Effect of Nitrogen Source on Freeze-dried Resistance of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B61-3
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摘要: 本研究针对德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3，分别测定了其对16种氮源的利用情况，筛选出能够提高菌株冻干耐受的氮源种类及添加量，并进一步测定该氮源对菌株冻干粉发酵活力、菌体形态、发酵关键酶活力的影响。结果表明：氮源为30 g/L牛骨蛋白胨时可提高菌株冻干存活率及冻干粉发酵活力，冻干存活率由9.68%提高到18.90%，冻干粉平均发酵活力较对照组提高22.15%；电子显微镜显示，牛骨蛋白胨培养后菌体大小及形态有所改变，对照组发酵菌体表现出不规则、卷曲的形态且菌体较长，而牛骨蛋白胨为氮源时菌体形态呈表面光滑的短杆状，菌体长径比（l/d）和面积体积比（S/V）显著降低（P<0.05），可能与菌株更高的存活率和发酵活力有关。发酵关键酶活力测定结果表明，冷冻干燥显著降低菌株酶活力（P<0.05），牛骨蛋白胨培养菌株冻干后胞内酶活力均显著高于对照组（P<0.05），乳酸脱氢酶、Na＋K＋-ATP酶及β-半乳糖苷酶分别较对照组提高1.30、1.52及2.75倍，且胞外β-半乳糖苷酶活性低于对照组。结果证实，牛骨蛋白胨培养B61-3菌体能够抵抗冷冻干燥过程对菌体细胞膜造成的损伤，减少酶外泄，从而提高冻干存活率和发酵活力。
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关键词:
- 德氏乳杆菌保加利亚亚种 /
- 氮源 /
- 冷冻干燥 /
- 发酵活力 /
- 菌体形态
Abstract: In this study, the utilization of 16 nitrogen sources of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B61-3 were determined, and the types and amounts of nitrogen sources that can improve the freeze-drying tolerance of the strain were screened out. More importantly, the effects of nitrogen source modification on the fermentation performance, cell morphology and enzyme activities of freeze-dried powder of the strain were investigated. The results showed that 30 g/L of bovine bone peptone improved the freeze-drying survival rate from 9.68% to 18.90%, and increased fermentation activity by 22.15% compared with the control group. Changed cell size and morphology of the cultured cells of bovine bone peptone were also observed by electron microscope. Cell cultured in bovine bone peptone medium represented a short rod with smooth surface, and the ratio of length to diameter or area to volume decreased significantly (P<0.05). However, cells in the control group showed irregular, curly shape and longer cells. Freeze-drying significantly reduced the enzyme activity of the strain (P<0.05). Compared with control group, the intracellular activities of these enzymes in the cells cultured in bovine bone peptone significantly increased after freeze-drying (P<0.05), and the activities of lactate