Preparation, Structural Characterization and in Vitro Activity of Chromium Complexes of Sweet Corn Cob Polysaccharide
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摘要: 为提升甜玉米芯多糖生物学活性，制备一种甜玉米芯多糖铬配合物（SCP80-Cr），以单因素实验为基础，以响应面试验优化制备工艺，并进行表征及探究体外活性。结果表明，SCP80-Cr制备最佳工艺条件为pH10.1、反应温度74 ℃、多糖浓度3 mg/mL，反应时间60 min。SCP80-Cr中Cr元素重量百分比为21.08%，元素百分比为6.67%。对SCP80-Cr进行表征发现，SCP80-Cr几乎不含有蛋白、核酸、色素类物质，而Cr是以Cr-O及Cr-OH的形式与SCP80缔合，并具有较强的分子团聚特性。单糖组成测定说明SCP80-Cr单糖组成摩尔百分比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖=0.58:89.50:4.65:1.33:3.58。体外降糖实验结果表明，SCP80-Cr对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50分别为4.70±0.38 mg/mL和3.99±0.26 mg/mL；体外抗氧化实验结果表明，SCP80-Cr清除DPPH自由基及羟基自由基IC50分别为4.80±0.34 mg/mL和4.99±0.28 mg/mL，说明SCP80-Cr相比于SCP80具有更好的体外降糖及抗氧化活性。研究结果为甜玉米芯多糖在功能性食品中的研究提供一定参考价值。
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关键词:
- 甜玉米芯多糖铬配合物 /
- 表征 /
- 体外降糖 /
- 体外抗氧化
Abstract: To enhance the biological activity of sweet corn cob polysaccharide, a sweet corn cob polysaccharide chromium complex (SCP80-Cr) was prepared, characterized and its in vitro activity was also explored. The results showed that the optimal process conditions for the preparation were pH10.1, reaction temperature 74 ℃, polysaccharide concentration of 3 mg/mL, and the reaction time of 60 min. The weight percentage of Cr(III) in SCP80-Cr was 21.08% and the elemental percentage was 6.67%. The characterization revealed that SCP80-Cr contained almost no protein, nucleic acid or pigment, while Cr was conjugated with SCP80 in the form of Cr-O and Cr-OH and had strong molecular agglomeration properties. The molar percentage of the monosaccharide composition of SCP80-Cr was mannose: glucose: galactose: xylose: arabinose = 0.58: 89.50: 4.65: 1.33: 3.58. The results of in vitro hypoglycemia experiments showed that the IC50 of SCP80-Cr on α-amylase and α-glucosidase inhibitions were 4.70±0.38 mg/mL and 3.99±0.26 mg/mL, respectively. Moreover, the results of in vitro antioxidant experiments showed that SCP80-Cr scavenged DPPH radicals and hydroxyl radicals with IC50 of 4.80±0.34 mg/mL and 4.99±0.28 mg/mL, respectively, indicating that SCP80-Cr had better in vitro hypoglycemic and antioxidant activities compared with SCP80. The results of the study provided some references for the study of sweet corn cob polysaccharides in functional foods. -
