Structural Characterization and Prebiotic Effects of Passiflora edulis Sims Peel Polysaccharide-Zinc
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摘要: 本研究旨在表征西番莲果皮多糖锌(WPEP-Zn)的结构并确定其益生元作用。采用傅里叶变换红外色谱、X射线衍射、扫描电镜、刚果红实验和热重分析对WPEP-Zn进行结构表征。将WPEP-Zn作碳源,研究其对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii(subsp.)bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的益生元作用。结果表明,WPEP-Zn的总糖含量和糖醛酸含量分别为23.26%和50.46%,锌含量为10.64 mg/g。与西番莲果皮多糖(WPEP)相比,WPEP-Zn仍具有三螺旋结构,且结晶度降低、红外吸收峰发生变化、形貌结构改变、热稳定性增强。WPEP-Zn促进上述4种益生菌生长的最佳质量浓度分别为3%、2%、2%、2%,对植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌的益生元效果低于WPEP,对嗜热链球菌的益生元效果高于WPEP,结果表明WPEP-Zn具有益生元作用。WPEP-Zn的研究为新型多糖补锌剂的开发以及西番莲资源的高效利用提供了依据。Abstract: This study aimed to characterize the structure of Passiflora edulis Sims peel polysaccharide-zinc (WPEP-Zn) and its prebiotic effects. The structural characteristics of WPEP-Zn were determined using Fourier transform infrared spectrometer, X-ray diffractometer, scanning electron microscope, Congo red test, and thermogravimetric analyzer. The WPEP-Zn was used as carbon source to study its prebiotic effects on Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii (subsp.) bulgaricus, Lactobacillus brevis, and Streptococcus thermophilus. The results showed that WPEP-Zn had sugar and uronic acid content of 23.26% and 50.46%, respectively, whereas the zinc content was 10.64 mg/g. It had a triple helix structure compared with the Passiflora edulis Sims peel polysaccharide (WPEP). Its relative crystallinity decreased, the infrared absorption peak changed, the morphological structure altered, and the thermal stability enhanced. The optimal concentrations of WPEP-Zn used to promote the growth of the four bacteria strains were 3%, 2%, 2%, and 2%, respectively. The prebiotic effects of WPEP-Zn on L. plantarum, L. delbrueckii (subsp.) bulgaricus, and L. brevis were lower than WPEP, but its prebiotic effect on S. thermophilus was higher than the WPEP. The findings revealed the prebiotic effect of WPEP-Zn. The study on WPEP-Zn provided a basis for developing new polysaccharide-zinc supplements and the effective utilization of passion fruit resources.