dehydrogenase, β-galactosidase and Na+K+-ATPase increased by 1.30 times, 1.52 times and 2.75 times respectively, while the extracellular activities of β-galactosidase decreased. Meanwhile, the results showed that B61-3 cells cultured with bovine bone peptone could resist the damage of cell membrane caused by freeze-drying process, reduce the leakage of enzymes, thus improving the freeze-drying survival rate and fermentation activity. -
乳酸菌是一种可以发酵碳水化合物以产生乳酸的微生物，广泛应用于发酵食品工业中，通常作为乳制品、发酵蔬菜、发酵肉类的发酵剂[1-2]，也常被广泛用作益生菌，发挥改善宿主健康的效应[3-4]。真空冷冻干燥技术是工业上常用的乳酸菌保藏技术。通过制备冻干粉使菌株在长期保存过程中维持活性和保藏稳定性[5-6]。然而在冻干过程中，低温、脱水会对菌体造成损伤，主要包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、代谢调节作用损伤、遗传物质稳定性破坏等，导致菌株代谢活性降低或死亡[7-8]。
菌株发酵培养基的组成、培养条件及冻干保护剂、冻干工艺、冻干后保藏条件等都会影响菌体冻干存活率及菌株活力[9]。目前提高菌体存活率大多采用添加冻干保护剂的方式[10-12]，培养基则侧重用于菌体增殖培养[13-14]，然而越来越多研究表明，菌株发酵过程中培养基碳源、氮源、无机盐等组成对菌株冷冻干燥过程中的存活率以及发酵活力有着密切联系[6]，Santivarangkna等[15]总结了在生长培养基中补充可发酵糖使菌株在干燥过程中产生提高细胞活力的代谢物，不可发酵糖可以对细胞施加高渗透压，并诱导相容溶质的积累或自身作为相容性溶质，这种积累使细胞在冷冻干燥过程中能够抵抗渗透压力；相对而言，氮源对菌株冻干存活率以及活性的影响更大。Shao等[16]发现在德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02增殖培养基中不添加酵母提取物使菌株的冻干存活率提高43.3%，并进一步发现含酵母提取物培养基生长的菌体长度较长，使得菌体受到机械损伤更大从而导致菌体存活率降低；Chen等[17]在MRS培养基中额外添加0.04 g/L天冬氨酸，可以显著降低植物乳杆菌冻干过程中细胞壁、细胞膜和DNA的损伤，能够显著提高菌株冻干存活率达84.45%；这些结果显示，培养基中氮源对菌株冻干存活率以及活性影响较大，然而尚未发现氮源调控不同乳酸菌冻干存活的普遍规律，同时大部分研究基于提高菌体冻干存活率，对菌株发酵活力的影响缺乏证据。
德氏保加利亚亚种是目前最具价值的乳酸菌之一，广泛应用于乳制品行业[18-19]，其与嗜热链球菌具有很好的协同作用，作为酸奶的主要发酵剂[20]。但冷冻干燥过程对菌体造成的损伤，使菌株存活率下降，并且降低菌株的发酵活力，影响德氏保加利亚亚种应用效果。本研究针对自主筛选的德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B61-3），分析了不同氮源对菌株抗冻干能力的影响，重点针对冻干粉发酵活力下降问题，筛选出具有显著提高发酵活力的氮源，并初步探究了氮源对菌株发酵活力保护的机制，以期为提高德氏乳杆菌保加利亚亚种抗冷冻干燥性以及冻干粉发酵活力提供理论和应用基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B61-3） 保藏于中国农业大学益生菌研究中心；MRS固体培养基 北京陆桥技术股份有限公司；明胶蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨、牛肝浸粉、鱼蛋白胨、牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、脱脂乳粉、乳清粉、豆粕、尿素、硫酸铵 均为生化试剂或分析纯试剂；鲜牛乳、白砂糖 市售；乳酸脱氢酶活性检测试剂盒、β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒、Na＋K＋-ATP酶活性检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。
