Optimization of Dendrobium offcinale Fondant Formulation and Its Antioxidant Activity Determination by Response Surface Methodology
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摘要: 以铁皮石斛为主要原料，以赤藓糖醇、柠檬酸、明胶为辅料来制作铁皮石斛软糖。以感官评定为指标，采用单因素实验和响应面试验研究铁皮石斛软糖的最佳制作工艺及配方。再运用最优铁皮石斛软糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基清除实验及其还原能力的测定来说明软糖的体外抗氧化活性；同时测定铁皮石斛软糖的质构特性。结果表明：铁皮石斛添加量为92.90%，明胶添加量18.30%，柠檬酸添加量0.14%，赤藓糖醇添加量29.20%为最佳，此时感官评分为83.50分。根据最优配方制得的铁皮石斛软糖，分析得出其还原糖、多酚含量分别为30.03 g/100 g、0.85 mg/g。体外抗氧化分析结果显示，铁皮石斛软糖的体外抗氧化活性与VC相近，铁皮石斛软糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的半数有效浓度（IC50）为0.50 mg/mL、清除超氧阴离子自由基的IC50值为0.13 mg/mL，可证明铁皮石斛软糖具有良好的抗氧化能力。质构分析结果得出铁皮石斛软糖硬度在4600~4800 g之间，软硬适宜；铁皮石斛软糖咀嚼性在4200~4300 g范围内，接受度较高。Abstract: Dendrobium offcinale was used as the main raw material, and erythritol, citric acid and gelatin were used as auxiliary ingredients to make Dendrobium offcinale fondant. Using sensory evaluation as the index, single-factor experiments and response surface experiments were used to study the optimal production process and formulation of Dendrobium offcinale fondant. Then, the in vitro antioxidant activity of the fondant was illustrated by the determination of the scavenging of DPPH radicals and superoxide anion radicals and their reducing ability of the optimal Dendrobium offcinale fondant, meanwhile, the textural properties of Dendrobium offcinale fondant were determined. The results showed that the addition of 92.90% of Dendrobium offcinale, 18.30% of gelatin, 0.14% of citric acid and 29.20% of erythritol was the best, and the sensory score was 83.50 at that time. The reducing sugar and polyphenol contents of Dendrobium offcinale fondant made according to the optimal formulation were analyzed as 30.03 g/100 g and 0.85 mg/g. Respectively, the results of in vitro antioxidant analysis showed that the in vitro antioxidant activity of Dendrobium offcinale fondant was similar to that of VC, and the half effective concentration (IC50) of Dendrobium offcinale fondant against 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) radical was 0.50 mg/mL and the IC50 value for the scavenging superoxide anion radicals was 0.13 mg/mL, which could prove that Dendrobium offcinale fondant had good antioxidant ability. The results of texture analysis concluded that the hardness of Dendrobium offcinale fondant ranged from 4600 to 4800 g, with suitable softness and hardness, the chewiness of Dendrobium offcinale fondant ranged from 4200 to 4300 g, and the acceptability was higher.
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Keywords:
- Dendrobium officinale /
- fondant /
- response surface methodology /