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Keywords:
- Passiflora edulis Sims peel /
- polysaccharide /
- zinc /
- metal complexes /
- structural characterization /
- prebiotics
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西番莲(Passiflora edulis Sims),又称百香果,鸡蛋果,是一种热带攀缘藤本植物,主要分布于两广、福建、海南、台湾等地,由于其独特的风味和营养特征备受人们喜爱[1-3]。西番莲果皮作为西番莲工业生产的主要副产品,其比重占总果的45%~55%,包含丰富的膳食纤维以及活性物质,如多糖、黄酮、多酚和生物碱等[4-6]。多糖作为西番莲果皮主要活性物质之一,具有良好的抗氧化、抗肠炎以及增强肠道保护等多种生物活性[7-10]。西番莲果皮多糖还具有益生元作用,在羧甲基化修饰后,其益生元作用有所提升[11]。
锌作为人体必不可少的微量元素之一,在维持蛋白质和DNA合成、调节细胞生长、增殖和代谢等方面发挥着重要作用[12-13]。锌不能在体内合成,只能通过膳食补充剂摄入,缺锌会导致各种高危疾病的患病率增加,如侏儒症[14-15]、冠心病、糖尿病、厌食症、心脑血管疾病、慢性肾脏疾病和癌症等[16-17]疾病,锌摄入量不足、排泄过多[18]和使用障碍是导致人体患有上述疾病的常见原因。多糖锌配合物是由多糖与锌离子配合而成,与无机锌相比,其副作用小、利用率高、对胃肠道刺激小、生物活性高[19-21]。有研究发现,黄芪多糖锌对糖尿病大鼠具有较强的降血糖作用[22],杏鲍菇菌丝多糖锌具有预防高脂血症的作用[23],南瓜果皮多糖锌对斑马鱼炎症细胞具有较好的抑制作用[24],但是关于天然多糖锌复合物的益生元作用的研究鲜有报道。
本研究将西番莲果皮多糖与七水硫酸锌配合得到西番莲果皮多糖锌,对西番莲果皮多糖锌的理化性质与结构进行了检测分析,并探究了其益生元作用。本研究为西番莲资源的有效利用提供了新的方向,为多糖锌在功能食品领域的开发以及在益生领域的探索提供了一定的理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
西番莲(Passiflora edulis Sims) 广西桂林市,十月份采摘;植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii(subsp.)bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 广东省微生物菌种保藏中心;低聚果糖(Fructo-oligosaccharides,FOS)、大豆蛋白胨 上海源叶生物科技有限公司;大豆卵磷脂 上海贤鼎生物科技有限公司;十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS) 上海凛恩科技发展有限公司;刚果红 上海麦克林生化科技股份有限公司;磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、氢氧化钠、盐酸 西陇科学股份有限公司;酵母浸粉 北京陆桥技术有限责任公司;牛肉浸粉 青岛高科园海博生物科技有限公司;乙酸钠等其他试剂 均为分析级及以上。
YKSL-1200X 马弗炉 合肥科晶材料技术有限公司;ALPHA1-2 LD冷冻干燥机 德国Martin Christ 公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;YK722PC可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;LRH-250-Z振荡培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司;3000Da透析袋 北京瑞达恒辉科技发展有限公司;SDT Q600 热重-差热分析仪 美国TA Instrument 公司;XPert3Power X-射线衍射仪 荷兰帕纳科公司;IS10傅立叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司;YK722PC紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司;iMark酶标仪 Bio-Rad Laboratories;S-5000电镜扫描仪 日立有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多糖锌配合物的制备
根据Guan等[25]的方法,用水提法制备得到西番莲果皮粗多糖(Water extrac-ted polysaccharide from Passiflora edulis Sims peel,WPEP)。将1.0 g WPEP溶于250 mL蒸馏水中,加入0.88 g ZnSO4·7 H2O(溶于20 mL 0.1 mol/L HCl中),调节pH至6.0,于60 ℃条件下反应2 h,流水透析48 h,浓缩并冷冻干燥得到西番莲果皮多糖锌配合物(WPEP-Zn)。