MRS液体培养基 牛肉浸粉5 g、酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、无水乙酸钠5 g、硫酸镁0.58 g、柠檬酸铵2 g、磷酸氢二钾2 g、吐温80 1 mL、半胱氨酸0.5 g、硫酸锰0.2 g、加蒸馏水至1 L，pH调为6.5，于121 ℃灭菌15 min；乳糖MRS基础培养基 将MRS培养基中葡萄糖替换为20 g/L乳糖，其余成分一致；氮源分析培养基 称取20 g/L不同种类的氮源，替换乳糖MRS基础培养基中的全部氮源（牛肉浸粉、酵母浸粉、蛋白胨），其余成分不变，配制成含不同单一氮源的培养基；保护剂（w/v） 10.0%脱脂乳、6.0%海藻糖、1.0%甘油、2.0%谷氨酸钠、1.0%异抗坏血酸钠，80%蒸馏水，110 ℃灭菌20 min。
UV-2802紫外可见分光光度计 优尼柯（上海）仪器有限公司；LDZF-75L-Ⅱ立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；LGJ-30F冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；Fresco 21冷冻高速离心机、DL-CJ-2NDⅠ超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；HH-4电热恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器有限公司；SU8020扫描电镜 日本日立；JEM1200ex透射电镜 日本电子；HPS-300恒温培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；FE28 pH计 Mettler Toledo。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株活化与培养
供试菌株菌粉采用平板倾注法于43 ℃进行48 h培养，并挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，43 ℃培养12 h，连续传代三次作为种子培养液。
1.2.2 生长曲线测定
将德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3种子培养液以2%（v/v）接种量接种于MRS液体培养基中，起始活菌数为6.23 lg CFU/mL，43 ℃培养12 h，分别用紫外分光光度计和pH计每小时测定样液OD600值、pH，每2 h利用平板计数法测定样液活菌数，绘制12 h生长曲线。
1.2.3 氮源对菌株生长的影响
以2%（v/v）的接种量（6.23 lg CFU/mL）将菌株接入氮源偏好分析培养基中，以乳糖MRS基础培养基为对照，培养至菌体生长稳定期测定其OD600值及活菌数[21]，筛选出能够显著提高菌株活菌数的氮源种类。
1.2.4 氮源对菌株耐冷性的影响
将上述试验中能够显著提高菌体活菌数的氮源进行进一步筛选。乳糖MRS基础培养基中所有氮源替换为具有增菌效应的单一氮源，培养菌体生长至稳定期后进行耐冷性试验。耐冷试验参考陈琪等[22]的方法并进行了调整，取生长稳定期菌液进行4 ℃，3300×g离心10 min，菌泥用无菌生理盐水洗涤后重悬于10 mL新鲜的培养基中，放置−20 ℃条件下冷冻，分别测定冷冻前及冷冻4 h后活菌数，计算菌株存活率（菌株存活率（%）=冷冻后活菌数/冷冻前活菌数×100），以菌株存活率大小比较抗冷冻能力，利用耐冷试验筛选出具有提高菌株抗冷冻能力的氮源。
1.2.5 氮源对菌株冻干存活率的影响
通过耐冷试验筛选出的氮源，对其发酵菌体进行真空冷冻干燥，并测定不同梯度添加量分别对菌株冻干存活率的影响，添加量设定为10、15、20、25、30、35 g/L。冷冻干燥步骤为，菌体培养至稳定期后3300×g离心10 min收集菌体，将保护剂与菌泥1:1体积混合均匀，取1 mL于离心管中进行冷冻干燥，冷阱温度为-40 ℃，真空度为6 Pa，时间为40 h，将冻干菌粉用生理盐水复水至冻干前等体积，测定冻干前后活菌数，计算冻干存活率[23]，筛选出能够显著提高菌株冻干存活率的氮源及其添加量。
冻干存活率(%)=NANB×100 式中：NA为冻干后活菌数；NB为冻干前活菌数[23]。
1.2.6 发酵活力测定
根据1.2.5筛选结果，测定该氮源对德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3冻干粉发酵活力的影响，以乳糖MRS培养菌株冻干菌粉发酵活力为对照组。发酵活力测定方法为，鲜牛乳水浴加热至60 ℃后加入7%蔗糖，充分搅拌均匀至95 ℃保持5 min进行巴氏杀菌处理，冷却至室温。称取1 g冻干菌粉进行适宜梯度稀释，将7.0 lg CFU/mL活菌数冻干粉接种于牛乳中，充分混合均匀后，分装密封放置于43 ℃培养箱中发酵，每小时测定发酵乳pH、酸度值，每两小时测定活菌数，酸度值降为70°T时即为发酵终点（pH为4.5）[24]，发酵活力用°T/h表示[25]。酸度测定：按照中华人民共和国国家标准GB 5009.239-2016规定方法进行检测[26]。