II型糖尿病是一种以胰岛β细胞功能障碍及胰岛素抵抗为特点，以血糖水平异常升高为症状的代谢疾病，研究发现，机体异常的氧化应激、体内肠道糖酶活性降低均可能引起II型糖尿病的产生。而传统降糖药物存在一定的药物副作用，所以，寻找天然产物用于缓解II型糖尿病成为目前的研究热点之一。多糖，是一种由一个糖苷键连接10个或10个以上单糖的大分子聚合物[1-2]，大多聚集在植物和微生物等天然产物中，许多学者进行了多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究，结果均表明，多糖可以抑制两种酶的酶活性[3-4]。三价铬离子不仅是人体必须的微量金属元素之一，也是葡萄糖耐量因子的重要组成部分。研究发现，人体血中的铬含量与胰岛素含量密切关联，可以通过增加降糖物质受体的数目和抑制机体糖异生过程来降低血糖，因此，适量补充三价铬离子可以缓解由糖尿病引起的相关症状。也有研究表明，铬补充剂可显著增加抗氧化酶的活性，进而改善机体血糖异常。同时，研究发现铬也可以通过恢复糖尿病患者胰腺功能进而调节机体糖代谢[5]。相较于无机铬而言，有机铬复合后更易于人体的消化吸收[6]。
甜玉米芯是甜玉米除去米粒与米须的部分得到的穗轴，是一种十分常见的农副产品，其重量一般在甜玉米穗重量的20%～30%之间，大多数甜玉米芯在玉米采收后被丢弃，产生了一定的资源浪费。前期研究发现，甜玉米芯多糖具有一定的降糖活性，但其降糖活性有待于进一步提升。而对于甜玉米芯与铬复合形成有机配合物的研究目前研究较少[7-8]。本研究采用三价铬离子修饰甜玉米芯多糖形成甜玉米芯多糖铬配合物，并对其结构进行表征，同时探究其体外降糖以及抗氧化活性，为甜玉米芯多糖深度利用及糖尿病功能食品产业提供具有价值的理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
甜玉米芯多糖（SCP80）（纯度95.27%±1.48%） 实验室自制；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、α-淀粉酶（50 U/mg）、阿卡波糖、硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷（pNPG）、谷胱甘肽 上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海力辰邦西仪器科技有限公司；FA1104B电子天平 上海越平科学仪器有限公司；UV-5200紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；TG16-WS台式离心机 湖南湘仪仪器有限公司；Lambda365紫外光谱仪 美国PerkinElmer公司；Spectrum Two傅里叶变换红外光谱仪 美国PerkinElmer公司；Alpha 2-4冻干机 德国Christ 公司；EDAX TEAM™能谱仪（SEM） 美国伊达克斯有限公司；250Xi X射线光电子能谱仪 美国赛默飞公司；Agilent 1100高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；STA 6000热重分析仪 德国珀金埃尔默仪器有限公司；Dimension Icon原子力显微镜 德国布鲁克公司。
1.2 实验方法
1.2.1 SCP80-Cr的制备
以甜玉米芯为原料，以水提醇沉方法，经脱脂、水提、浓缩、脱蛋白、脱色、醇沉、真空冷冻干燥等操作后，得到甜玉米芯多糖（SCP80）[9-10]。将甜玉米芯多糖配制成一定浓度的溶液，将配制好的CrCl3溶液（2 mol/L）缓慢滴加到多糖溶液中，同时通过HCl溶液（0.5 mol/L）和NaOH溶液（0.5 mol/L）控制反应pH，边滴加边搅拌均匀，当溶液中出现绿色棉絮状物质时停止滴加CrCl3，随后将混合溶液置于一定温度下继续反应。反应结束后，将溶液置于室温下冷却，然后以4000 r/min离心10 min，收集上清液并流水透析除去未反应的金属离子，之后加入无水乙醇使乙醇终体积为95%在4 ℃条件下醇沉过夜。次日以4000 r/min离心10 min，收集沉淀物并冻干，得到甜玉米芯铬配合物（SCP80-Cr）[7]。
1.2.2 铁离子还原力的测定
为判定各因素对甜玉米芯铬配合物体外抗氧化活性的影响，以配合物铁离子还原力为测定指标进行实验。实验步骤如下：分别吸取2 mL的SCP80-Cr（4 mg/mL）溶液、PBS缓冲溶液（pH6.6）和铁氰化钾溶液（1.0×10−2 g/mL）于试管中，反应温度设置为50 ℃，反应时间设置为20 min。反应后冷却至室温，再加入2.5 mL三氯乙酸溶液（0.1 g/mL），避光反应10 min后，取2.5 mL上层清液，并向其加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL三氯化铁溶液（0.1%），再次避光反应10 min后，在波长700 nm处测定其吸光度，SCP80-Cr还原力大小以所测得的吸光度大小表示[11-12]。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 反应pH对铁离子还原力的影响
调整反应pH分别为8、9、10、11、12，固定多糖浓度4 mg/mL，反应温度70 ℃，反应时间60 min，比较pH对铁离子还原力的影响。
1.2.3.2 反应温度对铁离子还原力的影响
调整反应温度分别为60、65、70、75、80 ℃，固定多糖浓度4 mg/mL，反应pH9，反应时间60 min，比较反应温度对铁离子还原力的影响。
1.2.3.3 多糖浓度对铁离子还原力的影响
配制浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL甜玉米芯多糖溶液，固定反应pH9，反应温度70 ℃，反应时间60 min，比较多糖浓度对铁离子还原力的影响。
1.2.4 反应时间对铁离子还原力的影响
调整反应时间为30、45、60、75、90 min，固定多糖浓度4 mg/mL，反应pH9，反应温度70 ℃，比较反应时间对铁离子还原力的影响。
1.2.5 星点设计-响应面优化试验
