Effects of Tetrastigma hemsleyanum Superfine Powder on Intestinal Microflora in Rats with Alcohol-Induced Liver Injury
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摘要: 目的：研究三叶青超微粉能否缓解酒精引起的肝损伤，并探讨其保护作用机制，为开发酒精性肝损伤辅助治疗产品提供新的研究思路。方法：连续给予大鼠8周酒精制备肝损伤模型，同时给予大鼠灌胃不同剂量的三叶青超微粉，观察其对酒精性肝损伤的保护作用。检测大鼠血清中ALT、AST、ALP和肝组织中GSH、SOD、MDA的变化，观察肝组织病理切片损伤情况，并采集粪便提取基因组DNA，进行16S rDNA 全长测序分析。结果：与模型组比较，三叶青中、高剂量（0.5和1.0 g·kg−1）可显著降低大鼠ALT、AST和ALP水平及MDA含量（P<0.05），提高SOD和GSH活性，减轻肝组织病变。肝组织切片证实，三叶青超微粉明显改善酒精所引起的肝细胞肿胀和脂肪变性，治疗效果类似于阳性药联苯双酯。肠道菌群分析表明，酒精性肝损伤大鼠肠道菌群结构发生显著变化；三叶青、阳性药干预对肠道菌群在门、属、种水平上较模型组均有一定程度的改善；三叶青能有效恢复因酒精增加的普雷沃菌属，降低的约氏乳杆菌、毛杆菌丰度，效果优于阳性药对照组（P<0.05）。结论：首次验证了三叶青超微粉对大鼠酒精性肝损伤有明显的保护作用，其机制可能与其抗氧化应激作用及肠道菌群的调节有关。Abstract: Objective: To investigate and reveal protective mechanism which the Tetrastigma hemsleyanum (SYQ) ultramicro powder alleviate alcohol-induced liver injury, and to provide a new research idea for clinical treatment of alcohol-induced liver injury. Methods: The rat model of alcoholic liver injury was established by continuous administration of alcohol for 8 weeks. At the same time, rats were given different doses SYQ ultramicro powder by intragastric to observe its protective effect on liver injury. Changes of ALT, AST, ALP and GSH, SOD, MDA were detected in serum and liver tissue, respectively. Pathological sections of liver tissue were used to observe the damage. Genomic DNA was extracted from feces and analyzed by 16S rDNA full-length sequencing. Results: Compared with the model group, medium and high doses of SYQ (0.5 and 1.0 g·kg−1) significantly (P<0.05) reduced the levels of ALT, AST ALP and MDA, increased the activities of SOD and GSH, and alleviated the liver lesions in rats. The pathological sections revealed that SYQ ultramicro powder dramatically alleviated liver cells swelling and steatosis, and these effectiveness were similar to the group of bifendate. Intestinal microflora analysis showed that the intestinal microflora structure significantly changed in rats with alcoholic liver injury. Compared with the model group, both SYQ and bifendate intervention improved the intestinal flora to a certain extent at phylum, genus and species level. SYQ effectively recovered the abundance of Prevotella, Lactobacillus_johnsonii, Raoultibacter_massiliensis altered by alcohol, and the effect of medium doses of SYQ was better than positive control group (P<0.05). Conclusion: The SYQ superfine powder had a significant protective effect on alcoholic-induced liver injury in rats, the mechanism may be related to its antioxidant stress and intestinal flora regulation.
