称量UCWEPATPP提取获得的青稞β-葡聚糖样品，使用混联β-葡聚糖检测试剂盒测定。青稞β-葡聚糖提取率按公式（3）计算。
Y2(%)=B1B2×100 (3) 式中：Y2为青稞β-葡聚糖提取率，%；B1为UCWEPATPP提取获得的青稞β-葡聚糖样品中β-葡聚糖质量，g；B2为青稞中β-葡聚糖的质量，g。
1.2.10 扫描电镜观察
参考弘子姗等[17]的方法，分别将青稞粉原样（A）、青稞粉三相分离样品（B）、青稞粉酶解预处理后样品（C）、青稞粉酶解结合超声预处理后样品（D）、青稞粉酶解结合超声预处理辅助三相分配法提取后样品（E）放到导电胶上固定，吹去导电胶上多余的样品，然后在5.0 kV的电压下放大10000倍观察各样品的表面结构变化。
1.2.11 分子量测定
参考Hu等[18]的方法，使用高效凝胶排阻色谱仪对UCWEPATPP提取获得的青稞β-葡聚糖的分子量范围进行检测。首先，将样品用0.16 moL/L的NaNO3溶液溶解，超声10 min，过0.22 μm的微孔滤膜后上机检测。色谱条件：Shodex OHpak SB-803 HQ凝胶过滤色谱柱（8.0×300 mm，6 μm），流速0.5 mL/min，柱温：38 ℃，流动相：0.16 moL/L NaNO3溶液，进样量20 μL。
1.3 数据处理
所有实验重复测定3次，并通过软件SPSS20.0对实验数据进行显著性分析。使用Origin8.6进行图形绘制，并利用Design-Expert V8.0.6软件进行Plackett-Burman试验和响应面试验设计与数据分析。
2. 结果与分析
2.1 青稞基本成分
从表3中可以看出，喜玛拉22号带皮青稞水分和灰分均低于9%，粗脂肪含量为3.02%±0.08%，高于何伟[19]测定的青稞全粉中粗脂肪含量（2.51%），其粗蛋白质和β-葡聚糖含量高于阎莹莹等[20]测定的藏青27品种。以上结果说明喜玛拉22号青稞（带皮）具有脂肪、β-葡聚糖以及蛋白质含量高和无机物成分含量低的特点。
表 3 青稞基本成分和含量（%）Table 3. Basic composition and content of highland barley (%)基本成分 粗脂肪 粗蛋白质 β-葡聚糖 水分 灰分 青稞（带皮） 3.02±0.08 12.95±0.07 5.17±0.12 8.17±0.06 0.88±0.05 2.2 UCWEATPP单因素实验结果
2.2.1 料液比对青稞β-葡聚糖提取率的影响
由图1A可知，当料液比增加时，青稞β-葡聚糖的提取率不断提高，当料液比达到1:15 g/mL时青稞β-葡聚糖提取率达到最大，且继续提高提取溶剂比例时青稞β-葡聚糖提取率趋于稳定，无显著性差异（P>0.05）。当料液比较低时，溶液体系呈粘稠状态，影响物料与体系之间的传质效果，从而导致青稞β-葡聚糖提取率较低；但当料液比达到1:15 g/mL时继续提高提取溶剂比例，物料与体系之间传质趋于稳定，青稞β-葡聚糖提取率不再增加[21]。因此，UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖最佳料液比为1:15 g/mL。
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图 1 料液比（A）、叔丁醇与水相体积比（B）、酶添加量（C）、酶解时间（D）、超声时间（E）、超声功率（F）、硫酸铵添加量（G）、三相提取温度（H）以及三相提取时间（I）对青稞β-葡聚糖得率的影响注：不同字母（a~e）表示组内存在显著性差异（P<0.05）。Figure 1. Effect of solid-liquid ratio (A), volume ratio of tert-butanol to water phase (B), enzyme addition (C), enzymolysis time (D), ultrasonic time (E), ultrasonic power (F), addition of ammonium sulfate (G), three-phase extraction temperature (H) and three-phase extraction time (I) on yield of highland barley β-glucan2.2.2 叔丁醇与水相体积比对青稞β-葡聚糖提取率的影响
叔丁醇与水相体积比对青稞β-葡聚糖提取率的影响如图1B所示。随着叔丁醇与水相体积比的增加，青稞β-葡聚糖提取率呈现先增加后降低的趋势，且当叔丁醇与水相体积比为1.5:1时青稞β-葡聚糖提取率达到最高值67.20%。在三相分配理论中叔丁醇作为有机溶剂与物料中提取出的大分子物质结合，利用浮力差异使蛋白质从硫酸铵相中析出，同时溶解色素和油脂。如果叔丁醇与水相的体积比过低，则不能充分与硫酸铵发挥协同提取的作用，导致蛋白质和多糖提取率均较低。但是，如果叔丁醇与水相体积比过高，则会提高提取溶液体系中的粘度，从而使物料中有效成分迁移速率降低，导致青稞β-葡聚糖提取率下降[22]。因此，选取合适的叔丁醇与水相体积比是提高青稞β-葡聚糖提取率的有效方法。从图1B可知，叔丁醇与水相体积比为1.5:1较为合理。
2.2.3 酶添加量对青稞β-葡聚糖提取率的影响