- antioxidant /
- textural properties
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铁皮石斛，其拉丁学名为Dendrobium officinale Kimura et Migo，兰科树兰族石斛属植物，石斛主要分布于东南亚的热带和亚热带以及大洋洲，喜阳半阴，潮湿的环境，大多长在树干或岩石上[1]。据《石斛》一书记载石斛又可分为齿瓣石斛、铁皮石斛、金钗石斛等种类，石斛种类虽多，却是一种濒危药用植物[2]。铁皮石斛是一种多糖类物质含量极高的药食两用植物，也是自由基清除能力与维生素C相当的佼佼者。因铁皮石斛含有黄酮类、酚类、联芐类等多种营养物质成分，其可呈现出较好的抗肿瘤[3-6]、抗氧化[7-9]、抗衰老[10]等能力，还可提高免疫力[11-14]，缓解疲劳[15-16]。
相关数据[17]显示，2017年以来，全国保健食品市场包括“药食同源”产品产值已达3000亿元以上，且每年以14%的速度增长[18]。目前，铁皮石斛大多被用来制作成各种相关健康产品（胶囊、口服液等），日化产品等[19-20]。然而，不论是把铁皮石斛的药食同源的成分装进胶囊还是口服液里，虽然“有益健康”，但难免有“良药苦口”之感。本实验以软糖为理想的营养“载体”，将受剂型、口感限制的铁皮石斛药食同源类成分添加至软糖中，口味得以改善，营养价值得以充分利用，提高产品外观及便携性，更加符合年轻人的消费观念，因此研究一种健康、营养、功能性的软糖更具意义。
本研究以铁皮石斛为原料，对其制作软糖的最佳工艺及配方进行探讨，充分发挥原料中的有益成分，提高其保健功能，将其黏液质添加到软糖配方中，通过人体胃肠道吸收，将其可滋润皮肤，抗衰老的作用发挥到最大化。同时增加铁皮石斛的食用方法，开创一条新的铁皮石斛利用途径，提高铁皮石斛的利用率及扩大其市场，丰富石斛系列产品的上市形式。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
铁皮石斛 市场采购，云南省普洱昆弘生物科技有限公司；食品级赤藓糖醇 山东三元生物科技股份有限公司；明胶 上海枫未实业有限公司；水 普洱市思茅区龙泉山泉水厂；食品级无水柠檬酸 河南万邦化工科技有限公司；无水葡萄糖、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸二氢钾、硫酸铜、亚甲基蓝、氢氧化钠、乙酸锌、亚铁氰化钾 天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸 重庆川东化工有限公司；没食子酸、福林酚 北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 福州飞净生物科技有限公司；抗坏血酸 山东西亚化学股份有限公司；酒石酸钾钠 上海试四赫维化工有限公司；冰乙酸、三氯乙酸 成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇、磷酸氢二钠 天津市大茂化学试剂厂；无水碳酸钠 天津市福晨化学试剂厂；邻苯三酚 合肥巴斯夫生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷 上海源叶生物科技有限公司；水为去离子水，所有试剂均为分析纯。
AE224型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；C22-RT22E01电磁炉 广东美的生活电器制造有限公司；304食品级不锈钢量杯、食品级硅胶模具 义乌市潘丽日用品有限公司；BCD-206STPQ冰箱 青岛海尔股份有限公司；破壁料理机 中山市万新电器有限公司；冷藏箱 广州傲雪医用冷藏箱；CL5120型超声波清洗机 宁波新艺超声设备有限公司；UV-1900紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；722分光光度计 天津市泰斯特仪器有限公司；DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；TST-R0-10纯水机 石家庄泰斯特仪器设备有限公司；TA.XT plus C质构仪 厦门超技仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程
铁皮石斛汁的制备：新鲜铁皮石斛枝条，用沸水烫3 min，去皮，切成短条，按1:10的料液比榨汁3 min，过滤，备用；明胶溶液的制备：将明胶加入矿泉水中浸泡0.5 h，软化，将其置于沸腾的水浴锅中加热溶解至无明胶颗粒存在并保留5 min，备用；熬煮：将制备好的明胶溶液和铁皮石斛汁混合，加入赤藓糖醇进行熬煮，边熬煮边搅拌；混合调酸：将柠檬酸加入混合后的糖液中，搅拌均匀；脱气：当所有料液都混匀，轻微震荡后将混合物置于温度约80 ℃的恒温箱中静置30 min，使软糖中的气泡减少；注模：将制作好的混合溶液注入洗净的模具中；冷却：放入冰箱中冷却4 h，即可脱模；包装：采用塑封包装袋进行包装，即得铁皮石斛软糖。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 明胶添加量
在其他因素不变的情况下，即赤藓糖醇30%，柠檬酸0.14%，铁皮石斛溶液100%（21 g），明胶添加量选取含量为9%、12%、15%、18%、21%，设置5水平进行单因素实验，并对所得到的产品进行感官评定。
1.2.2.2 赤藓糖醇添加量
在其他因素不变的情况下，即柠檬酸0.14%，铁皮石斛溶液100%，明胶添加量18%，赤藓糖醇添加量选取含量分别为15%、20%、25%、30%、35%，设置5水平单因素进行实验，并对所得到的产品进行感官评定。
1.2.2.3 柠檬酸添加量
在其他因素不变的情况下，即赤藓糖醇30%，铁皮石斛溶液100%，明胶18%，柠檬酸添加量选取含量分别为0%、0.10%、0.14%、0.18%、0.22%的，设置5水平单因素进行实验，并对所得到的产品进行感官评定。
1.2.2.4 铁皮石斛添加量