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有害饮酒被列为全球死亡和残疾的前五大危险因素之一，据报道每年约造成250万人死亡，约6940万人残疾[1]。酒精仍然是肝病发生和死亡的主要原因，过度饮酒导致肝损伤已成为全球令人担忧的健康问题。酒精性肝病（ALD）与一系列肝脏疾病有关，从脂肪变性到脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌[2-3]。有研究表明，饮酒可引起肠道菌群失调，从而导致有益微生物代谢产物的减少和有害微生物代谢产物的产生，进而导致肠道通透性增加和细菌易位，引发各种酒精性肝病。因此，肠道菌群被认为是ALD潜在的治疗靶点[4]。
三叶青（SYQ）是我国特有珍稀植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，葡萄科崖爬藤属）的块根，形状似红薯，富含淀粉、黄酮、花青素等成分，是一种民间极具盛名的食药两用植物，具有护肝防癌等多种功效[5]，对小鼠免疫性肝损伤以及由四氯化碳或者α-异硫氰酸萘酯诱导的肝损伤具有治疗和保护作用[6-9]。
原料经过初步粉碎，再采用特殊机械进一步粉碎直至粒径达到1~75 μm的超细粉末被称为超微粉[10]。超微粉碎可增加原料的比表面积和孔隙率、提高溶出速率和生物利用度，特别是非水溶性成分的生物利用度，进而提高有效成分在体内的吸收速率，提高功效。如党参超微粉对溃疡的抑制率比普通粉高54%；菊苣根超微粉可改善免疫抑制导致的肠道菌群紊乱，用量仅约为普通粗粉的50%[11-12]。目前国内外对三叶青超微粉的研究较少，特别是对肠道菌群的调节功能鲜见报道[13]。
因此，本文以酒精性肝损伤大鼠为研究对象，考察三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠的改善作用及其对肠道菌群的影响，为以三叶青超微粉作为主要原料的保肝护肝及肠道菌群调节产品的开发提供更多的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级SD大鼠 6周龄，60只，雌、雄各半，体重180~210 g左右，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号[SYXK（桂）2014-0003]，饲养于广西医科大学实验动物中心，恒温21~23 ℃，恒湿（45%~65%），各12 h明暗周期的饲养室，普通饲料喂养，自由进食和饮水，动物实验经广西医科大学动物伦理委员会批准；三叶青 采集于百色兴业县三叶青种植基地，挑选出无虫孔，颜色形状正常的块根，洗净表面泥沙等杂质，自然晒干，用中药粉碎机预粉碎后，用CJM-SY-A KC-701型超微粉碎机粉碎至中位粒径达到30~40 µm；56度白酒 北京红星股份有限公司；联苯双酯滴丸 北京协和药厂；过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；其它试剂 均为分析纯。
CJM-SY-A KC-701型超微粉碎机 北京开创同和科技发展有限公司；BS-2000型全自动化学分析仪 深圳迈瑞科技股份有限公司；5810R型高速低温离心机 德国Eppendorf公司；CX31+DP73型倒置显微镜 奥林巴斯有限公司；MK3-EL800光吸收酶标仪 美国BioTek公司。
1.2 实验方法
1.2.1 造模与给药
将动物随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组（联苯双酯LBSZ 150 mg·kg−1）和三叶青超微粉低（0.25 g·kg−1）、中（0.5 g·kg−1）、高（1.0 g·kg−1）剂量组。除正常对照组给同剂量的生理盐水外，其余各组大鼠均用白酒灌胃造模，参照刘明等[14]的造模方法，30°白酒1 mL/（200 g·d）灌胃1周后，改为56°白酒1 mL/（200 g·d）灌胃1周，最后增至56°白酒2 mL/（200 g·d）灌胃至造模成功，即连续灌胃8周。每天给酒4 h后，阳性对照组和3个三叶青剂量组各大鼠1 mL/200 g灌胃给药8周直至实验结束，正常对照组和模型组灌胃同体积的生理盐水。
1.2.2 样品采集
参照刘泽鑫、朱诗雅等[15-16]的方法，末次给药后，无菌条件下采集各组大鼠新鲜粪便，−80 ℃备用。动物禁食不禁水，24 h后经麻醉心脏取血，测定血清生化指标。另外取肝组织固定于多聚甲醛固定液，用于做病理切片。其余肝组织用预冷生理盐水清洗后，冻存于−80 ℃冰箱，备用。
1.2.3 血清生化指标的检测
参照刘泽鑫、朱诗雅等[15-16]的方法，使用全自动生化分析仪测定各种动物的血液生化指标：谷丙转氨酶（alanine aminotrans-ferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）。