根据单因素实验结果，选取pH（A）、温度（B）和甜玉米芯多糖浓度（C）为自变量，以铁离子还原力（Y）为因变量，采取星点设计-响应面法优化设计试验，因素及水平编码如表1所示。
表 1 星点设计因素与水平Table 1. Factors and levels used for the central composite design水平 因素 A pH B温度（℃） C多糖浓度（mg/mL） −1.682 9.00 70.00 2.00 −1 9.41 72.03 2.41 0 10.00 75.00 3.00 1 10.59 77.97 3.59 1.682 11.00 80.00 4.00 1.2.6 SCP80-Cr的表征
1.2.6.1 微观形貌及铬含量测定
取少量SCP80-Cr样品并将样品固定于贴有双面导电胶的铝制样品板上，采用扫描电镜及X射线能谱分析（Energy Dispersive Spectrometer，EDS）对SCP80-Cr微观形貌及元素含量进行分析。
1.2.6.2 紫外光谱分析
将SCP80-Cr配制成1 mg/mL的溶液，采用紫外-可见分光光度计在波长200~800 nm范围内进行扫描。并与相同浓度SCP80进行对比。
1.2.6.3 红外光谱分析
称取20 mg SCP80-Cr并与200 mg溴化钾粉末充分混合，压片处理，使用傅立叶变换红外光谱仪在波数4000~500 cm−1范围内进行SCP80-Cr的红外光谱分析。
1.2.6.4 X射线光电子能谱（XPS）分析
X射线光电子能谱（XPS）分析采用Al K alph辐射源和400 μm光斑，在测试能量hν=1486.8 eV条件下测定，测试光斑面积为400 μm，测试管电压15 kV，管电流10 mA，上样量为10 mg，对SCP80-Cr进行测试，并对结合能进行校正，并进行峰拟合及分峰处理，以判定SCP80-Cr中Cr的结合形式。
1.2.6.5 热稳定性分析
将5 mg的SCP80-Cr样品放置于热重分析仪样品池内，设定测定温度范围为30~600 ℃，升温速度为10 ℃/min，得到SCP80-Cr的TG及DTG曲线，并与SCP80进行对比。
1.2.6.6 分子形貌分析
通过原子力显微镜（AFM）观察SCP80-Cr分子形貌，取5 µg/mL样品5 µL滴在云母片上，室温下干燥后以空气智能成像模式扫描（ScanAsyst Mode），并采用Bruker的锐化氮化硅探针（SNL-10）测试，弹性常数0.35 N/m，分辨率为256×256，扫描速率均小于1 Hz。
1.2.6.7 单糖组成分析
称取10 mg多糖样品于20 mL钳口瓶中，加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃条件下水解2 h，取1 mL溶液并重复3次加入1 mL甲醇后用N2挥干，以去除残余三氟乙酸，加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解残渣，得到多糖水解液，取0.4 mL多糖水解液并加0.4 mL PMP甲醇溶液，混匀后70 ℃反应2 h，冷却至室温后加0.4 mL 0.3 mol/L的HCl中和，加入双蒸水并以氯仿萃取2次，将水相过0.45 μm滤膜后HPLC进样分析。
色谱条件：色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH6.7）；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱方式进行（表2）；检测波长：250 nm；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量5 μL。
表 2 液相梯度洗脱条件Table 2. HPLC gradient elution conditions时间（min） 流动相（%） A B 0 86 14 9 83 17 28 78 22 29 50 50 31 50 50 1.2.7 SCP80-Cr体外降糖活性的测定
1.2.7.1 SCP80-Cr对α-淀粉酶的抑制作用
将SCP80-Cr配制成浓度分别为 0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/mL的溶液，加入0.3 mL α-淀粉酶溶液（2 U/mL），放置于37 ℃的水浴锅中预热，同时将淀粉溶液（1%）在同等温度下预热，5 min后加入0.3 mL淀粉溶液，继续在此温度下水浴5 min后，向其中加入0.5 mL的3, 5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5 min后冷却，加入蒸馏水至溶液为5 mL，在波长540 nm下测定吸光值（A3）。以蒸馏水替代SCP80-Cr，其余操作相同，测定吸光值（A1），以蒸馏水替代α-淀粉酶及SCP80-Cr，其余操作相同，测定吸光值（A2）；以蒸馏水替代α-淀粉酶，其余操作相同，测定吸光值（A4）。阳性对照组以阿卡波糖代替SCP80-Cr溶液，抑制率计算公式见式（1）[13]。
α-淀粉酶抑制率(%)=(1−A3−A4A1−A2)×100 (1) 1.2.7.2 SCP80-Cr对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