1.2.2 理化性质检测
1.2.2.1 锌含量的测定
取100 mg WPEP-Zn在马弗炉中高温灰化3.5 h,温度设置为550 ℃。灰化后的WPEP-Zn溶于少量稀硝酸,加水至10 mL备用。取一定量ZnSO4·7H2O配制浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/L的锌标准溶液备用[26]。采用可见分光光度计测定WPEP、WPEP-Zn和系列标准溶液的吸光度并计算锌含量,测得标准曲线方程为Y=0.2611X−0.0148,R2=0.9956。
1.2.2.2 溶解性的测定
取50 mg WPEP与WPEP-Zn分别加入5 mL蒸馏水,室温下混合90 min后在8000 r/min下离心30 min。移去上清液,烘干后称量剩余多糖质量。溶解性计算公式如下:
溶解性(%)=W0−W1W0×100 式中:W0表示溶解前多糖质量,mg;W1表示溶解后剩余多糖质量,mg。
1.2.2.3 总糖含量和糖醛酸含量的测定
采用苯酚硫酸法[27]和间羟基联苯法[28]检测WPEP与WPEP-Zn的总糖含量与糖醛酸含量,测得总糖含量标准曲线方程为Y=13.847X+0.0556,R2=0.9989,糖醛酸含量标准曲线方程为Y=11.128X+0.0274,R2=0.9905。
1.2.3 结构表征
1.2.3.1 刚果红实验
1 mL WPEP和WPEP-Zn溶液(1 mg/mL)与1 mL刚果红溶液(80 μmol/L)混合,加入NaOH(1 mol/L)溶液混合至NaOH最终浓度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L,室温静置10 min,紫外分光光度计在400~600 nm扫描检测最大吸收波长[29]。
1.2.3.2 傅里叶变换红外光谱检测
称取一定量的WPEP和WPEP-Zn,分别加入100 mg溴化钾研磨压片,在4000~500 cm−1波数范围内进行红外光谱扫描[30]。
1.2.3.3 X射线衍射(XRD)检测
采用X-射线衍射仪进行扫描测定,衍射条件为:Cu-K α衍射,管压40 kV,管流40 mA,角度5.00°~90.00°,角度梯度0.02°、扫描速度10°/min。
1.2.3.4 扫描电子显微镜(SEM)检测
用导电胶将多糖粘在样品台上,在真空喷镀仪内喷上金膜,扫描电子显微镜下观察样品表面形态。条件为电压:5 kv,电流:9.9 A。
1.2.3.5 热重检测
分别称取10 mg WPEP和WPEP-Zn于坩埚中,以空白陶瓷坩埚作空白参照,氮气为保护气,在热重分析仪上进行热分解,实验条件设置温度为10~800 ℃,升温速率为10 ℃/min[31]。
1.2.4 多糖的益生元作用
1.2.4.1 培养基的配制
MRS基础培养基:大豆蛋白胨10.0 g,牛肉浸粉10.0 g,酵母浸粉5.0 g,柠檬酸二胺2.0 g,磷酸氢二钾2.0 g,硫酸锰0.05 g,硫酸镁0.30 g,吐温-80 ℃ 1.0 mL,乙酸钠5.0 g,溶至1000 mL水中,pH6.5。液体培养基:在MRS基础培养基的基础上加1%的葡萄糖所得。固体培养基:为在液体培养基的基础上加1.5%的琼脂所得。
1.2.4.2 菌种活化
液体培养:配置液体培养基,高压灭菌,设置时间为20 min,温度为121 ℃。灭菌结束后分别4种益生菌接种到液体培养基中,37 ℃下培养48 h。固体培养:将液体培养基中培养的4种益生菌分别接种至固体培养基中,在37 ℃下培养48 h,再将益生菌接种于液体培养基中培养12 h进行二次活化,培养条件与液体培养条件相同。
1.2.4.3 不同浓度多糖对益生菌增殖的影响
在MRS基础培养基中加入质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0%(W/V)的FOS、WPEP和WPEP-Zn,分别接入上述4种二次活化后益生菌,在37 ℃环境下振荡培养36 h,测定不同多糖浓度下培养液的OD570 nm,确定促进益生菌增殖的最佳多糖浓度。
1.2.4.4 多糖对益生菌生长曲线的影响
根据张国柱[32]的方法做出部分修改,实验以低聚果糖作阳性对照,以MRS基础培养基作空白组阴性对照。在200 μL空白组和最佳质量多糖浓度下的FOS组、WPEP组和WPEP-Zn组培养基中分别加入100 μL二次活化后的4种益生菌,培养36 h,每间隔2 h测定培养液的OD570 nm。以培养时间为横坐标,以OD570 nm为纵坐标代表益生菌的生长状况,绘制益生菌的生长曲线,探究WPEP及WPEP-Zn对4种益生菌生长的影响。
1.3 数据处理
所有实验重复3次,实验数据以平均值±标准误差的形式表示,采用SPSS22.0处理和分析数据,采用Origin pro软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 理化性质分析