1.2.4 肝组织生化指标的检测
参照刘泽鑫、朱诗雅等[15-16]的方法，称取适量的肝组织，按重量体积比（组织:生理盐水=1:9）加入冰冷的生理盐水，剪碎，冰上匀浆，3000 r·min−1离心10 min，制成10%肝组织匀浆，过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）及蛋白定量按照试剂盒说明书操作。
1.2.5 组织病理检查
参照刘泽鑫、朱诗雅等[15-16]的方法，将固定于多聚甲醛的部分肝大叶先用石蜡包埋，然后进行切片，通过常规苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光学显微镜下观察组织病理变化。
1.2.6 大鼠肠道菌群分析
参照Shin等[17]的方法，称取200 mg粪便样品，按照DNA提取试剂盒说明书上的操作步骤对各样本DNA进行提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA的完整性。取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应的融合引物（全长16S扩增引物：27F--AGRGTTYGATYMTGGCTCAG和1492R--RGYTACCTTGTTACGACTT）配制PCR反应体系，设置PCR反应参数进行PCR扩增。使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择pacbio平台进行16S全长测序。
1.3 数据处理
数据均以平均值±标准偏差表示，因实验过程中有个别组的小鼠会有死亡1~2只的情况，所以n=8~10。生理指标数据统计分析采用统计软件SPSS18.0，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组内两两比较采用LSD法。菌群数据分析使用USEARCH（v11.0.667）进行OTU聚类结果统计，R（v3.2.1）的mixOmics包用于OTU PLS-DA分析，R（v3.1.1）的Venn Diagram包用于绘制韦恩图，RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析。软件mother（v.1.31.2）用于统计Alpha多样性。LEfSe软件进行物种差异分析，Picrust软件进行菌群功能预测。以上软件均使用默认参数运行。
2. 结果与分析
2.1 大鼠一般情况
造模过程中，正常对照组大鼠饮食及大便规律，皮毛色泽光亮，行动灵活，体重增长较快；模型组大鼠在每日给予酒精灌胃后出现反应慢，步态不稳，精神萎靡且部分呈现嗜睡状态，持续约2 h，而2周后该组大鼠皮毛色泽变暗，粗糙，精神状态不佳，进食量减少，体重增加变缓；三叶青给药组和阳性对照组大鼠一般情况优于模型组。
2.2 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST和ALP的影响
如图1所示，与正常对照组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST、ALP浓度均明显升高约1.5倍。与模型组相比，阳性对照组大鼠血清的ALT、AST和ALP浓度明显降低；中、高剂量实验组大鼠血清中的ALT、AST和ALP浓度均有所降低，其中，在中剂量组大鼠中，ALT浓度降低至（36.33±3.79） U·L−1（P<0.05），AST浓度降低至（135.11±21.24） U·L−1（P<0.01），ALP浓度降低至（85.00±41.21） U·L−1（P<0.05）；在高剂量组大鼠中，ALT、AST和ALP浓度均降低，但无显著性差异；低剂量组大鼠血清中的ALT、AST、ALP浓度均无显著性变化。
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图 1 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST和ALP的影响注：A 血清ALT浓度，B 血清AST浓度，C 血清ALP浓度；数据均以平均值±标准偏差表示；n=8~10，*P<0.05，**P<0.01。Figure 1. Effects of SYQ on the activity of ALT, AST and ALP induced by ethanol in rat serum上述结果提示，酒精连续灌胃8周后，可引起大鼠肝脏转氨酶升高，显示出肝脏毒性，联苯双酯、中剂量三叶青对酒精导致的大鼠肝损伤具有保护作用，高剂量三叶青对酒精导致的大鼠肝损伤可能具有保护作用，低剂量三叶青对酒精导致的大鼠肝损伤未显示出保护作用。