将SCP80-Cr配制成浓度分别为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/mL的溶液，分别取1 mL并加入0.1 mL的α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）和2 mL的PBS缓冲溶液（pH6.8），37 ℃条件下反应10 min，然后加入0.1 mL的谷胱甘肽溶液（3 mmol/L）和0.25 mL的对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷（10 mmol/L），在同等温度下水浴10 min，最后加入2 mL的碳酸钠溶液（0.1 mol/L），此时反应终止，在波长400 nm处测定其吸光度（A）。以PBS缓冲溶液替代SCP80-Cr溶液测定吸光值（A0）；以PBS缓冲溶液替代α-葡萄糖苷酶测定吸光度（A1）；以PBS缓冲溶液替代α-葡萄糖苷酶溶液和SCP80-Cr溶液测定吸光度（A2）。阳性对照组以阿卡波糖代替SCP80-Cr溶液，抑制率计算公式见式（2）[14]。
α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=(1−A−A1A0−A2)×100 (2) 1.2.8 SCP80-Cr体外抗氧化活性的测定
1.2.8.1 DPPH自由基清除率的测定
对SCP80-Cr抑制DPPH自由基实验进行测定，分别加入浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/mL的SCP80-Cr溶液2 mL，与DPPH-乙醇溶液（2×10−4 mol/L，2 mL）充分混匀后，在室温且避光条件下反应30 min后在517 nm处测定吸光值（A1），用2 mL无水乙醇替代SCP80-Cr吸光值记为（A0），用2 mL无水乙醇替代DPPH-乙醇溶液吸光值记为（A2），阳性对照组以等浓度的抗坏血酸溶液代替SCP80-Cr溶液，DPPH自由基清除率计算公式见式（3）[15]。
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (3) 1.2.8.2 羟基自由基清除率的测定
将SCP80-Cr配制成浓度分别为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mg/mL的溶液，分别取2 mL并添加2 mL的硫酸亚铁溶液（6 mmol/L）、水杨酸-乙醇溶液（6 mmol/L）和过氧化氢溶液（30%），在37 ℃的条件下避光反应30 min，在波长510 nm处记录吸光值（A1）。以蒸馏水代替水杨酸-乙醇，其余操作相同，记录吸光值（A2）；以蒸馏水替代SCP80-Cr，其余操作相同，记录吸光值（A3）。阳性对照组以等浓度的抗坏血酸溶液代替SCP80-Cr溶液，羟基自由基清除率计算公式见式（4）[16]。
羟基自由基清除率(%)=(1−A1−A2A3)×100 (4) 1.3 数据处理
采用SPSS 22.0、Origin 2018 等软件对数据进行处理并作图，实验平行进行三次，结果以均数±标准差表示。组间显著性差异以Tukey检验分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果与分析
2.1.1 反应pH对SCP80-Cr铁离子还原力的影响
pH对SCP80-Cr铁离子还原力的影响如图1（A）所示，当pH为8～10时，铁离子还原能力随着pH的增大而增强；当pH在10～12之间时，铁离子还原力随着pH的增大而减弱。随着pH逐渐增加，铬元素与多糖的络合能力增强，引起多糖铬配合物生物活性增强，铁离子还原力增强。而当pH继续增加，铁离子还原力呈现下降趋势，Li等[17]在制备灵芝多糖-铬复合物时同样发现随着pH增加，铬螯合率呈现先增加后减少的趋势，这可能是由于在强碱性环境下，导致一部分铬离子的溶解度下降，更倾向于形成沉淀，配合物的铁离子还原力降低，因此选择pH为9～11进行后续响应面优化试验。
2.1.2 反应温度对SCP80-Cr铁离子还原力的影响
反应温度对SCP80-Cr铁离子还原力的影响如图1（B）所示，当温度为60～75 ℃时，铁离子还原力随着温度的升高而逐渐增强，当温度达到75 ℃时，铁离子还原力最强，但当温度在75～80 ℃之间时，铁离子还原力随着温度的升高而减弱，这可能是因为随着温度增加，体系中铬元素与多糖的间分子之间的碰撞几率增加，复合物铁离子还原力增强；而温度过高会导致多糖分子和三价铬离子的运动加快，使二者的结合速度低于解离速度，生成的配合物铁离子还原力降低[18]。因此选择反应温度为70～80 ℃进行响应面优化试验。
2.1.3 多糖浓度对SCP80-Cr铁离子还原力的影响
多糖浓度对SCP80-Cr铁离子还原力的影响如图1（C）所示，当多糖浓度在1～3 mg/mL之间时，铁离子还原力随着多糖浓度的增大而增强；当多糖浓度在3～5 mg/mL之间时，铁离子还原力随着多糖浓度的增大而减弱，这与Guo等[19]在研究灰树花多糖铬复合物的制备中发现随着CrCl3的添加量增加，铬络合程度呈先增加后减少的趋势结果相似。当多糖浓度逐渐增加，铬元素可以与足够充足的多糖分子结合，复合物的铁离子还原力呈上升趋势，当多糖浓度大于3 mg/mL时，由于铬元素与多糖已经充分结合，多糖的继续增加相应减少与多糖有效结合的多糖铬复合物的占比，从而引起铁离子还原力减弱，因此选择多糖浓度为2～4 mg/mL进行响应面优化试验。
2.1.4 反应时间对SCP80-Cr铁离子还原力的影响
反应时间对SCP80-Cr铁离子还原力的影响如图1（D）所示，铁离子还原力随着反应时间的增加变化不大，呈平缓趋势。这与张雯等[20]在制备南瓜皮多糖铬配合物的研究中所得到时间对铬螯合率影响并不显著的观点一致。因此，不将反应时间作为响应面选取因素，选择60 min进行后续实验。
2.2 星点设计-响应面法试验结果与分析
根据单因素实验结果，选取pH（A）、反应温度（B）、多糖浓度（C）三个因素进行优化试验，结果见表3，对表3中数据进行拟合分析，得回归方程：Y=−55.33+5.20A+0.800B−0.090C+0.013AB+0.163AC−2.69×10−3BC−0.331A2−6.26×10−3B2−0.222C2。