铁皮石斛溶液选取含量为10%、40%、70%、100%、130%，设置5水平单因素，以铁皮石斛汁添加量为基础量，计算其他原料的添加量进行实验，并对所得到的产品进行感官评定。
1.2.3 响应面优化试验设计
根据单因素实验所得结果，对铁皮石斛添加量、明胶添加量、赤藓糖醇添加量、柠檬酸添加量4个因素，以感官评分为响应值标准值，运用Design-Expert软件进行优化试验[21-23]，试验因素水平编码见表1。
表 1 响应面试验设计因素水平Table 1. Level of response surface test design factors因素 水平 −1 0 1 A赤藓糖醇添加量（%） 25 30 35 B明胶添加量（%） 15 18 21 C铁皮石斛添加量（%） 70 100 130 D柠檬酸添加量（%） 0.10 0.14 0.18 1.2.4 感官评定方法
邀请10名食品专业评委，从口感、色泽、滋味和风味、组织形态、总体情况五个方面进行感官评定，采用百分制，感官评定表如表2所示。10位感官评定员的平均值为每组的最后得分，即综合感官评定[24-25]。
表 2 铁皮石斛软糖感官评分标准Table 2. Sensory scoring standard of Dendrobium officinale fondant指标 评分标准 分值
（分）各指标
总分口感 口感细腻，咀嚼性好，软硬适中，不粘牙 16~20 20 口感一般，咀嚼性一般，偏软或偏硬，稍粘牙 9~15 口感差，咀嚼性差，过软或过硬，过粘牙 0~8 色泽 颜色均匀，有光泽 16~20 20 颜色不均匀，有一定光泽 9~15 颜色不均匀，暗淡无光泽 0~8 滋味和
风味甜而不腻，铁皮石斛味柔和，风味适宜 16~20 20 甜味较腻或较淡，铁皮石斛味较淡，风味一般 9~15 甜味很腻或很淡，铁皮石斛味过重或无味，
风味极差0~8 组织
形态软硬适度，无气泡，质地均匀细腻，表面不粘手 16~20 20 硬度稍硬，有些许气泡，质地基本均匀，
表面稍粘手9~15 硬度过软，有较大气泡，质地不均匀，表面粘手 0~8 总体
情况形态宜人，颜色纯正，无杂质 16~20 20 有裂纹或有凹陷、有凸起，颜色稍有异常，
有少许杂质9~15 形态扭曲，颜色有明显异常，杂质较多 0~8 1.2.5 还原糖、多酚、体外抗氧化及质构特性测定
1.2.5.1 还原糖的测定
根据GB/T 5009.7-2016食品中还原糖的测定[26]中的直接滴定法对铁皮石斛软糖中的还原糖含量进行测定，以葡萄糖为标准品，所得结果用每100 g铁皮石斛软糖样品中葡萄糖的含量表示，单位为g/100 g。
铁皮石斛软糖试样中还原糖的含量（以葡萄糖计）：
X=m1m×F×V250×1000×100 (1) 式中：X为铁皮石斛软糖样品中还原糖的含量（以葡萄糖计），g/100 g；m1为碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于葡萄糖的质量，mg；m为铁皮石斛软糖试样质量，g；F为系数，为1；V为测定时平均消耗铁皮石斛软糖试样溶液体积，mL；250为定容体积，mL。
1.2.5.2 多酚含量的测定
多酚含量参考曹美丽等[27]，李娟等[28]的方法进行改进，利用福林酚法测定，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，精确称取没食子酸标准品10 mg，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得1 mg/mL的没食子标准溶液。在浓度梯度上做出调整，即制得质量浓度为0、10、20、30、40、50 μg/mL没食子酸溶液。准确移取0.2 mL稀释后的溶液，加入1 mL福林酚显色剂，混匀，2 min后加入3 mL饱和碳酸钠（7.50%），混合均匀，在室温、避光条件下放置1 h，用分光光度计在765 nm处测定其吸光值，每个浓度做三个平行实验。没食子酸为标准品绘制标准曲线，吸光值平均值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，绘制标准曲线得回归方程y=0.0148x−0.0101，R2=0.999，拟合性较好。
铁皮石斛多酚的提取和含量测定，准确称取2 g铁皮石斛软糖样品制备试液，取0.2 mL制备好的试液，按照标准曲线项下测定样品吸光度。计算多酚含量公式如下：
Y(mg⋅g−1)=C×V×Dm (2) 式中：Y为铁皮石斛软糖多酚含量，mg/g；C为根据吸光度值计算出的质量浓度，mg/mL；V为供试品溶液体积，mL；D为溶液稀释倍数；m为铁皮石斛软糖质量，2 g。
1.2.5.3 体外抗氧化活性的测定
1.2.5.3.1 DPPH自由基清除能力的测定
DPPH溶液的配制：准确称取5 mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，DPPH浓度为0.005%，0~4 ℃避光保存。取软糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL（不足体积用无水乙醇补齐至10 mL）与2 mL 0.005% DPPH溶液加入同一试管中，摇匀，在室温下避光放置反应30 min，以相应无水乙醇为空白在517 nm测定其吸光度A，每个样品平行3次，计算其清除率，阳性对照为VC[29-32]。
DPPH自由基清除率(%)=A0−A1A0×100 (3) 式中：A0为1 mL无水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度；A1为待测样液+2 mL DPPH溶液的吸光度。
1.2.5.3.2 还原能力的测定
在试管加入不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的待测样液1 mL，在该反应体系中加入磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）2.5 mL，1%铁氰化钾溶液2.5 mL，加完后混匀，置于50 ℃电热恒温水浴锅保温20 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，室温静置10 min。取2.5 mL反应液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL0.1%氯化铁溶液。反应10 min后测定700 nm处吸光值，每个样品平行3次，以VC为阳性对照[33]。