2.3 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织氧化应激指标的影响
如图2所示，与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏中GSH、SOD浓度均降低，而MDA浓度升高。与模型组相比，阳性药组和低、中、高剂量组大鼠肝脏中GSH、SOD浓度均有所升高，MDA浓度下降。其中，在中剂量组实验大鼠中，GSH浓度升高至（4.18±0.45） μg·mg−1（P<0.01），SOD浓度升高但无显著性差异，MDA浓度降低至（0.54±0.14） nmol·mg−1（P<0.05）；在低剂量组实验大鼠中，GSH、SOD浓度升高但无显著性差异，MDA浓度降低至（0.55±0.22） nmol·mg−1（P<0.05）；在高剂量组实验大鼠中，SOD浓度升高至（9505.51±1252.47） U·mg−1（P<0.05），GSH、MDA浓度有变化但无显著性差异。
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图 2 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织GSH、SOD和MDA的影响注：A 肝组织GSH活性，B 肝组织SOD活性，C 肝组织MDA活性；数据均以平均值±标准偏差表示；n=8~10，*P<0.05，**P<0.01。Figure 2. Effects of SYQ on GSH, SOD and MDA in liver tissue of rat caused by ethanol上述结果提示，连续灌胃8周酒精后，可引起大鼠肝脏中MDA水平升高，GSH和SOD水平降低，表现出氧化应激损伤。中剂量三叶青可改善酒精所引起的氧化应激水平变化，而低、高剂量三叶青虽也能改善氧化应激水平，但无明显剂量依赖性。
2.4 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理观察
如图3所示，在正常对照组中（3A），可见肝小叶结构清楚，细胞索排列整齐，肝血窦正常；在模型组中（3B），可见肝细胞肿胀，胞质内出现弥漫性的圆形脂滴，肝小叶界限模糊，小叶内出现多个点状或灶状坏死，汇管区见大量炎症细胞浸润。三叶青各剂量组（3D、3E、3F）及阳性对照组（3C）肝细胞肿胀减轻，脂肪变性及炎症细胞浸润均较模型组有所改善。
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图 3 各组大鼠肝脏组织病理学表现（HE, 200×）注：A 正常对照组，B 模型组，C 阳性对照组，D SYQ低剂量组，E SYQ中剂量组，F SYQ高剂量组；图中蓝色剪头所指为脂滴。Figure 3. Histopathological changes of each group（HE, 200×）上述结果提示，连续灌胃8周酒精后，可引起大鼠肝细胞肿胀和弥漫性脂滴等损伤，结合生理指标的变化，说明ALD模型造模成功。三叶青超微粉明显改善酒精所引起的肝细胞肿胀和脂肪变性，治疗效果类似于阳性对照药联苯双酯，疗效中剂量组>高剂量组>低剂量组。
2.5 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的影响
2.5.1 OTU聚类分析
以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，OTU表示一组来源于某一相同分类单元的序列，OTU数量越大说明微生物群落的多样性越大。如图4所示，共产生795个OTU，其中CK:674，M:566，Y:592，ST:644，所有样品共有的OTU数目为393个，约占总OTU数的49%，其余各组独有的OTU数目分别为CK:42，M:2，Y:23，ST:19。酒精处理会降低大鼠肠道菌群多样性，三叶青和阳性药均可使物种多样性得到改善。如图5所示，OTU累积曲线图末端上升趋势趋于平缓，表明采样量足够，继续增加测序深度只会产生少量新的OUT。
2.5.2 OTU PLS-DA分析
为了更好地分析各组间差异，进行了PLS-DA分析。如图6所示，模型组（M）、阳性对照组（Y）、三叶青中剂量组（ST）均与正常对照组（CK）明显区分开来，说明酒精处理可对大鼠肠道微生物物种多样性造成显著差异，三叶青中剂量组（ST）与模型组（M）之间差异较小。
2.5.3 Alpha多样性