理化性质分析结果如表1所示。WPEP-Zn的总糖和糖醛酸含量分别从配合前的28.52%和72.03%降至23.26%和50.46%,多糖与锌配合后总糖含量与糖醛酸含量存在显著性差异(P<0.05)。溶解性从97.8%升至98.07%,无显著性差异(P>0.05)。WPEP未检测到Zn,WPEP-Zn的锌含量为10.64±0.5 mg/g。锌的配合改变了WPEP的理化性质,配合后的多糖总糖含量和糖醛酸含量明显降低,锌含量增加。
表 1 WPEP与WPEP-Zn的理化性质Table 1. Physicochemical properties of WPEP and WPEP-Zn样品 总糖含量(%) 糖醛酸(%) 溶解性(%) 锌含量(mg/g) WPEP 28.52±1.60a 72.03±5.45a 97.80±0.20a NDb WPEP-Zn 23.26±0.58b 50.46±13.31b 98.07±0.64a 10.64±0.50a 注:ND:未检测出;同列不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。 2.2 刚果红测试分析
WPEP、WPEP-Zn的刚果红测试结果如图1所示。多糖的三螺旋结构使得其结构复杂多样,能够承载更多的生物信息,同时有利于多糖生物活性的提高[33]。刚果红溶液是一种弱碱性的溶液,具有三螺旋结构的多糖与碱性的刚果红溶液能够形成复合物。WPEP与WPEP-Zn在NaOH浓度为0.05~0.15 mg/mL的最大吸收波长与碱性刚果红溶液相比发生了红移,且在NaOH浓度为0.1 mol/L时波长最大,随着碱浓度的升高,WPEP与WPEP-Zn中的三螺旋结构被破坏,两种多糖的最大吸收波长逐渐降低,三股螺旋结构逐渐解旋,这与常相娜等[34]所做的香菇多糖的刚果红实验一致。结果说明WPEP-Zn具有多糖的三螺旋结构。
2.3 傅里叶红外光谱分析
由图2可知,配合前后的多糖红外光谱在3440 cm−1左右均有强吸收峰,是多糖分子间或分子内的O-H的伸缩振动引起的;在2700~3000 cm−1之间出现了弱吸收峰,是糖类不对称C-H的伸缩振动引起的;1600 cm−1左右强吸收峰属于C=O的伸缩振动;在1362 cm−1左右的吸收峰为O-H的弯曲振动吸收峰;1000~1200 cm−1范围内的吸收峰属于C-O-C和C-O-H的伸缩振动;1015.13、1068.92、1148.15 cm−1左右的C-O吸收峰表明存在吡喃环结构[35]。WPEP与锌配合后,属于O-H的伸缩振动产生的特征吸收峰由3443.08 cm−1处移动到3443.98 cm−1,推测WPEP与锌结合是通过Zn-O键进行连接[36];在500~1000 cm−1范围内,相比于WPEP,WPEP-Zn在562.48 cm−1处未出现峰值,但在531.99 cm−1和920.48 cm−1处产生了新的特征峰。所有吸收峰的变化都与多糖和锌的相互作用力变化有关,说明配合后多糖结构发生了变化[36]。
2.4 XRD分析
WPEP、WPEP-Zn的XRD扫描结果如图3所示。WPEP与WPEP-Zn的衍射图在2θ=21°处均有结晶度峰。在29.7°和30.6°时,WPEP出现了两个吸收波峰,且在角度为35°~42°时,WPEP也有较小波峰出现,而WPEP-Zn在此角度的波峰降低。在43°时,WPEP与WPEP-Zn均出现了一个小的特征峰,WPEP峰值相对较高。结果表明,西番莲果皮多糖经过与锌的配合后,结晶区域和类型发生变化,相较WPEP,WPEP-Zn的峰形变宽,峰形变圆钝,配合后多糖的结晶度有所下降[37]。曾凡珂等[38]报道的荸荠皮多糖的XRD图谱衍射峰主要集中在2θ为20°~30°范围内,峰形与WPEP和WPEP-Zn接近,结晶程度低,溶解性和生物利用度较好。结晶度可能与溶解度呈负相关,溶解性越好,其相对结晶度越低[39],相较WPEP,WPEP-Zn结晶度有所下降,但由表1可以看出WPEP和WPEP-Zn溶解性无显著性差异,说明配合后的多糖仍主要以非定型的结晶态存在[37]。
2.5 SEM分析
WPEP、WPEP-Zn的SEM扫描结果如图4所示。从图4A、C看出,WPEP表面较为平整、光滑,结构紧密,表面积大,说明多糖的链聚集紧密。WPEP-Zn呈现蜂巢状,表面有龟裂,粗糙不规整,说明多糖与锌不仅存在配合,也有可能存在锌的物理吸附[40]。从图4B、D可以看出WPEP表面结构表现出不规则的片状,WPEP-Zn同样为不规则的片状结构但更均匀,可能是WPEP与锌离子配合后分子间作用力增加,结构分布发生改变,这与Zhou等[31]的结果一致。表明锌与WPEP的配合不仅是在空间结构上改变了WPEP,还存在锌的物理吸附现象,使得多糖表面结构发生明显改变。
2.6 热重分析