从图1C可知，随着酶添加量的提高，青稞β-葡聚糖提取率呈现先升高后降低的趋势，当酶添加量达到1.0%时，青稞β-葡聚糖提取率达到最高值。这可能是由于酶的添加能有效破坏青稞的细胞壁，使得青稞β-葡聚糖的溶出率增加，但过量的酶具有一定的黏附性能，阻塞了青稞β-葡聚糖的溶出通道，导致其得率有所降低[23]。因此，最佳的酶添加量为1%。
2.2.4 酶解时间对青稞β-葡聚糖提取率的影响
图1D反映了酶解时间对青稞β-葡聚糖提取率的影响情况。随着酶解时间延长，青稞β-葡聚糖提取率先升高，在2 h时达到最高值67.61%，在超过2 h时提取率再次降低。因此，选择酶解时间为2 h。
2.2.5 超声时间对青稞β-葡聚糖提取率的影响
从图1E可知，青稞β-葡聚糖提取率随着超声时间延长呈现先升高后下降的趋势。这是因为随着超声时间延长，溶液体系温度升高，超声时间过长会造成过热现象，从而分解胞内目标物质[24]。因此，最佳的超声时间为9 min。
2.2.6 超声功率对青稞β-葡聚糖提取率的影响
图1F为超声功率对青稞β-葡聚糖提取率的影响情况趋势图。青稞β-葡聚糖提取率随着超声功率的提高呈现先升高后下降的趋势。过高的超声功率增强了超声波的振幅，加强了空化效应和剪切力，从而使溶液体系热量过大，可能导致青稞β-葡聚糖提取率降低[25]。因此，选择超声功率为140 W较为合理。
2.2.7 硫酸铵添加量对青稞β-葡聚糖提取率的影响
从图1G可以看出，青稞β-葡聚糖提取率随硫酸铵添加量的增加呈先升高后降低的趋势，当硫酸铵添加量达到0.5 g/mL时达到最高值，这可能是因为硫酸铵添加量高于0.5 g/mL时产生了较强的盐析效应使水相中较少的自由水可溶解青稞β-葡聚糖，硫酸铵絮凝青稞β-葡聚糖，导致其分配到中间相，降低了青稞β-葡聚糖的提取率[26]。因此，硫酸铵最佳添加量为0.5 g/mL。
2.2.8 三相提取温度对青稞β-葡聚糖提取率的影响
从图1H中可知，当三相提取温度从20 ℃上升到35 ℃时，青稞β-葡聚糖提取率逐渐升高，提高了12%左右。这可能是由于温度升高促使物料与溶剂间交换速率加快，从而提高了提取率。相反，当温度高于35 ℃时，提取率开始降低，这可能是由于较高的温度使叔丁醇挥发，从而使其在分离过程中的可用性下降，与硫酸铵的协同效应变弱，导致青稞β-葡聚糖提取率降低[27]。因此，三相提取温度选择35 ℃最佳。
2.2.9 三相提取时间对青稞β-葡聚糖提取率的影响
从图1I中可知，随着三相提取时间延长青稞β-葡聚糖提取率显著增加，提取时间1.5 h时达到最大值，之后随着提取时间的增加，提取率下降，这可能是因为长时间的提取会使青稞β-葡聚糖沉淀至中间相，最终导致多糖提取率降低[26]。因此，选择三相提取时间为1.5 h。
2.3 关键因素分析
利用Minitab17软件对Plackett-Burman试验（筛选试验）设计表（表4）中的相应数据进行多元回归方程分析，从而得到以青稞β-葡聚糖提取率为响应值的多元回归方程为：Y=46.89+6.81X1+7.38X2+3.53X3+8.15X4+3.85X5−3.13X6−0.81X7+0.11X8−2.43X9，另外各个因素的效应评价数据结果见表5。
表 4 Plackett-Burman试验各因素设计及响应值Table 4. Design and response values of Plackett-Burman test实验号 常数 料液比
（X1）叔丁醇与水相
体积比（X2）酶添加量
（X3）酶解时间
（X4）超声时间
（X5）超声功率
（X6）硫酸铵添加量
（X7）三相提取温度
（X8）三相提取时间
（X9）提取率
（Y，%）1 1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 25.13 2 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 43.06 3 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 26.89 4 1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 56.04 5 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 61.67 6 1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 23.52 7 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 65.41 8 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 47.22 9 1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 50.24 10 1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 67.40 11 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 43.25 12 1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 52.85 表 5 Plackett-Burman试验各因素效应评价Table 5. Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design因素 效应 系数 系数