1.2.7 电子显微镜观察细胞形态
根据1.2.5筛选结果，测定该氮源对B61-3冻干前后菌体形态的影响，取冻干前发酵液以及冻干菌粉复水后菌液各10 mL，170×g低速离心5 min，避免影响细胞形态，弃上清加入10 mL PBS缓冲液重悬15 min,170×g低温离心5 min，重复洗涤两次。菌泥中加入2.5%戊二醛固定液与4%多聚甲醛固定液1:1混合液，4 ℃避光过夜进行固定。样品送至北京中科百测科技有限公司进行扫描电镜和透射电镜拍摄。使用Nano Measurer1.2软件分析扫描电子显微镜图像，测量菌体长度（l）和直径（d），估算其表面积（S）与体积（V）[27]，计算长径比（l/d）和面积体积比（S/V）。
估算公式为：
S=4π r2+2π rl V=43π r3+π r2l 式中：S为菌体表面积，μm2；V为菌体体积，μm3；r为菌体半径（d/2），μm；l为菌体长度，μm。
1.2.8 酶活力测定
无细胞提取液制备：将冻干前菌液及冻干后复水菌液进行离心（4 ℃，10000×g，10 min，上清液用于胞外酶活力测定），菌泥用0.85%生理盐水洗涤2次后重悬，以体积比1:1添加0.1 mm研磨珠，涡旋仪3000 r/min振荡1 min，冰浴5 min，循环5次后10000×g离心10 min除去研磨珠及细胞碎片，置冰上待测[28-29]。
乳酸脱氢酶、Na＋K＋-ATP酶、β-半乳糖苷酶采用北京索莱宝科技有限公司相关试剂盒进行测定。
1.3 数据处理
试验均设置3个平行，以平均值±标准偏差的形式表现。试验结果采用Origin 2021绘图；通过SPSS 19.0软件进行独立样本t检验及单因素ANOVA进行方差分析，采用邓肯检验法进行多重比较。置信水平设置为95%，显著性水平为0.05。
2. 结果与分析
2.1 生长曲线
从图1可知B61-3生长曲线，通过OD值和活菌数曲线看出，8 h为菌株生长进入稳定期初期，此时菌株抗冷冻干燥能力更强，为菌体最佳收获时间[5]。
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图 1 德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3生长曲线注：菌株生长过程中pH和OD600值变化（a）、活菌数变化（b）。Figure 1. Growth curve of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaria B61-32.2 氮源筛选
2.2.1 氮源对菌株生长的影响
发酵液活菌数是影响冻干菌粉活菌数的基础，氮源是限制乳酸菌生长的主要成分之一，较高的活菌数使菌体在冻干过程中相互产生屏蔽效应，从而使菌体具有更高的存活率[30]。本研究选择16种发酵工业常用氮源，探究不同氮源对B61-3增菌效果的影响，结果如图2。单一氮源中，德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3对酵母浸粉、大豆蛋白胨氮源利用程度最为显著（P<0.05），菌株生长至稳定期时的发酵液活菌数由8.07 lg CFU/mL分别提高至8.88、8.82 lg CFU/mL。其次为胰蛋白胨、牛肝浸粉、牛骨蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉浸粉、鱼蛋白胨，相比乳糖MRS培养基均对菌株生长具有显著促进作用（P<0.05）。上述氮源均为水解蛋白类物质，能为菌体生长提供丰富的氨基酸、维生素等可促进生长的因子[31]。与对照组相比，其他氮源的利用程度较低，其中无机氮源（尿素、硫酸铵）对菌体生长促进效果较差，无法满足菌体的营养需求[32]，这是由于德氏乳杆菌保加利亚亚种属于异养生物，对无机氮源不能进行同化作用，对氨基酸的需求必须通过降解蛋白质或多肽来满足[33]。同时结果显示，B61-3对不同氮源的利用具有偏好性，并且菌株对同一类别的氮源（包括微生物类氮源、动物类氮源、植物类氮源等）利用效果也不同[34]。综上所述，酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肝浸粉、牛骨蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉浸粉及鱼蛋白胨这8种氮源能够促进德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3菌体生长。
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2.2.2 氮源对菌株耐冷性的影响