WPEP,WPEP-Zn的热重实验结果如图5所示。多糖结构和官能团差异会影响热行为并影响温度转变。WPEP在30~187 ℃时,失重率为19.08%,在此阶段主要是失去多糖中的游离水;在187~250 ℃时,失重率为47.46%;在250~371 ℃时,失重率为12.73%;在371~389 ℃时,失重率为11.18%。WPEP-Zn在30~222 ℃时,主要失去的是多糖的自由水,失重率为21.25%;在222~347 ℃时,失重率为50.49%,本阶段多糖大量的受热分解;在347~425 ℃时,多糖失重率为5.50%;在425~445 ℃时,失重率为8.33%,此后阶段保持平稳。在热重分析中可以看出,WPEP比WPEP-Zn先出现大幅度失重,WPEP在187 ℃时开始大量分解,而WPEP-Zn在222 ℃时开始大量分解,随着温度继续升高,WPEP与WPEP-Zn再次出现较小幅度失重现象,最后,两者分别在371 ℃和425 ℃时,彻底的被热分解。说明了锌的配合使得多糖热稳定性有了显著的提升,这与Bai等[41]在大蒜多糖锌的热重分析中所得的结果一致。
2.7 多糖的益生元作用分析
2.7.1 不同浓度的多糖对益生菌的增殖作用分析
不同浓度多糖对4种益生菌的益生元作用结果如图6~图9所示。以OD570 nm大小代表实验菌体的生长状况,在第36 h比较不同质量浓度多糖对益生菌的促进增殖效果。如图6~图9所示,可知WPEP和WPEP-Zn对4种益生菌促进增殖的最佳质量浓度分别为2%、2%、2%、3%和3%、2%、2%、2%。
2.7.2 最佳质量浓度下的多糖对益生菌生长曲线的作用分析
分别以促进益生菌增殖的最佳质量浓度下的WPEP、WPEP-Zn和FOS作为碳源,以空白组为对照,绘制4种益生菌的生长曲线,并在生长结束时间点进行显著差异性分析,结果如图10~图13所示。图10中可以看出,在植物乳杆菌生长稳定后,WPEP-Zn组的OD570 nm明显高于空白组但低于WPEP组和FOS组,四组间存在显著差异(P<0.05)。由图11和图12可知,在德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌生长稳定后,WPEP-Zn组的OD570 nm稍高于空白组但两组之间不存在显著差异(P>0.05),而WPEP-Zn组的OD570 nm均低于WPEP组和FOS组且三组间相互存在显著差异(P<0.05)。从图13中可以看出,在嗜热链球菌生长稳定后,WPEP-Zn组的OD570 nm明显高于WPEP组和空白组且存在显著差异(P<0.05),低于FOS组且存在显著性差异(P<0.05)。
在植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌的生长曲线中可以看出,WPEP组OD570 nm明显高于空白组与WPEP-Zn组,证明WPEP组对这3种益生菌具有明显的促进增殖作用;WPEP-Zn组仅在植物乳杆菌的生长曲线中OD570 nm明显高于对照组,表现出明显的促进增殖作用,对另外2种益生菌无明显促进增殖作用,这可能与锌在细胞外的浓度过高有关,使细胞的膜运输降低[42]。在嗜热链球菌的生长曲线中可以看出,WPEP组OD570 nm稍高于对照组但无显著性差异,未表现出明显的促进增殖作用;WPEP-Zn组OD570 nm明显高于WPEP组和空白组,说明WPEP经过与锌配合后,多糖结构的改变或锌含量的增加对嗜热链球菌的增殖具有更好的促进作用,具体作用机理有待进一步研究。
3. 结论
本研究使用WPEP与七水硫酸锌配合得到WPEP-Zn,对其进行结构表征并探究其益生元作用。WPEP-Zn相较配合前的总糖含量和糖醛酸含量分别从28.52%和72.03%降至23.26%和50.46%。配合后多糖仍具有三螺旋结构,结晶区域与类型以及表面特征发生了明显的变化,热稳定性明显增加。WPEP与锌配合后结构的变化以及锌含量的提升对植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌的益生元作用下降,但对嗜热链球菌的益生元作用有所提高,说明配合后多糖具备一定的益生元作用,对后续多糖补锌剂的研究具有一定的推动作用。本研究证明了多糖与金属锌的配合具有可观的发展潜力,为西番莲资源利用提供了新的方向以及为新型多糖补锌剂的发展提供了一定的理论依据。
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表 1 WPEP与WPEP-Zn的理化性质
Table 1 Physicochemical properties of WPEP and WPEP-Zn
样品 总糖含量(%) 糖醛酸(%) 溶解性(%) 锌含量(mg/g) WPEP 28.52±1.60a 72.03±5.45a 97.80±0.20a NDb WPEP-Zn 23.26±0.58b 50.46±13.31b 98.07±0.64a 10.64±0.50a 注:ND:未检测出;同列不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。 -
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