1.2.5.3.3 超氧阴离子清除能力测定
在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度（420 nm波长）在反应开始后5 min之内会随时间变化而线性增大。因此，在该时间内，于420 nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率，并与空白对照比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。取0.05 mol/L的Tris-HCl （pH8.2）缓冲液6 mL，于25 ℃水浴预热20 min，加入0.8 mL预热过的5 mol/L的邻苯三酚溶液和4 mL的铁皮石斛软糖溶液，25 ℃下反应4 min，然后用8 mol/L的HCl溶液终止反应，在420 nm处测定吸光度，每个样品平行3次，计算平均值。以VC溶液做阳性对照。
超氧阴离子清除率(%)=A0−(A1−A2)A0×100 (4) 其中：A0为6 mL缓冲液+4 mL VC溶液+0.8 mL邻苯三酚溶液+0.2 mL HCl的吸光度；A1为6 mL缓冲液+4 mL样品溶液+0.8 mL邻苯三酚溶液+0.2 mL HCl的吸光度；A2为6 mL缓冲液+4 mL样品溶液+0.8 mL VC溶液+0.2 mL HCl的吸光度。
1.2.5.4 铁皮石斛软糖质构特性测定
采用TA.XT plus C质构仪测定，探头：P/36R，测前速度：2.00×10−3 m/s，测中速度：5.00×10−3 m/s，测后速度：5.00×10−3 m/s，接触力：5 g，应变：50%，两次压缩间隔时间：8 s，每秒数据吞吐率为200次，测定硬度、弹性、粘聚性、胶着性、咀嚼性、回复性。每次实验结束均对探头进行擦拭，干净后进行下一次实验，每个样品重复测定3次。
1.3 数据处理
经多次预实验确定基础配方数据，利用Excel分析单因素实验数据，确定响应面试验数据依据；再通过借助Design-Expert 8.0.6软件设计试验、分析数据、建立二次模型，利用拟合回归方程，分析响应曲面，以此得出最佳铁皮石斛软糖配方，借助F值考察模型及因素的显著性（P<0.05）；再通过TA.XT plus C质构仪测定最优配方软糖的各项指标值，由各项指标值分析软糖的硬度、咀嚼性等特性。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 明胶添加量对软糖感官品质的影响
明胶是无味且易溶解的动物胶，具有三螺旋弹性结构，在铁皮石斛软糖的制作过程中与铁皮石斛汁中的粘性物质结合，能够赋予软糖弹性、韧性、恢复性等特性，是软糖制作过程中的重要组成部分[34]。
由图1可知，明胶添加量较少时，铁皮石斛软糖无法成型，不具备任何弹性，或成型后质地较软，随着明胶添加量的增加，软糖的质构及感官评分均发生明显变化，在添加量为18%时感官评分最高，质地最佳，软糖硬度、咀嚼性、弹性较好。当明胶添加量过多，弹性、黏性加强，但咀嚼性较差、软糖较硬，且在熬制后出现明显胶味，影响铁皮石斛软糖口感及风味。因此在响应面试验中明胶添加量确定为15%~21%。
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图 1 明胶添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响Figure 1. Effect of gelatin addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant2.1.2 赤藓糖醇添加量对软糖感官品质的影响
赤藓糖醇作为一种口感、甜度适宜的甜味剂，赤藓糖醇具有其他糖醇没有的不吸湿性，在湿度较高的地方仍可保持良好的贮藏稳定性，用赤藓糖醇作为代糖，更容易被患有糖尿病、肥胖症等人群接受，在减少铁皮石斛软糖能量、满足各类消费者需求的同时，提高软糖的可接受性。
由图2可知，随着赤藓糖醇添加量的增加，软糖的感官评分呈现出上升趋势后又下降。在添加量为30%时得分达到最大，赤藓糖醇添加太少，软糖甜味不足，质地略软；赤藓糖醇太多，软糖发硬，透明度不好，且会影响明胶的凝结作用，甜味较腻，影响铁皮石斛软糖口感。因此在响应面试验中赤藓糖醇添加量确定为25%~35%。
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图 2 赤藓糖醇添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响Figure 2. Effect of erythritol addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant2.1.3 柠檬酸添加量对软糖感官品质的影响
柠檬酸作为天然的酸味剂加入到软糖制作过程中，也可增强软糖的抗氧化性，延长食品保质期。柠檬酸添加太少，软糖风味过于甜腻，添加过多又会导致软糖过酸，影响软糖口感及风味。
由图3可知，随着柠檬酸添加量的增加，感官评分也在逐渐增加，柠檬酸添加量较少时，感官评分较低，在添加量为0.14%时达到最大，铁皮石斛软糖的口感最好，酸度适宜，再添加反而感官评分下降，这可能是因为柠檬酸添加量过多，口感较酸。因此在响应面试验中柠檬酸的添加量确定为0.10%~0.18%。
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图 3 柠檬酸添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响Figure 3. Effect of citric acid addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant2.1.4 铁皮石斛添加量对软糖感官品质的影响