表 3 星点设计-响应面法试验设计及结果Table 3. Experimental design and results of central design response surface method (CCD)试验号 因素 Y 铁离子还原力（A） A pH B 温度 C 多糖浓度 1 0 0 −1.682 0.301 2 −1 −1 1 0.173 3 1 −1 −1 0.189 4 −1 −1 −1 0.306 5 1 −1 1 0.404 6 0 −1.682 0 0.417 7 0 0 0 0.539 8 0 1 1 0.310 9 0 0 0 0.513 10 0 1.682 0 0.291 11 0 0 1.682 0.276 12 0 0 0 0.396 13 0 0 0 0.491 14 −1 1 −1 0.136 15 1.682 0 0 0.252 16 −1.682 0 0 0.107 17 0 0 0 0.497 18 −1 1 1 0.101 19 1 1 −1 0.231 20 0 0 0 0.521 方差分析结果如表4所示，通过分析可知，A、AC、A2、B2、C2项对铁离子还原力影响极显著（P<0.01），B项对铁离子还原力影响显著（P<0.05），模型对铁离子还原力影响极显著（P<0.01），失拟项为0.5365，对实验结果影响不显著（P>0.05），结果表明，所建立的模型能较好地拟合试验数据，R2值为0.9375，从而验证了所建立的模型能够很好地拟合试验参数和响应值的关系。
表 4 回归方程的方差分析结果Table 4. Analysis of variance of regression model差异来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性 模型 0.37 9 0.041 16.65 <0.0001 ** A 0.032 1 0.032 13.14 0.0046 ** B 0.019 1 0.019 7.68 0.0198 * C 5.161×10−4 1 5.161×10−3 0.21 0.6555 AB 4.513×10−3 1 4.513×10−3 1.85 0.2038 AC 0.027 1 0.027 10.93 0.0079 ** BC 1.805×10−4 1 1.805×10−4 0.074 0.7912 A2 0.20 1 0.20 80.83 <0.0001 ** B2 0.044 1 0.044 18.06 0.0017 ** C2 0.089 1 0.089 36.35 0.0001 ** 残差 0.024 10 2.441×10−3 失拟项 0.012 5 2.336×10−3 0.92 0.5365 不显著 纯误差 0.013 5 2.546×10−3 总和 0.39 19 注：*代表影响显著（P<0.05）；**代表影响极显著（P<0.01）。 响应面图可更直观考察pH、反应温度、多糖浓度两两交互作用对铁离子还原力的影响，如图2所示，当pH、反应温度、多糖浓度任意两因素交互时，随着因素水平的增加，铁离子还原力均呈现先增加后减少的趋势。特别是pH与多糖浓度交互时，等高线图呈现明显的椭圆形，同时曲面陡峭。这说明pH与多糖浓度交互作用对铁离子还原力的影响最为显著[21-23]。
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图 2 两因素交互作用对铁离子还原力影响的等高线与曲面图Figure 2. Contour and surface diagram of the influence of the interaction of two factors on the reduction force of iron ions2.3 验证实验及多糖含量测定
根据Design-Expert软件分析结果，SCP80-Cr制备的最佳工艺条件是pH为10.12、反应温度74.12 ℃、多糖浓度3.07 mg/mL，此时铁离子还原力预测值为0.505。结合实际操作情况，将条件做出适当调整：pH10.1、反应温度74 ℃、多糖浓度3 mg/mL，在反应时间60 min条件下进行3次平行实验，此时SCP80-Cr铁离子还原力测定值为0.571±0.028，与响应面预测值接近，说明该模型可靠。此时SCP80-Cr中多糖含量为69.08%±0.25%，采用此方法制备SCP80-Cr进行后续实验。
2.4 SCP80-Cr表征分析
2.4.1 微观形貌及铬含量测定
SCP80及SCP80-Cr微观形貌如图3（A~F）所示，通过不同倍数观察SCP80与SCP80-Cr形貌结构，结果表明SCP80-Cr为圆盘状或球状颗粒，同时通过化学作用及化学键等作用相互缠绕形成链状或棒状聚合物，相比于SCP80，SCP80-Cr颗粒间连接更为致密，孔隙更小，这可能由于Cr与多糖化学键产生作用力相结合，插入到多糖间的孔隙中。图3（G）显示了经X射线能谱分析（Energy Dispersive Spectrometer，EDS）扫描后各元素的占比，结果表明SCP80-Cr中Cr元素重量百分比为21.08%，元素百分比为6.67%。图3（H）体现了SCP80-Cr经元素扫描得到的图像。结果表明，通过对SCP80-Cr铬元素特征扫描，Cr在SCP80-Cr中分布均匀也同样确认了复合物中铬元素的存在。此结果说明了铬元素已经成功连接在多糖结构上，而具体与多糖结合方式仍需进一步通过红外及XPS分析。
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图 3 扫描电镜图像及EDS元素映射图像注：A~C：SCP80 SEM图像（A：×10 k，B：×20 k，C：×40 k）；D~F：SCP80-Cr SEM图像（A：×10 k，B：×20 k，C：×40 k）；G：SCP80-Cr EDS图像；H：SCP80-Cr 元素mapping分布图像。Figure 3. SEM image and corresponding EDS elemental mapping image2.4.2 紫外及红外光谱分析