Alpha多样性是反映物种丰富度和均匀度的综合指标。选择observed Species指数、Chao指数、ACE指数，Shannon指数以及Simpson指数评价其Alpha多样性。前4个指数越大，最后一个指数越小，说明样品中的物种越丰富。其中，observed Species指数、Chao指数和ACE指数反映样品中群落的丰度，只与群落中物种的数量有关，与群落中每个物种的丰度无关；Shannon指数和Simpson指数反映群落的多样性，与样品群落中物种丰度和物种均匀度有关。如表1所示，前三项指标指示各样品的物种丰度规律较一致，由高到低依次为：正常对照组（CK）>三叶青中剂量组（ST）≈阳性对照组（Y）>模型组（M），说明灌胃酒精会显著降低大鼠肠道菌群物种丰度，三叶青或阳性药组大鼠肠道菌群物种丰度有所升高，效果相近，但未见统计学差异。后两项指标指示样品的物种多样性和均匀度变化与丰度变化一致。
表 1 Alpha多样性指数Table 1. Alpha diversity index分组 sobs Chao ACE Shannon Simpson coverage 正常对照组 425.25±37.23* 529.60±55.88* 509.57±58.90* 4.75±0.08* 0.02±0.00* 0.98±0.003 模型组 351.50±40.44 450.48±56.42 453.59±55.33 4.01±0.64 0.08±0.05 0.98±0.004 阳性对照组 364.00±31.86 472.89±35.95 474.82±42.31 4.40±0.37 0.05±0.03 0.98±0.007 三叶青中剂量组 364.75±18.77 478.55±45.97 472.17±45.79 4.42±0.11 0.04±0.02 0.98±0.005 注：同列中*表示差异显著P<0.05。 2.5.4 三叶青超微粉诱导酒精性肝损伤大鼠肠道菌群结构变化
通过与数据库比对，将OTU在不同的分类等级进行分类并注释，得到物种注释柱状图。如图7所示，在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）在所有样品中占绝对优势，其相对丰度之和均在80%以上。与正常对照组相比，模型组厚壁菌门丰度极显著降低（P<0.01），拟杆菌门、变形菌门丰度显著升高（P<0.05），三叶青中剂量组、阳性对照组均可使其得到恢复，且三叶青中剂量组效果更优。如图8所示，在属水平上，与正常对照组相比，模型组普雷沃菌属（Prevotella）、厌氧螺菌属（Anaerobiospirillum）显著增加（P<0.05），三叶青中剂量组、阳性药对照组均得到恢复，普雷沃菌属三叶青效果更优，厌氧螺菌属阳性药更优；模型组、三叶青中剂量组、阳性药对照组较正常对照组Lachnoclostridium、乳杆菌属（Lactobacillus）、Muribaculum、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、支原体属（Allobaculum）、真杆菌属（Eubacterium）、罗姆布茨菌（Romboutsia）减少，三叶青中剂量组乳杆菌属、Muribaculum、罗姆布茨菌可得到有效恢复。
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图 7 基于门（phylum）分类水平的分析Figure 7. Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level![]()
图 8 基于属（genus）分类水平的分析Figure 8. Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level如图9所示，在种水平上，模型组、阳性药对照组较正常对照组产粪甾醇真细菌（Eubacterium coprostanoligenes）、肠道粘液杆菌（Muribaculum intestinale）减少，三叶青中剂量组得到恢复；模型组、三叶青中剂量组较正常对照组产琥珀酸厌氧螺杆菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）增加，阳性对照组得到有效恢复；模型组较正常对照组人体普氏菌（Prevotella copri）显著增加，三叶青中剂量组、阳性对照组均得到有效恢复。