铁皮石斛汁具有淡淡青草味道，其添加量会影响软糖风味及质地，由图4可知，随着铁皮石斛汁添加量的增加，感官评分呈现出上升趋势，但增加趋势较为平缓，因为铁皮石斛汁风味较淡，感官评分中该因素影响不明显；添加量太少，可能保健效果不能达到预想效果，软糖甜度也会较高，铁皮石斛风味较弱，难以体现出铁皮石斛软糖的口感，从而感官评分较低。添加太多使软糖质地柔软，影响软糖质地。在添加量为100%时最优，因此响应面试验中确定铁皮石斛汁的添加量为70%~130%。
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图 4 铁皮石斛添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响Figure 4. Effect of Dendrobium officinale addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant2.2 响应面试验结果
2.2.1 数据结果分析
根据单因素实验的结果分析，运用Box-Behnken响应面优化方法，设计4因素3水平试验，对赤藓糖醇添加量A、明胶添加量B、铁皮石斛添加量C、柠檬酸添加量D这4个因素进行优化，结果见表3、表4。
表 3 响应面试验设计及结果Table 3. Response surface test design and results试验号 因素 A赤藓糖醇 B明胶 C铁皮石斛 D柠檬酸 感官评分（分） 1 1 0 −1 0 75.70 2 −1 0 0 1 74.20 3 1 1 0 0 74.20 4 0 0 0 0 83.00 5 −1 0 0 −1 72.75 6 0 0 −1 1 76.00 7 −1 0 1 0 76.00 8 0 0 −1 −1 75.00 9 0 0 0 0 83.25 10 0 −1 0 −1 73.00 11 0 1 0 1 75.50 12 1 0 0 1 69.50 13 0 0 0 0 83.25 14 0 0 1 −1 73.75 15 0 0 0 0 83.25 16 0 0 0 0 83.25 17 1 0 1 0 72.00 18 1 0 0 −1 69.50 19 1 −1 0 0 72.70 20 0 1 1 0 77.70 21 0 −1 0 1 72.50 22 −1 0 −1 0 78.20 23 −1 −1 0 0 77.00 24 0 0 1 1 72.00 25 −1 1 0 0 77.75 26 0 1 −1 0 79.25 27 0 −1 1 0 75.50 28 0 1 0 −1 74.25 29 0 −1 −1 0 79.00 表 4 模型的显著性检验及方差分析Table 4. Significance test and analysis of variance of the model来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr>F 显著性 模型 477.56 14 34.11 214.69 <0.0001 ** A赤藓糖醇添加量 41.44 1 41.44 260.82 <0.0001 ** B明胶添加量 6.68 1 6.68 42.01 <0.0001 ** C铁皮石斛添加量 21.87 1 21.87 137.65 <0.0001 ** D柠檬酸添加量 0.18 1 0.18 1.10 0.3115 AB 0.14 1 0.14 0.89 0.3628 AC 0.56 1 0.56 3.54 0.0809 AD 0.53 1 0.53 3.31 0.0904 BC 0.95 1 0.95 5.98 0.0283 * BD 0.77 1 0.77 4.82 0.0455 * CD 1.89 1 1.89 11.90 0.0039 ** A2 176.66 1 176.66 1111.89 <0.0001 ** B2 53.15 1 53.15 334.52 <0.0001 ** C2 45.34 1 45.34 282.35 <0.0001 ** D2 287.93 1 287.93 1812.19 <0.0001 ** 残差 2.22 14 0.16 失拟项 1.77 10 0.18 1.58 0.3503 不显著 纯误差 0.45 4 0.11 总和 479.78 28 R2=0.9954 R2Adj=0.9907 注：**为极显著项（P<0.01），*为显著项（P<0.05）。 用Design Expert 8.0.6进行实验设计，优化出29组试验，进行回归拟合，得到铁皮石斛软糖感官评分的二次多项回归方程为：感官评分=83.40−1.86A+0.75B−1.35C+0.12D+0.19AB−0.38AC−0.36AD+0.49BC+0.44BD−0.69CD−5.22A2−2.86B2−2.64C2−6.66D2。
分析二次多项回归方程，一次项系数绝对值大小顺序为：A>C>B>D，可得出影响铁皮石斛软糖感官评分的因素顺序为赤藓糖醇添加量A>铁皮石斛添加量C>明胶添加量B>柠檬酸添加量D；二次项系数的值分别为−5.22、−2.86、−2.64、−6.66，可得出该二次回归方程有最大值点，因此，该模型对铁皮石斛软糖感官评分变化的各因素组合优化分析是有效的。
由表4可知，模型P<0.0001，具有高度显著性，说明选择的模型有意义，失拟项P=0.3503>0.05，说明模型失拟项无显著性差异；回归系数R2=0.9954，R2Adj=0.9907，说明该方程对实验拟合情况良好，实验误差比较小，说明通过软件建立铁皮石斛软糖的模型是可靠的，可用该模型预测不同成分添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响。