标准误T值 P值 方差膨胀
因子显著性 常量 46.89 1.08 43.50 0.001 料液比
（g/mL，X1）13.62 6.81 1.08 6.32 0.024 1.00 * 叔丁醇与水相
体积比（X2）14.76 7.38 1.08 6.85 0.021 1.00 * 酶添加量
（%，X3）7.06 3.53 1.08 3.28 0.082 1.00 酶解时间
（h，X4）16.31 8.15 1.08 7.56 0.017 1.00 * 超声时间
（min，X5）7.70 3.85 1.08 3.57 0.070 1.00 超声功率
（W，X6）−6.26 −3.13 1.08 −2.91 0.101 1.00 硫酸铵添加量
（g/mL，X7）−1.62 −0.81 1.08 −0.75 0.531 1.00 三相提取温度
（℃，X8）0.22 0.11 1.08 0.10 0.928 1.00 三相提取时间
（h，X9）−4.86 −2.43 1.08 −2.25 0.153 1.00 注：R2=98.91%，R2Adj=94.01%；*表示有显著性差异（P<0.05）。 比较表5中各因素效应值的大小顺序可知，影响青稞β-葡聚糖提取率的各因素高低顺序是酶解时间（X4）>叔丁醇与水相体积比（X2）>料液比（X1）>超声时间（X5）>酶添加量（X3）>三相提取温度（X8）>硫酸铵添加量（X7）>三相提取时间（X9）>超声功率（X6）。同时结合P值的大小可知，料液比、叔丁醇与水相体积比以及酶解时间对青稞β-葡聚糖的提取率具有显著性影响（P<0.05），而酶添加量、超声时间、超声功率、硫酸铵添加量、三相提取温度和三相提取时间对青稞β-葡聚糖的提取率无显著性影响（P>0.05）。因此选择料液比、叔丁醇与水相体积比和酶解时间这三个对青稞β-葡聚糖提取率具有显著影响的因素进行三因素三水平响应面优化分析。综合以上数据结果并结合单因素实验情况，固定酶添加量1.0%、超声时间9 min、超声功率140 W、硫酸铵添加量0.5 g/mL、三相提取温度35 ℃和三相提取时间1.5 h。
2.4 响应面试验优化分析
2.4.1 响应面多元回归方程的建立
对表6中的响应面实验数据结果进行多元回归方程拟合，得到两个因素之间存在的交互作用对青稞β-葡聚糖提取率影响的等高线图以及3D响应面立体图（如图2所示），并获得以青稞β-葡聚糖提取率为响应值的多元回归方程：Y=66.47−1.48A−2.36B−0.16C−0.15AB−0.20AC−1.49BC−4.30A2−3.26B2−5.25C2。
表 6 青稞β-葡聚糖UCWEPATPP提取工艺条件响应面优化方案及结果Table 6. Response surface optimization scheme and results of extraction process conditions of highland barley β-glucan UCWEPATPP实验号 A B C Y青稞β-葡聚糖
提取率（%）1 −1 −1 0 63.21 2 0 0 0 67.62 3 0 0 0 66.50 4 −1 0 −1 58.32 5 1 0 −1 56.12 6 1 −1 0 60.20 7 0 1 −1 57.55 8 −1 1 0 57.92 9 0 −1 −1 58.43 10 0 1 1 54.51 11 1 0 1 55.13 12 0 0 0 66.01 13 1 1 0 54.31 14 0 0 0 65.21 15 −1 0 1 58.13 16 0 −1 1 61.36 17 0 0 0 67.03 ![]()
图 2 各因素之间交互作用对青稞β-葡聚糖提取率的影响Figure 2. Effects of interaction among various factors on the extraction rate of highland barley β-glucan2.4.2 响应面模型方差分析
对该响应面模型进行方差分析和显著性检验，其结果见表7。
表 7 响应面回归方程模型方差分析Table 7. Analysis of variance of response surface regression equation model来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 336.91 9 37.43 49.26 <0.0001 ** A 17.46 1 17.46 22.98 0.0020 ** B 44.70 1 44.70 58.82 0.0001 ** C 0.21 1 0.21 0.27 0.6170 AB 0.090 1 0.090 0.12 0.7408 AC 0.16 1 0.16 0.21 0.6602 BC 8.91 1 8.91 11.73 0.0111 * A2 77.88 1 77.88 102.49 <0.0001 ** B2 44.84 1 44.84 59.01 0.0001 ** C2 115.98 1 115.98 152.63 <0.0001 ** 残差 5.32 7 0.76 失拟项 1.88 3 0.63 0.73 0.5853 不显著 纯误差 3.44 4 0.86 总和 342.23 16 注：R2=98.45%，R2Adj=96.45%；*表示有显著性差异（P<0.05）；**表示有极显著性差异（P<0.01）。 