有研究表明，在−20 ℃与−40 ℃（冷冻干燥温度）条件下均会对德氏乳杆菌保加利亚亚种造成较大损伤，并且两温度条件下存活率没有显著性差异[35]，因此采用−20 ℃测定不同氮源对菌株扛冷冻的影响。氮源能够改变菌体的抗冷冻性[36]。将上述试验中显著提高菌体活菌数的8种氮源进行进一步筛选，获得可以提高菌株抗冻能力的氮源。由图3可知，当培养基中氮源成分为牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨时，所培养的菌株经−20 ℃冷冻后存活率显著高于对照组乳糖MRS（P<0.05），冷冻存活率分别提高了26.59%、13.52%、12.23%，则这3种氮源具有提高菌株耐冷冻能力的作用。
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图 3 不同氮源对菌体冷冻存活率的影响Figure 3. Effect of different nitrogen sources on freezing survival rate of bacteria2.2.3 氮源对菌株冻干存活率的影响
将上述筛选氮源所培养菌体进行冷冻干燥，并测定氮源添加量对菌体抗冻干能力的影响。不同氮源培养菌株会导致其生理性质及代谢产物有所差异，从而导致菌体对冻干环境的耐受能力亦不同[37]。由图4可知，对大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛骨蛋白胨3种氮源在不同添加量时的冻干存活率进行单因素方差分析，结果表明当培养基中氮源成分为30 g/L牛骨蛋白胨时提高菌体冻干存活率效果最为显著（P<0.05）。表1比较了氮源为30g/L牛骨蛋白胨时与乳糖MRS（对照组）冻干存活率，对照组冻干后存活率为9.68%，而以牛骨蛋白胨为氮源的存活率为18.90%，且冻干菌粉活菌数由9.65 lg CFU/g提高到10.43 lg CFU/g。以上结果表明，30 g/L牛骨蛋白胨能够显著提高B61-3冻干存活率（P<0.05）。
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图 4 不同氮源及添加量对菌体冻干存活率的影响Figure 4. Effects of different nitrogen sources and addition amount on freeze-drying survival rate of bacteria表 1 牛骨蛋白胨对菌体冻干的影响Table 1. Effect of bovine bone peptone on freeze-drying of bacteria培养基 冻干存活率
（%）冻干菌粉活菌数
（lg CFU/g）乳糖MRS基础培养基（对照组） 9.68±0.56b 9.65±0.41b 牛骨蛋白胨培养基（牛骨蛋白胨组） 18.90±0.76a 10.43±0.20a 注：同列不同字母表示组间具有显著性差异（P<0.05），表2同。 2.3 牛骨蛋白胨对发酵活力的影响
分别取牛骨蛋白胨组及对照组冻干菌粉，以等菌量接种至牛乳中测定两组发酵活力，结果如图5所示，在发酵前期，牛骨蛋白胨组冻干菌粉与对照组相比细胞生长延迟期缩短，活菌数快速增长，对应更快的pH变化；随着发酵时间的增加，两组产酸速率均快速增长，对照组在菌体接种6 h时出现最大的产酸速率为10.15°T/h，牛骨蛋白胨组最大产酸速率为12.22°T/h，出现在接种后的5 h，平均发酵活力提高22.15%；发酵后期，牛骨蛋白胨组在发酵7.25 h时pH降为4.5，即达到发酵终点，较对照组发酵时间缩短1 h，两组活菌数在发酵终点时无显著性差异（P>0.05）。以上的结果显示，与对照组相比牛骨蛋白胨组的冻干菌粉具有更快的生长速率及产酸速率，但两组在发酵结束时活菌数较为一致。菌体产酸能力与培养基中氮源密切相关[38]，牛骨蛋白胨能够提供菌体适宜的氨基酸和维生素，使菌体具有更高的发酵活力。
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图 5 氮源对菌体发酵活力的影响注：发酵过程中pH变化（A）、滴定酸度变化（B）和活菌数生长曲线（C）。Figure 5. Effect of nitrogen source on fermentation activity of bacteria2.4 牛骨蛋白胨对菌体形态的影响
菌体扫描电镜结果如图6所示，放大倍数为5000倍，B61-3在两种培养基中呈现出不同的菌体形态。冻干前，对照组中菌体较长且呈现卷曲状态，个别菌体出现损伤现象；牛骨蛋白胨组中菌体形态较短，细胞表面更加完整光滑。冻干后，对照组菌粉中菌体长度缩短，且卷曲形态未保持，菌体表面出现较多损伤；牛骨蛋白胨组冻干菌体长度无显著性差异（P>0.05），菌体形态完整，由于冷冻干燥使细胞失水使菌体表面呈现皱缩状态。对视野内300个菌体进行统计结果如表2，通过两组冻干前后菌体形态比较，发现菌体形态与冻干存活率之间存在相关性。在氮源优化前后的两种培养基中，B61-3平均长度由6.85 μm降低为4.51 μm，而菌体的平均直径没有显著性差异（P>0.05），则l/d从10.07显著降低至6.83（P<0.05）。研究表明，短小的菌体形态使其更加具有稳定性[39]，减少其在冻干过程中受到的机械损伤[40]，从而提高菌体冻干存活率。冻干后两组冻干菌粉S/V差异显著（P<0.05），S/V影响细胞膜两侧传热传质速率，比值较小的细胞在相同体积下提供的传热面积较大，传热传质速率减缓，则在细胞冻融过程中受到的破坏较小，存活率更高[27, 41]。