由回归模型系数的显著性检验结果可以看到，模型的一次项赤藓糖醇添加量A、明胶添加量B、铁皮石斛添加量C，二次项A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，说明A、B、C这3个因素对响应值（感官评分）均为极显著影响；明胶添加量和铁皮石斛添加量交互项BC、明胶添加量和柠檬酸添加量交互项BD、铁皮石斛添加量及柠檬酸添加量CD的P值小于0.05，对铁皮石斛软糖感官评分有显著差异，其余交互项AB、AC、AD对铁皮石斛软糖感官评分影响不显著；F值的大小可表示各因素对铁皮石斛软糖感官评分影响的大小，由FA=260.82、FB=42.01、FC=137.65、FD=1.10可说明各单因素的添加量对铁皮石斛软糖的影响强弱为：赤藓糖醇添加量A>铁皮石斛添加量C>明胶添加量B>柠檬酸添加量D。
2.2.2 单因素两两交互作用分析
为了更加直观地反映各因素交互作用对感官评分的影响，设定赤藓糖醇添加量、明胶添加量、铁皮石斛添加量、柠檬酸添加量中两个因素不变，分析另外两个因素对铁皮石斛软糖感官评分的影响，利用软件绘制3D曲面图，通过每个曲面的弯曲弧度来判断两两因素对感官评分的影响强弱，从图5可知，3个交互图均呈不同程度凹形曲面，说明4个因素之间均有交互效应，由图5和表4可知，模型中的赤藓糖醇添加量、明胶添加量、铁皮石斛汁添加量的一次项对铁皮石斛软糖的感官评分有显著影响，赤藓糖醇添加量、明胶添加量、柠檬酸添加量、铁皮石斛汁添加量的二次项对铁皮石斛软糖的感官评分均有显著影响，且明胶添加量和铁皮石斛添加量的交互作用、铁皮石斛添加量及柠檬酸添加量、明胶添加量和柠檬酸添加量的等高线更接近于椭圆，交互性明显，则表明对铁皮石斛软糖的感官评分影响较为显著影响，其他两两之间的交互作用较小，对铁皮石斛软糖感官评分影响不明显。
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图 5 两两因素交互作用对铁皮石斛软糖感官评分的影响的响应面图Figure 5. Response surface diagram of the influence of interaction of two factors on sensory score of Dendrobium officinale fondant2.2.3 铁皮石斛软糖配方优化确定与验证
通过 Design Expert 软件对铁皮石斛软糖的优化试验结果，得出优化的工艺配方：赤藓糖醇添加量29.16%，铁皮石斛添加量92.90%，明胶添加量18.32%、柠檬酸添加量0.14%，预期感官评分为83.75分。为了方便实验操作，将实验条件修正为：赤藓糖醇添加量29.20%，铁皮石斛添加量92.90%，明胶添加量18.30%、柠檬酸添加量0.14%。在该条件下铁皮石斛软糖产品的感官评分为83.50分，与理论值接近。按上述优化配方进行验证实验，重复5次，所制得的铁皮石斛软糖口感良好，酸甜适中，硬度正好，不粘牙，进而验证了铁皮石斛软糖配方模型的可靠，具有实用价值。根据实际操作的可行性，将工艺配方调整为赤藓糖醇添加量为29.20%，铁皮石斛添加量92.90%，明胶添加量18.30%，柠檬酸添加量0.14%。
2.3 铁皮石斛软糖中还原糖含量及多酚含量的测定结果
通过一系列理化实验对铁皮石斛软糖中还原糖含量进行测定，以葡萄糖溶液标定碱性酒石酸铜溶液所用的平均体积为9.8 mL，计算碱性酒石酸溶液相当于葡萄糖的质量为1765.57 mg，按式（1）计算的铁皮石斛软糖中还原糖含量为30.03 g/100 g。通过多酚理化测定实验，结果表明没食子酸在浓度0~50 μg/mL与吸光值呈现良好的线性关系。根据标准曲线计算得1 mL提取液定容后的多酚含量为33.79 mg/mL，所得结果用每克铁皮石斛软糖样品中没食子酸的量表示，根据式（2）计算得出，铁皮石斛软糖多酚含量为0.85 mg/g。
2.4 铁皮石斛的体外抗氧化活性
2.4.1 DPPH自由基清除能力
铁皮石斛软糖对DPPH的清除能力见图6。在所选浓度范围内，铁皮石斛软糖对DPPH的清除能力与其浓度呈正相关，即随着浓度的增加而增强。当浓度达到1 mg/mL时，样品及VC对DPPH的清除率均达到最大。铁皮石斛软糖对DPPH的清除能力与VC相当，这可能是因为铁皮石斛中含有的黄酮及其他活性物质，对DPPH自由基产生了一定的清除能力[35]，通过Excel分析，铁皮石斛软糖、VC对DPPH自由基清除的半数有效浓度（IC50）分别为0.50、0.42 mg/mL，同时由图6可知铁皮石斛软糖对DPPH的清除能力低于VC[36-38]。
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图 6 铁皮石斛软糖与VC对DPPH自由基的清除能力Figure 6. DPPH radical scavenging ability of Dendrobium officinale fondant and VC2.4.2 还原能力
由图7可知，铁皮石斛软糖溶液对-OH具有清除能力，在0.6 mg/mL时与VC对-OH清除能力逼近，在所选浓度范围内，随着浓度的增加，吸光值逐渐增大，还原能力呈显著地线性增加的趋势。由图7可以看出，当浓度达到1 mg/mL时，样品与VC的还原能力均达到最高。
2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力
铁皮石斛软糖的超氧阴离子自由基清除能力见图8。根据图8可以看出，随着铁皮石斛软糖溶液稀释倍数的减少，其质量浓度提高，对超氧阴离子自由基清除能力也逐渐提升，因此表明其体外抗氧化活性逐渐增强。当浓度达到1 mg/mL时，样品及VC对超氧阴离子自由基的清除能力同样达到最强。铁皮石斛软糖、VC清除超氧阴离子自由基的半数有效浓度（IC50）值为0.13、0.11 mg/mL。
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图 8 铁皮石斛软糖与VC对超氧阴离子自由基清除率Figure 8. Clearance of superoxide anion radical by Dendrobium officinale fondant and VC2.5 铁皮石斛软糖的质构特性