从表7中可以看出，多元回归方程模型P<0.01并且失拟项P值=0.5853>0.05，说明该多元回归方程具有较高的拟合度，用来优化UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖可靠性强。模型的决定系数为R2=0.9845，校正决定系数为R2Adj=0.9645，表明使用该多元回归方程模型获得的优化实验结果具有较高的相关性和真实性。因此，可以使用该方程优化和预测青稞β-葡聚糖的提取率。表7中BC的P值小于0.05，说明对青稞β-葡聚糖提取率的影响显著（P<0.05）。图2叔丁醇与水相体积比与酶解时间交互作用3D图中，直观展示出叔丁醇与水相体积比和酶解时间对青稞β-葡聚糖提取率的响应曲线呈先升高后降低的趋势，青稞β-葡聚糖提取率最高点在1.5:1和2 h附近。通过响应面软件对最佳提取工艺条件进行预测，得到青稞β-葡聚糖提取的最佳工艺条件为料液比1:14.17 g/mL，叔丁醇与水相体积比为1.32:1，酶解时间为2.02 h，预测得到的青稞β-葡聚糖提取率最高为67.02%。考虑到生产实际操作情况，将最佳提取工艺最终确定为酶添加量1.0%、超声时间9 min、超声功率140 W、硫酸铵添加量0.5 g/mL、三相提取温度35 ℃、三相提取时间1.5 h、料液比1:14 g/mL、叔丁醇与水相体积比为1.3:1，酶解时间为2.0 h。在此条件下进行三次平行水平验证实验，青稞β-葡聚糖提取率为66.96%±0.05%，与多元回归方程得到的预测值相近。在确定的UCWEATPP最佳提取工艺条件下，采用喜玛拉22号青稞粉（带皮）提取得到青稞油提取率为81.42%±0.15%，青稞蛋白提取率为50.31%±0.23%。游茂兰等[28]利用超声-微波协同提取青稞麸皮β-葡聚糖得到最高提取得率为2.29%，通过其计算公式得到UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖提取得率为3.46%±0.1%，说明以喜玛拉22号带皮青稞为原料，并使用UCWEATPP提取能显著提高青稞β-葡聚糖的提取率，还能同时得到青稞油和青稞蛋白。因此，UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖不仅能同时分离获得青稞β-葡聚糖、青稞油和青稞蛋白，还能显著降低生产成本和提高青稞β-葡聚糖的提取率。
2.5 扫描电镜分析
图3是扫描电镜在放大10000倍的条件下，观察不同提取方式对青稞粉提取后的表面结构变化图。由图3可知，青稞粉经过三相分配法提取后表面崩裂、溶胀；酶法处理使青稞粉表面疏松多孔；超声波结合酶法预处理后青稞粉结构变得更加膨大、分裂；超声波结合酶法预处理辅助三相分配法提取后表面呈粉碎状，充满裂纹。综合分析上述结果，可能是因为三相提取法能对青稞粉产生溶胀的效果；酶分解青稞细胞壁中的纤维素和溶出的淀粉，从而使青稞粉表面疏松多孔；超声波产生的机械振动和空穴效应打破了青稞粉表面的组织结构，这与游茂兰等[28]的研究结果相似。以上结果表明UCWEATPP提取法是将酶法和机械力相互结合后更加彻底的破坏青稞粉表面组织结构，提高青稞β-葡聚糖的迁移速率，从而提高青稞β-葡聚糖的提取率。
2.6 UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖相对分子质量分布范围分析
图4反映了UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖相对分子质量分布范围比例情况。从图4可知，UCWEATPP提取得到的青稞β-葡聚糖相对分子质量较为集中，主要分布在1.7×105~3.0×105 Da之间，这可能是因为三相分配法对多糖具有纯化的效果，导致青稞β-葡聚糖相对分子质量分布范围较为集中[29-30]。
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图 4 UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖相对分子质量分布范围比例图Figure 4. Relative molecular weight distribution range of highland barley β-glucan extracted by UCWEATPP3. 结论
采用传统的碱提醇沉法提取多糖有机溶剂使用量大且产率低，而利用UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖可节约醇沉分离时间和减少乙醇的使用量。笔者对UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖工艺进行优化，得到最佳的提取工艺为酶添加量1.0%、超声时间9 min、超声功率140 W、硫酸铵添加量0.5 g/mL、三相提取温度35 ℃、三相提取时间1.5 h、料液比1:14 g/mL、叔丁醇与水相体积比为1.3:1，酶解时间为2.0 h。在此条件下，青稞β-葡聚糖提取率为66.96%±0.05%。66.96%±0.05%。。