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图 9 基于种（species）分类水平的分析Figure 9. Analysis of intestinal microbial flora among groups in species level在种水平上对具有显著性差异（P<0.05）的菌种进行分析，绘制差异菌种热图。如图10所示，模型组（M）约氏乳杆菌（Lactobacillus_johnsonii）、毛杆菌（Raoultibacter_massiliensis）丰度较正常对照组（CK）显著降低，三叶青中剂量组（ST）能有效恢复酒精降低的约氏乳杆菌、毛杆菌丰度，效果优于阳性药对照组（Y）；同时三叶青中剂量组Gabonia_massiliensis、Collinsella_stercoris、普雷沃氏菌（Prevotella_stercorea）、Turicibacter_sanguinis、副腐化梭状芽胞杆菌（Clostridium_paraputrificum ）丰度增加，与其它三组差异显著。相关研究表明约氏乳杆菌具有抗炎、缓解抑郁、提升肠道代谢率、改善过敏等多种益生作用[18-20]；过敏、多发性硬化症等的发生均与普雷沃氏菌丰度减少有关，普雷沃氏菌可参与治疗肥胖、代谢综合征、炎性肠病等，但作用及机制等还需进一步探究验证；Turicibacter_sanguinis在肠道中表达一种神经递质钠转运相关蛋白[21]；Gabonia_massiliensis等其他几个菌种可查证的资料较少，对人体的利弊等还有待进一步研究。
2.5.5 差异物种分析及功能预测
根据多级物种差异判别（LEfSe）分析显示了四组间丰度差异显著的物种，如图11所示，正常对照组（CK）中菌群结构主要以伊格尔兹氏菌目（Eggerthellales）中的伊格尔兹氏菌科（Eggerthellaceae），拟杆菌门（Bacteroidetes）中的臭杆菌科（Odoribacteraceae），厚壁菌门（Firmicutes）中的链球菌科（Streptococcaceae）为代表；而酒精处理后的模型组（M）中菌群结构只剩拟杆菌门中普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）占优势；阳性对照组（Y）中以拟杆菌门中拟杆菌科（Bacteroidaceae），拟杆菌纲（Bacteroidia）拟杆菌目（Bacteroidales），以及草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）为代表，三叶青中剂量组（ST）中则以厚壁菌门中的氨基酸球菌目（Acidaminococcales）氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）为代表。因此，酒精造成大鼠肠道菌群严重失调，采用阳性药和三叶青干预在一定程度上促进了肠道菌群多样性及组成结构的恢复。
基于16S rRNA基因测序数据使用PICRUSt软件预测其功能基因含量，以评估各组微生物之间潜在的功能差异，并采用kruskal test检验差异显著性，筛选出差异显著（P<0.05）的代谢通路并制作热图。如图12所示，与正常对照组（CK）比较，酒精持续灌胃后多条代谢途径出现了显著差异，其中三羧酸循环（TCA cycle），氨基酸降解（Amino Acid Degradation），碳1化合物利用及同化（C1 Compound Utilization and Assimilation）显著升高，而氨和聚氨降解（Amine and Polyamine Degradation），发酵（Fermentation），碳水化合物降解（Carboxylate Degradation），抗生素抵抗（Antibiotic Resistance），氨基酸合成（Amino Acid Biosynthesis），呼吸途径（Respiration）则显著下调。同期三叶青干预后，氨和聚氨降解，发酵途径，抗生素抵抗，呼吸途径均得到了部分恢复。三叶青和阳性药均上调了脂肪酸与脂质降解，电子传递途径，且阳性药的提高幅度更大，此外，阳性对照还提高了三羧酸循环的代谢强度。酒精处理导致肠道微生物发生很大改变，尤其是厚壁菌门物种的相对丰度急剧降低，微生物多样性下降，菌群的潜在功能也被改变。通过阳性药和三叶青的干预，肠道菌群的部分功能得到有效恢复。
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图 12 差异显著的二级代谢途径功能分析热图Figure 12. Heatmap of functional analysis of significantly different secondary metabolic pathways3. 讨论与结论
酒精性肝病（ALD）是一个复杂的过程，包括广泛的肝损害，从脂肪变性到肝硬化、肝癌。细胞损伤、炎症、氧化应激、再生和细菌易位是酒精性肝损伤的关键驱动因素[22]。理想的ALD动物模型应包括ALD过程的所有方面：显著的血清ALT、AST浓度升高、脂肪变性、肝中性粒细胞浸润和肝损伤[23]。而本课题采用连续灌胃的方式制备ALD模型大鼠，结果显示，连续灌胃8周后，模型组大鼠血清中ALT、AST活性明显升高，肝组织肝细胞肿胀，出现大量脂滴和炎性细胞浸润，呈脂肪性病变状态，表明ALD模型制备成功。