如图4（A）所示，SCP80和SCP80-Cr在260、280、380 nm处均无吸收峰，表明不含核酸、蛋白质及肽类、色素等物质[24]。如图4（B）所示，SCP80-Cr的红外吸收峰与SCP80相比，在4000~500 cm−1之间特征峰的变化并不明显，同时峰强度明显减弱，这可能是因为Cr3+与羟基中的氧原子以配位键相结合，从而降低了-OH形成分子之间和分子内部氢键的能力[19]。SCP80-Cr在3302 cm−1处峰由-OH的伸缩振动引起，其峰宽SCP80-Cr与SCP80相比增加，而峰强减弱。其峰位由3319 cm−1红移到3302 cm−1，这可能说明SCP80-Cr分子间氢键结合力减小；在2926 cm−1出现的峰可能由γ（C-H）伸缩振动产生，在1631 cm−1附近出现峰是由C=O或者羧基中羟基引起，而在引入Cr后，峰位发生移动（由1627 cm−1移动到1631 cm−1），这可能是Cr3+与C=O发生配位反应。同时在1026 cm−1及857 cm−1处存在的β-构型吡喃环特征峰二者类似，说明Cr3+不会对多糖基本结构造成明显影响。SCP80-Cr在1130 cm−1处出现峰，进一步说明了Cr-OH的存在；于526 cm−1处出现明显峰，可能是由于Cr-O键引起的[24]。这些结果说明Cr的引入在结构上对SCP80多糖产生影响，并引起部分峰位移动或形成一些特征峰，此结果与全志刚等[25]研究的水溶性膳食纤维铬配合物存在相似之处，为进一步探究Cr在SCP80多糖中结构的影响以及形成化学键的判定，对其进行XPS分析。
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图 4 SCP80-Cr紫外（A）及红外（B）光谱Figure 4. Ultraviolet spectrum (A) and Infrared spectrum (B) of SCP80-Cr2.4.3 XPS分析
SCP80与SCP80-Cr的X射线光电子能谱图如图5所示，对SCP80-Cr进行分析，结果表明，SCP80-Cr中含有C、O及Cr元素（图5 D）。为进一步探究各元素在配合物中存在形式以及铬元素是否对多糖结构产生影响，对SCP80-Cr的C 1s、O 1s及Cr 2p谱图进一步分析，在C 1s谱图中（图5 E）出现了C-C峰（284.8 eV），C-H峰（283.4 eV）以及O-C=O峰（287.2 eV），在O 1s谱图中（图5 F）在532.9 eV处出现较强的C-O峰，以上结果说明Cr对SCP80多糖基本结构几乎不会产生较大影响。图5（G）为Cr 2p谱图，Cr元素在O 1s及Cr 2p谱图中均有特征峰的出现，其中Cr-OH在O 1s元素谱图（529.5 eV），Cr 2p谱图（573.4 eV）均出现明显峰，这与红外图谱在1130 cm−1处出现峰得到结论一致；Cr-O在O 1s元素谱图（528.0 eV），Cr 2p元素谱图（574.7 eV）均出现峰，这与红外图谱在526 cm−1处出现峰得到结果一致，同时Cr 2p元素谱图中三价铬在584.6 eV处的明显峰，这些结果说明铬以Cr-OH及Cr-O配位的形式与SCP80结合，形成多糖-铬三价配合物[26]。
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图 5 SCP80-Cr X射线光电子能谱图注：A~C：SCP80 X射线光电子能谱（A：全谱图；B：C 1s；C：O 1s）；D~G：SCP80-Cr X射线光电子能谱（D：全谱图；E：C 1s；F：O 1s；G：Cr 2p）。Figure 5. XPS of SCP80-Cr2.4.4 热稳定性分析
SCP80-Cr的TG及DTG曲线分别如图6（A）与图6（B）所示，SCP80与SCP80-Cr热稳定性曲线存在一定的差异性，进一步说明Cr的引入导致了SCP80结构的变化，进而引起了热稳定性的差异。SCP80-Cr的热失重曲线主要分为三个阶段，第一阶段为30~134.70 ℃，此阶段主要是自由水及结合水的失去，损失量为10.04%，失重速率峰值温度为69.08 ℃，相比于SCP80，SCP80-Cr第一阶段热失重率增加，失重峰值温度前移；第二阶段为134.70~389.28 ℃，此阶段主要是SCP80-Cr中碳长链的断裂，此阶段热失重率为61.42%，相比于SCP80，热失重率同样增加，这可能是与SCP80-Cr中Cr-OH及Cr-O的形成有关，而此阶段也是SCP80-Cr热损失速率最快的阶段；第三阶段为389.28~600 ℃，此阶段热失重率为8.00%，在600 ℃后，SCP80-Cr残留质量分数为20.54%，可以看出SCP80-Cr的热稳定性比SCP80弱，这与刘思美等[27]制备的地黄硒多糖热稳定性结果类似，这说明Cr对SCP80结构的影响会使其热稳定性降低。
2.4.5 分子形貌分析
SCP80-Cr的原子力显微镜图像如图7所示，SCP80-Cr呈山峰状结构，其直径主要集中于40~90 nm之间，其高度范围主要集中于0.6~1.2 nm之间，而通过图7观察到其山峰状结构宽度存在一定差异，这可能是由于多糖糖分子链相互聚集缠绕引起的。这与汤陈鹏等[28]制备的一种孔石莼多糖锌结果存在一定的相似性，说明SCP80-Cr具有较强的团聚性能。
2.4.6 单糖组成分析
由图8可知，SCP80-Cr主要由葡萄糖组成，同时含有少量甘露糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖，其摩尔百分比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖=0.58:89.50:4.65:1.33:3.58。相比于SCP80，单糖组成未发生明显变化[10]。