UCWEATPP作为一种工艺简单、绿色、高效的分离方法可以从青稞中直接同步分离青稞β-葡聚糖、青稞油和青稞蛋白，大大降低生产成本，节约生产时间。此外，还可将动态高压微射流预处理、超高压辅助等技术与三相分配法相结合，研究三相分配法的提取效率，发展更加高效的联合提取方法。近年来，安全、高效、成本低廉是天然产物有效成分提取纯化的发展方向，本研究可作为青稞中活性成分高效利用的一种有效手段，为青稞的综合利用指明方向。
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图 1 料液比（A）、叔丁醇与水相体积比（B）、酶添加量（C）、酶解时间（D）、超声时间（E）、超声功率（F）、硫酸铵添加量（G）、三相提取温度（H）以及三相提取时间（I）对青稞β-葡聚糖得率的影响
注：不同字母（a~e）表示组内存在显著性差异（P<0.05）。
Figure 1. Effect of solid-liquid ratio (A), volume ratio of tert-butanol to water phase (B), enzyme addition (C), enzymolysis time (D), ultrasonic time (E), ultrasonic power (F), addition of ammonium sulfate (G), three-phase extraction temperature (H) and three-phase extraction time (I) on yield of highland barley β-glucan
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图 2 各因素之间交互作用对青稞β-葡聚糖提取率的影响
Figure 2. Effects of interaction among various factors on the extraction rate of highland barley β-glucan
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图 4 UCWEATPP提取青稞β-葡聚糖相对分子质量分布范围比例图
Figure 4. Relative molecular weight distribution range of highland barley β-glucan extracted by UCWEATPP
表 1 Plackett-Burman试验因素水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental
因素 编号 低水平（−1） 高水平（1） 料液比（g/mL） X1 1:10 1:20 叔丁醇与水相体积比 X2 1:1 2:1 酶添加量（%） X3 0.8 1.2 酶解时间（h） X4 1.5 2.5 超声时间（min） X5 6 12 超声功率（W） X6 120 160 硫酸铵添加量（g/mL） X7 0.4 0.6 三相提取温度（℃） X8 30 40 三相提取时间（h） X9 1.0 2.0 
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表 2 UCWEPATPP提取工艺响应面试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface test for UCWEPATPP extraction process
水平 A料液比（g/mL） B叔丁醇与水相体积比 C酶解时间（h） −1 1:10 1:1 1.5 0 1:15 1.5:1 2.0 1 1:20 2:1 2.5
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表 3 青稞基本成分和含量（%）
Table 3 Basic composition and content of highland barley (%)
基本成分 粗脂肪 粗蛋白质 β-葡聚糖 水分 灰分 青稞（带皮） 3.02±0.08 12.95±0.07 5.17±0.12 8.17±0.06 0.88±0.05
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表 4 Plackett-Burman试验各因素设计及响应值
Table 4 Design and response values of Plackett-Burman test
实验号 常数 料液比
（X1）叔丁醇与水相
体积比（X2）酶添加量
（X3）酶解时间
（X4）超声时间
（X5）超声功率
（X6）硫酸铵添加量
（X7）三相提取温度
（X8）三相提取时间
（X9）提取率