酒精性肝损伤的模式包括炎症、不同类型的细胞死亡（主要是凋亡和坏死）、脂肪变性、纤维形成，甚至肝再生。血清ALT和AST水平高低常作为判定肝损伤程度的重要指标。这两种转氨酶肝细胞内的浓度比血清高1000～5000倍，肝细胞发生炎症病变时，引起肝细胞肿胀、坏死和肝细胞膜通透性增高等，ALT、AST由于浓度梯度差释放入血，使血清转氨酶浓度升高。又由于肝脏内转氨酶活性比循环内总活性高104倍，只要有1%肝细胞坏死，血中转氨酶活性增加1倍[1,24]。本研究结果显示，在灌胃酒精的同期，大鼠给予中剂量三叶青，血清中ALT、AST含量均明显降低；三叶青能明显改善酒精所引起的肝细胞肿胀、脂肪变性和炎症细胞浸润，表明适宜剂量的三叶青超微粉对大鼠酒精性肝损伤具有实质性的保护作用。
已有研究表明三叶青黄酮可通过调节Treg/Th17免疫稳态抑制炎症免疫反应，进而改善Con A导致的免疫性肝损伤[25]；三叶青可通过提高肝细胞抗氧化能力、降低膜脂质过氧化、保护肝细胞膜结构和功能完整性而改善CCl4致急性肝损伤[26]；三叶青多糖具有抗氧化应激作用，表现为降低肝脏MDA含量，恢复肝脏抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性[27]；三叶青乙酸乙酯提取物可通过调节HepG2和SMMC-7721细胞的Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达而发挥抗增殖和促凋亡的作用[28]，且HepG2细胞凋亡是通过线粒体-caspase内源性途径介导的，而不是通过死亡受体/caspase-8途径介导，这有助于开发肝母细胞瘤或肝癌的药物治疗[29]。
酒精性肝损伤的发病机制复杂，其中，氧化应激和膜磷脂过氧化作用对酒精性肝损伤的发生和发展起关键作用。长期摄入酒精导致肝组织氧化应激增加、脂质过氧化和抗氧化酶活性降低[30]。丙二醛（MDA）是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应产生的代谢产物，具有细胞毒性。其含量可反映体内脂质过氧化程度，间接反映体内氧自由基生成量和活性，以及机体和细胞的受损程度[31]。本研究中，三叶青超微粉不同剂量组MDA含量明显降低，表明三叶青在机体对抗酒精引起的氧化应激和脂质过氧化的过程中起到了积极作用。经胃肠道吸收，约90%酒精在肝细胞内氧化代谢。当机体一次性大剂量摄入酒精后，超出了肝脏正常的解毒能力，在肝细胞中会产生大量有害自由基，耗竭肝细胞内重要的抗氧化酶。SOD和GSH均是机体重要的氧自由基清除酶，是肝肺等多种组织重要的抗氧化防御因子，能够清除活性氧自由基及其诱发的脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性[32]。本研究中，大鼠给予中、高剂量三叶青超微粉，GSH、SOD活力明显上升，表明三叶青超微粉有助于机体清除酒精代谢过程中产生的自由基，进而有效促进机体抗氧化应激作用，缓解肝损伤。
大量研究证明酒精性肝损伤与肠道菌群失调紧密相关。酒精引起肠道益生菌减少，致病菌过度生长，进而导致肠道内容物中内毒素增加，加之肠黏膜屏障受损，肠道内细菌、毒素等有害物质随门静脉系统进入肝脏，进而导致肝损伤[33]。通过对酒精性肝病患者的肠道菌群进行宏基因组分析，证实长期摄入酒精会明显降低机体厚壁菌门、乳杆菌属丰度，而革兰阴性菌变形菌门及革兰阳性菌放线菌门等有害菌数量增加[34-35]；肠道菌群失调可通过与宿主免疫系统及其它细胞互作，影响肝性脂肪变性、炎症及纤维化程度[36]。同时，通过调节肠道菌群来改善治疗酒精性肝病得到越来越多学者的认可，Grander[37]表示口服Akk菌可恢复酒精诱导的Akk菌损耗，进而减少肝损伤、脂肪肝和中性粒细胞浸润，防止酒精诱导的肠泄露，增加肠道黏液厚度和紧密连接蛋白的表达；王文成[38]首次阐明了海兔素可通过调节慢性酒精性肝损伤大鼠的肠道菌群达到保肝效果。本研究结果显示：酒精处理会显著降低大鼠肠道菌群多样性，降低厚壁菌门、乳杆菌属丰度，增加变形菌门、普雷沃菌属丰度，三叶青中剂量和阳性药处理均可使其得到恢复，三叶青效果更优；在种水平上，酒精造成约氏乳杆菌丰度显著降低，三叶青中剂量组能有效得到恢复，效果优于阳性药对照组；通过进一步基于16S rRNA测序的菌群基因预测分析，酒精导致大鼠肠道微生物发生很大改变，菌群的潜在功能也被改变，KEGG二级代谢通路显示，通过阳性药和三叶青的干预，肠道菌群的功能可得到一定的恢复，且阳性药对代谢通路的恢复好于三叶青，这也和相关的生理指标表现一致。
目前，临床上仍以戒酒为治疗ALD的主要手段，酒精性肝损伤的早期预防尤为重要，故需要找到能有效预防ALD及延缓肝病发展的药物。本实验观察了三叶青超微粉对大鼠酒精性肝损伤的保护作用。结果表明，三叶青可显著降（P<0.05） 低酒精性肝损伤诱发的血清ALT、AST、ALP水平，可使肝组织中GSH、SOD恢复，MDA含量明显下降，表明三叶青可提高机体的抗氧化能力，抑制自由基和脂质过氧化物的产生；并能有效恢复酒精导致的大鼠肠道菌群丰度降低，提高约氏乳杆菌等有益菌丰度。