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图 8 SCP80-Cr单糖组成分析注：A：14种单糖标准品液相色谱曲线；B：SCP80-Cr单糖组成液相色谱曲线。其中1：L-古洛糖醛酸；2：D-甘露糖醛酸；3：D-甘露糖；4：D-核糖；5：L-鼠李糖；6：D-氨基葡萄糖；7：D-葡萄糖醛酸；8：D-半乳糖醛酸；9：D-葡萄糖；10：D-氨基半乳糖；11：D-半乳糖；12：D-木糖；13：L-阿拉伯糖；14：L-岩藻糖。Figure 8. Monosaccharide composition of SCP80-Cr2.5 SCP80-Cr体外活性测定
2.5.1 SCP80-Cr体外降糖活性测定
当SCP80-Cr浓度在0.125～8 mg/mL之间时，α-淀粉酶（图9 A）及α-葡萄糖苷酶（图9 B）抑制率随SCP80-Cr浓度的增加而升高。当浓度为8 mg/mL时，SCP80-Cr对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制率分别为71.28%±1.08%、79.99%±2.07%，其IC50分别为4.70±0.38、3.99±0.26 mg/mL。SCP80对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制率分别为51.02%±2.07%、50.09%±1.23%，其IC50分别为7.04±0.35、7.26±0.41 mg/mL。结果说明，SCP80-Cr对两种酶的抑制率显著高于SCP80（P<0.05），且SCP80-Cr对两种酶抑制率更接近阳性对照组阿卡波糖。Wang等[29]的研究同样说明，相比于桦褐孔菌多糖，桦褐孔菌多糖-铬复合物对α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶具有更好的抑制作用，说明SCP80-Cr具有更好的体外降糖活性。
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图 9 SCP80-Cr体外活性分析注：A：α-淀粉酶抑制率；B：α-葡萄糖苷酶抑制率；C：DPPH自由基清除率；D：羟基自由基清除率。Figure 9. Analysis of the in vitro activity of SCP80-Cr2.5.2 SCP80-Cr体外抗氧化活性测定
当浓度在0.125～8 mg/mL之间时，DPPH自由基（图9 C）及羟基自由基（图9 D）清除率随SCP80-Cr浓度的增加而升高。当浓度为8 mg/mL时，SCP80-Cr对DPPH自由基及羟基自由基抑制率分别为71.04%±1.09%、69.09%±2.29%，其IC50分别为4.80±0.34、4.99±0.28 mg/mL。SCP80对DPPH自由基及羟基自由基清除率分别为53.02%±0.42%、54.09%±1.26%，其IC50分别为6.94±0.23，6.85±0.39 mg/mL。结果说明，SCP80-Cr对两种自由基清除率显著高于SCP80（P<0.05），且SCP80-Cr对两种自由基清除能力更接近阳性对照组抗坏血酸。Zhang等[30]以金属元素与多糖结合形成配合物，同样得到了多糖-金属配合物清除自由基的能力相比于原多糖上升，这可能与多糖与金属离子配位后，清除自由基活性位点增加有关，说明SCP80-Cr具有更好的体外抗氧化活性。
3. 结论
实验将甜玉米芯多糖与三价铬离子复合，成功制备了甜玉米芯多糖铬配合物（SCP80-Cr），以单因素实验为基础，以响应面试验优化制备工艺，并进行表征与探究体外活性。结果表明，SCP80-Cr制备最佳工艺条件为pH10.1、反应温度74 ℃、多糖浓度3 mg/mL，反应时间为60 min。此时SCP80-Cr铁离子还原力测定值为0.571±0.028。对其进行结构表征，SCP80-Cr为微观结构为圆盘状无定型结构，其Cr元素重量百分比为21.08%，元素百分比为6.67%，同时说明Cr是以Cr-O及Cr-OH的形式存在与SCP80-Cr中，并具有较强的分子团聚特性。单糖组成测定说明了SCP80-Cr主要由葡萄糖组成，同时含有少量甘露糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖，其摩尔百分比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖=0.58:89.50:4.65:1.33:3.58。体外活性实验说明SCP80-Cr相比于SCP80具有更好的体外降糖及抗氧化活性。此结果为降糖功能食品提供一种新思路。
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图 2 两因素交互作用对铁离子还原力影响的等高线与曲面图
Figure 2. Contour and surface diagram of the influence of the interaction of two factors on the reduction force of iron ions
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图 3 扫描电镜图像及EDS元素映射图像
注：A~C：SCP80 SEM图像（A：×10 k，B：×20 k，C：×40 k）；D~F：SCP80-Cr SEM图像（A：×10 k，B：×20 k，C：×40 k）；G：SCP80-Cr EDS图像；H：SCP80-Cr 元素mapping分布图像。