（Y，%）1 1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 25.13 2 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 43.06 3 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 26.89 4 1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 56.04 5 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 61.67 6 1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 23.52 7 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 65.41 8 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 47.22 9 1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 50.24 10 1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 67.40 11 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 43.25 12 1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 52.85
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表 5 Plackett-Burman试验各因素效应评价
Table 5 Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design
因素 效应 系数 系数
标准误T值 P值 方差膨胀
因子显著性 常量 46.89 1.08 43.50 0.001 料液比
（g/mL，X1）13.62 6.81 1.08 6.32 0.024 1.00 * 叔丁醇与水相
体积比（X2）14.76 7.38 1.08 6.85 0.021 1.00 * 酶添加量
（%，X3）7.06 3.53 1.08 3.28 0.082 1.00 酶解时间
（h，X4）16.31 8.15 1.08 7.56 0.017 1.00 * 超声时间
（min，X5）7.70 3.85 1.08 3.57 0.070 1.00 超声功率
（W，X6）−6.26 −3.13 1.08 −2.91 0.101 1.00 硫酸铵添加量
（g/mL，X7）−1.62 −0.81 1.08 −0.75 0.531 1.00 三相提取温度
（℃，X8）0.22 0.11 1.08 0.10 0.928 1.00 三相提取时间
（h，X9）−4.86 −2.43 1.08 −2.25 0.153 1.00 注：R2=98.91%，R2Adj=94.01%；*表示有显著性差异（P<0.05）。
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表 6 青稞β-葡聚糖UCWEPATPP提取工艺条件响应面优化方案及结果
Table 6 Response surface optimization scheme and results of extraction process conditions of highland barley β-glucan UCWEPATPP
实验号 A B C Y青稞β-葡聚糖
提取率（%）1 −1 −1 0 63.21 2 0 0 0 67.62 3 0 0 0 66.50 4 −1 0 −1 58.32 5 1 0 −1 56.12 6 1 −1 0 60.20 7 0 1 −1 57.55 8 −1 1 0 57.92 9 0 −1 −1 58.43 10 0 1 1 54.51 11 1 0 1 55.13 12 0 0 0 66.01 13 1 1 0 54.31 14 0 0 0 65.21 15 −1 0 1 58.13 16 0 −1 1 61.36 17 0 0 0 67.03
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表 7 响应面回归方程模型方差分析
Table 7 Analysis of variance of response surface regression equation model
来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 336.91 9 37.43 49.26 <0.0001 ** A 17.46 1 17.46 22.98 0.0020 ** B 44.70 1 44.70 58.82 0.0001 ** C 0.21 1 0.21 0.27 0.6170 AB 0.090 1 0.090 0.12 0.7408 AC 0.16 1 0.16 0.21 0.6602 BC 8.91 1 8.91 11.73 0.0111 * A2 77.88 1 77.88 102.49 <0.0001 ** B2 44.84 1 44.84 59.01 0.0001 ** C2 115.98 1 115.98 152.63 <0.0001 ** 残差 5.32 7 0.76 失拟项 1.88 3 0.63 0.73 0.5853 不显著 纯误差 3.44 4 0.86 总和 342.23 16 注：R2=98.45%，R2Adj=96.45%；*表示有显著性差异（P<0.05）；**表示有极显著性差异（P<0.01）。
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