由表5可得出，随着明胶添加量的增加，软糖的硬度、弹性提高，且通过多次预实验得出按1:10榨出的铁皮石斛汁具有一定的粘性，可更好地与明胶结合，使得软糖的硬度、弹性都有所提高，最终根据响应面试验结果得出的最优配方制作软糖，运用质构仪对铁皮石斛软糖的硬度、弹性等各项指标进行测定。李丹丹等[39]通过对凝胶软糖进行质构特性研究，证明了硬度在5000~10000 g之间，软糖软硬适宜，本研究中通过质构实验所测得软糖的硬度为4600~4800 g之间，两者相比较，本产品质地应偏软，同时咀嚼性类似于胶着性，在4200~4600 g之间，由此得出本产品胶着性较好，可能是因为铁皮石斛汁本身的黏性与明胶相互作用，从而增强了软糖的胶着性及硬度。因此，通过最优配方制出的咀嚼性在4200~4300 g、硬度在4600~4800 g范围内的铁皮石斛软糖软硬适中；咀嚼性较好，接受度较高；根据表5中的实验数据可得出铁皮石斛软糖符合TPA指标值的咀嚼性=硬度×黏聚性×弹性，由此得出，软糖的咀嚼性与硬度、黏聚性、弹性的大小有关[40-43]。
表 5 铁皮石斛软糖质构特性测定结果Table 5. Test data of texture characteristics of Dendrobium officinale fondant实验次数 硬度（g） 弹性 粘聚性 胶着性（g） 咀嚼性（g） 回复性 1 4678.95±8.25 0.853±0.75 0.942±0.65 4405.242±7.45 4256.979±12.4 0.609±0.15 2 4676.34±6.02 0.957±0.86 0.963±0.17 4503.088±6.66 4308.149±6.23 0.571±0.05 3 4755.53±4.81 0.963±0.65 0.941±0.45 4474.458±9.05 4309.208±1.98 0.698±0.13 3. 结论
本课题研究了铁皮石斛软糖的最佳配方：赤藓糖醇添加量29.20%，铁皮石斛添加量92.90%，明胶添加量18.30%、柠檬酸添加量0.14%，此时所得的软糖的感官评分为83.50分；并对铁皮石斛软糖中还原糖含量及多酚含量进行测定，其中还原糖含量为30.03 g/100 g，多酚含量为0.85 mg/g。铁皮石斛软糖的体外抗氧化活性与VC相近，铁皮石斛软糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的半数有效浓度（IC50）为0.50 mg/mL、对超氧阴离子自由基的IC50值为0.13 mg/mL，随着溶液质量浓度的增加，其抗氧化能力均呈现出明显的上升趋势，表明铁皮石斛软糖具有良好的抗氧化性。经过对最优配方下的铁皮石斛软糖进行多次重复质构实验后，咀嚼性在4200~4300 g、硬度在4600~4800 g范围内的铁皮石斛软糖软硬适中，咀嚼性较好，接受度较高。本研究通过对铁皮石斛软糖配方、还原糖含量、多酚含量、体外抗氧化能力及质构特性的研究，为铁皮石斛在食品领域的应用提供了一定的理论基础，并有望为铁皮石斛的深加工提供新的研究思路。
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图 1 明胶添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响
Figure 1. Effect of gelatin addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant
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图 2 赤藓糖醇添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响
Figure 2. Effect of erythritol addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant
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图 3 柠檬酸添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响
Figure 3. Effect of citric acid addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant
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图 4 铁皮石斛添加量对铁皮石斛软糖感官评分的影响
Figure 4. Effect of Dendrobium officinale addition on sensory score of Dendrobium officinale fondant
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图 5 两两因素交互作用对铁皮石斛软糖感官评分的影响的响应面图
Figure 5. Response surface diagram of the influence of interaction of two factors on sensory score of Dendrobium officinale fondant
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图 6 铁皮石斛软糖与VC对DPPH自由基的清除能力
Figure 6. DPPH radical scavenging ability of Dendrobium officinale fondant and VC
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图 8 铁皮石斛软糖与VC对超氧阴离子自由基清除率
Figure 8. Clearance of superoxide anion radical by Dendrobium officinale fondant and VC
表 1 响应面试验设计因素水平
Table 1 Level of response surface test design factors