Figure 3. SEM image and corresponding EDS elemental mapping image
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图 4 SCP80-Cr紫外（A）及红外（B）光谱
Figure 4. Ultraviolet spectrum (A) and Infrared spectrum (B) of SCP80-Cr
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图 5 SCP80-Cr X射线光电子能谱图
注：A~C：SCP80 X射线光电子能谱（A：全谱图；B：C 1s；C：O 1s）；D~G：SCP80-Cr X射线光电子能谱（D：全谱图；E：C 1s；F：O 1s；G：Cr 2p）。
Figure 5. XPS of SCP80-Cr
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图 8 SCP80-Cr单糖组成分析
注：A：14种单糖标准品液相色谱曲线；B：SCP80-Cr单糖组成液相色谱曲线。其中1：L-古洛糖醛酸；2：D-甘露糖醛酸；3：D-甘露糖；4：D-核糖；5：L-鼠李糖；6：D-氨基葡萄糖；7：D-葡萄糖醛酸；8：D-半乳糖醛酸；9：D-葡萄糖；10：D-氨基半乳糖；11：D-半乳糖；12：D-木糖；13：L-阿拉伯糖；14：L-岩藻糖。
Figure 8. Monosaccharide composition of SCP80-Cr
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图 9 SCP80-Cr体外活性分析
注：A：α-淀粉酶抑制率；B：α-葡萄糖苷酶抑制率；C：DPPH自由基清除率；D：羟基自由基清除率。
Figure 9. Analysis of the in vitro activity of SCP80-Cr
表 1 星点设计因素与水平
Table 1 Factors and levels used for the central composite design
水平 因素 A pH B温度（℃） C多糖浓度（mg/mL） −1.682 9.00 70.00 2.00 −1 9.41 72.03 2.41 0 10.00 75.00 3.00 1 10.59 77.97 3.59 1.682 11.00 80.00 4.00 
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表 2 液相梯度洗脱条件
Table 2 HPLC gradient elution conditions
时间（min） 流动相（%） A B 0 86 14 9 83 17 28 78 22 29 50 50 31 50 50
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表 3 星点设计-响应面法试验设计及结果
Table 3 Experimental design and results of central design response surface method (CCD)
试验号 因素 Y 铁离子还原力（A） A pH B 温度 C 多糖浓度 1 0 0 −1.682 0.301 2 −1 −1 1 0.173 3 1 −1 −1 0.189 4 −1 −1 −1 0.306 5 1 −1 1 0.404 6 0 −1.682 0 0.417 7 0 0 0 0.539 8 0 1 1 0.310 9 0 0 0 0.513 10 0 1.682 0 0.291 11 0 0 1.682 0.276 12 0 0 0 0.396 13 0 0 0 0.491 14 −1 1 −1 0.136 15 1.682 0 0 0.252 16 −1.682 0 0 0.107 17 0 0 0 0.497 18 −1 1 1 0.101 19 1 1 −1 0.231 20 0 0 0 0.521
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表 4 回归方程的方差分析结果
Table 4 Analysis of variance of regression model
差异来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性 模型 0.37 9 0.041 16.65 <0.0001 ** A 0.032 1 0.032 13.14 0.0046 ** B 0.019 1 0.019 7.68 0.0198 * C 5.161×10−4 1 5.161×10−3 0.21 0.6555 AB 4.513×10−3 1 4.513×10−3 1.85 0.2038 AC 0.027 1 0.027 10.93 0.0079 ** BC 1.805×10−4 1 1.805×10−4 0.074 0.7912 A2 0.20 1 0.20 80.83 <0.0001 ** B2 0.044 1 0.044 18.06 0.0017 ** C2 0.089 1 0.089 36.35 0.0001 ** 残差 0.024 10 2.441×10−3 失拟项 0.012 5 2.336×10−3 0.92 0.5365 不显著 纯误差 0.013 5 2.546×10−3 总和 0.39 19 注：*代表影响显著（P<0.05）；**代表影响极显著（P<0.01）。
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