本研究初步分析三叶青超微粉对酒精性肝损伤大鼠的保护作用，为三叶青的进一步开发提供了实验依据，但仍有一定的局限性，后期应进一步探讨其作用机制，筛选三叶青有效活性成分，以期为酒精性肝损伤的研究提供借鉴意义。
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图 1 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST和ALP的影响
注：A 血清ALT浓度，B 血清AST浓度，C 血清ALP浓度；数据均以平均值±标准偏差表示；n=8~10，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 1. Effects of SYQ on the activity of ALT, AST and ALP induced by ethanol in rat serum
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图 2 三叶青超微粉对慢性酒精性肝损伤大鼠肝组织GSH、SOD和MDA的影响
注：A 肝组织GSH活性，B 肝组织SOD活性，C 肝组织MDA活性；数据均以平均值±标准偏差表示；n=8~10，*P<0.05，**P<0.01。
Figure 2. Effects of SYQ on GSH, SOD and MDA in liver tissue of rat caused by ethanol
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图 3 各组大鼠肝脏组织病理学表现（HE, 200×）
注：A 正常对照组，B 模型组，C 阳性对照组，D SYQ低剂量组，E SYQ中剂量组，F SYQ高剂量组；图中蓝色剪头所指为脂滴。
Figure 3. Histopathological changes of each group（HE, 200×）
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图 7 基于门（phylum）分类水平的分析
Figure 7. Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level
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图 8 基于属（genus）分类水平的分析
Figure 8. Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level
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图 9 基于种（species）分类水平的分析
Figure 9. Analysis of intestinal microbial flora among groups in species level
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图 12 差异显著的二级代谢途径功能分析热图
Figure 12. Heatmap of functional analysis of significantly different secondary metabolic pathways
表 1 Alpha多样性指数
Table 1 Alpha diversity index
分组 sobs Chao ACE Shannon Simpson coverage 正常对照组 425.25±37.23* 529.60±55.88* 509.57±58.90* 4.75±0.08* 0.02±0.00* 0.98±0.003 模型组 351.50±40.44 450.48±56.42 453.59±55.33 4.01±0.64 0.08±0.05 0.98±0.004 阳性对照组 364.00±31.86 472.89±35.95 474.82±42.31 4.40±0.37 0.05±0.03 0.98±0.007 三叶青中剂量组 364.75±18.77 478.55±45.97 472.17±45.79 4.42±0.11 0.04±0.02 0.98±0.005 注：同列中*表示差异显著P<0.05。 
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