因素 水平 −1 0 1 A赤藓糖醇添加量（%） 25 30 35 B明胶添加量（%） 15 18 21 C铁皮石斛添加量（%） 70 100 130 D柠檬酸添加量（%） 0.10 0.14 0.18 
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表 2 铁皮石斛软糖感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standard of Dendrobium officinale fondant
指标 评分标准 分值
（分）各指标
总分口感 口感细腻，咀嚼性好，软硬适中，不粘牙 16~20 20 口感一般，咀嚼性一般，偏软或偏硬，稍粘牙 9~15 口感差，咀嚼性差，过软或过硬，过粘牙 0~8 色泽 颜色均匀，有光泽 16~20 20 颜色不均匀，有一定光泽 9~15 颜色不均匀，暗淡无光泽 0~8 滋味和
风味甜而不腻，铁皮石斛味柔和，风味适宜 16~20 20 甜味较腻或较淡，铁皮石斛味较淡，风味一般 9~15 甜味很腻或很淡，铁皮石斛味过重或无味，
风味极差0~8 组织
形态软硬适度，无气泡，质地均匀细腻，表面不粘手 16~20 20 硬度稍硬，有些许气泡，质地基本均匀，
表面稍粘手9~15 硬度过软，有较大气泡，质地不均匀，表面粘手 0~8 总体
情况形态宜人，颜色纯正，无杂质 16~20 20 有裂纹或有凹陷、有凸起，颜色稍有异常，
有少许杂质9~15 形态扭曲，颜色有明显异常，杂质较多 0~8
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表 3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface test design and results
试验号 因素 A赤藓糖醇 B明胶 C铁皮石斛 D柠檬酸 感官评分（分） 1 1 0 −1 0 75.70 2 −1 0 0 1 74.20 3 1 1 0 0 74.20 4 0 0 0 0 83.00 5 −1 0 0 −1 72.75 6 0 0 −1 1 76.00 7 −1 0 1 0 76.00 8 0 0 −1 −1 75.00 9 0 0 0 0 83.25 10 0 −1 0 −1 73.00 11 0 1 0 1 75.50 12 1 0 0 1 69.50 13 0 0 0 0 83.25 14 0 0 1 −1 73.75 15 0 0 0 0 83.25 16 0 0 0 0 83.25 17 1 0 1 0 72.00 18 1 0 0 −1 69.50 19 1 −1 0 0 72.70 20 0 1 1 0 77.70 21 0 −1 0 1 72.50 22 −1 0 −1 0 78.20 23 −1 −1 0 0 77.00 24 0 0 1 1 72.00 25 −1 1 0 0 77.75 26 0 1 −1 0 79.25 27 0 −1 1 0 75.50 28 0 1 0 −1 74.25 29 0 −1 −1 0 79.00
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表 4 模型的显著性检验及方差分析
Table 4 Significance test and analysis of variance of the model
来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr>F 显著性 模型 477.56 14 34.11 214.69 <0.0001 ** A赤藓糖醇添加量 41.44 1 41.44 260.82 <0.0001 ** B明胶添加量 6.68 1 6.68 42.01 <0.0001 ** C铁皮石斛添加量 21.87 1 21.87 137.65 <0.0001 ** D柠檬酸添加量 0.18 1 0.18 1.10 0.3115 AB 0.14 1 0.14 0.89 0.3628 AC 0.56 1 0.56 3.54 0.0809 AD 0.53 1 0.53 3.31 0.0904 BC 0.95 1 0.95 5.98 0.0283 * BD 0.77 1 0.77 4.82 0.0455 * CD 1.89 1 1.89 11.90 0.0039 ** A2 176.66 1 176.66 1111.89 <0.0001 ** B2 53.15 1 53.15 334.52 <0.0001 ** C2 45.34 1 45.34 282.35 <0.0001 ** D2 287.93 1 287.93 1812.19 <0.0001 ** 残差 2.22 14 0.16 失拟项 1.77 10 0.18 1.58 0.3503 不显著 纯误差 0.45 4 0.11 总和 479.78 28 R2=0.9954 R2Adj=0.9907 注：**为极显著项（P<0.01），*为显著项（P<0.05）。
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表 5 铁皮石斛软糖质构特性测定结果
Table 5 Test data of texture characteristics of Dendrobium officinale fondant
实验次数 硬度（g） 弹性 粘聚性 胶着性（g） 咀嚼性（g） 回复性 1 4678.95±8.25 0.853±0.75 0.942±0.65 4405.242±7.45 4256.979±12.4 0.609±0.15 2 4676.34±6.02 0.957±0.86 0.963±0.17 4503.088±6.66 4308.149±6.23 0.571±0.05 3 4755.53±4.81 0.963±0.65 0.941±0.45 4474.458±9.05 4309.208±1.98 0.698±0.13
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