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图 6 扫描电镜图像注：对照组冻干前（a）、牛骨蛋白胨组冻干前（b）、对照组冻干后（c）、牛骨蛋白胨组冻干后（d）；图7同。Figure 6. Scanning electron microscope image表 2 对照组与牛骨蛋白胨组菌体长度、直径、长径比、面积体积比统计结果Table 2. Statistical results of bacterial length, diameter, aspect ratio and volume between control group and bovine bone peptone group组别 菌体长度
（l, μm）菌体直径
（d, μm）长径比
（l/d）面积体积比
（S/V）对照组冻干前 6.85±0.68a 0.68±0.03a 10.07±0.92a 6.69±0.27c 牛骨蛋白胨组冻干前 4.51±1.08b 0.66±0.04a 6.83±0.31b 6.39±0.57c 对照组冻干后 6.24±0.79a 0.60±0.05a 10.42±0.99a 14.55±0.51a 牛骨蛋白胨组冻干后 3.98±0.30b 0.64±0.03a 6.22±1.02b 7.66±0.46b 菌体透射电镜结果如图7所示，放大倍数为1500倍，冻干前样品中菌体均无明显损伤，细胞质分布较为均匀，白色透亮圆圈为细胞内的空泡，多数细胞表面平整光滑，且具有完整的细胞膜；经冷冻干燥后样品中均出现损伤现象，且对照组样品视野中菌体损伤较为严重，对照组中出现较多菌体细胞膜破裂，并且导致细胞中内容物外泄，牛骨蛋白胨组中部分菌体细胞膜表面褶皱，甚至个别菌体出现溶解现象，但大多数菌体细胞膜保持完整，并且能够看出细胞整体轮廓。试验结果表明，冷冻干燥会损伤菌体细胞膜的完整性及通透性，牛骨蛋白胨为氮源培养的菌株能够减少冻干过程中对细胞膜的损伤。
2.5 牛骨蛋白胨对菌株酶活力的影响
工业上提高乳品发酵剂培养物的发酵活力亦与培养基的氮成分相关[42]，而酶活力是影响菌株发酵活力的关键因素，菌体细胞在发酵过程中获取能量、内外物质交互、生长及代谢均受到相关酶活力的影响，在冷冻干燥过程会导致酶活力显著降低，从而影响菌体活性甚至死亡[43]，通过对相关酶含量可以间接的反映出牛骨蛋白胨对菌体发酵活力的影响。
2.5.1 牛骨蛋白胨对菌株乳酸脱氢酶的影响
乳酸脱氢酶在糖酵解过程中将丙酮酸还原成乳酸，酶活力大小直接影响菌株代谢能力及存活，反映了菌株的产酸能力[44]。该酶失活是导致菌株冻干过程中存活率下降的主要因素[45]。本文测定了两组冷冻干燥前后胞内乳酸脱氢酶活力，结果如图8所示。
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由图8可以看出，冻干前两组乳酸脱氢酶活力差异不显著（P>0.05），冻干后对照组酶活力为11.43 U，而牛骨蛋白胨组酶活力为14.87 U，两组胞内酶活力有极显著性差异（P<0.01），表明牛骨蛋白胨组具有更高的产酸能力及代谢能力，与发酵活力和冻干存活率提高结果相一致。牛骨蛋白胨中含有更丰富的氨基酸含量[46-47]，氨基酸类物质可作为相容性溶质在细胞质中积累，通过稳定细胞中结构元件与水分子之间的平衡，维持细胞膜稳定，减少冷冻干燥过程对酶带来的损伤[48]，从而使菌株冻干存活率和发酵活力有所提高。
2.5.2 牛骨蛋白胨对菌株 Na+K+-ATP酶的影响
Na+K+-ATP酶主要是通过催化水解ATP来提供Na+、K+向细胞膜内外运输的能量，从而维持菌体细胞膜内外的电位差及正常生理功能[49]（胞外酶活力测定受培养基和保护剂中磷离子影响，因此仅对胞内酶活力进行分析）。
由图9可知，培养基中不同的氮源条件下对菌体Na+K+-ATP酶活力有显著性差异（P<0.05）。冻干前相比对照组，牛骨蛋白胨组酶活力有显著提高（P<0.05）。相比冻干前，冻干后牛骨蛋白胨组酶活力有所降低，这主要是由于冷冻干燥对菌体造成的高浓度电解质环境，使酶发生变性酶活力降低；有相关研究表明，ATP酶的损伤是导致菌体失活的原因之一[44]。冻干后牛骨蛋白胨组胞内酶活力较对照组有极显著性差异（P<0.01），该结果显示牛骨蛋白胨可以增强B61-3冻干后的ATP酶活性，这可能是由于牛骨蛋白胨通过提高菌株的跨膜电势，增强对ATP的转运，使细胞内外的pH维持动态平衡状态[50]，提高菌体中蛋白质和酶产量[51-52]。
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图 9 牛骨蛋白胨对Na+K+-ATP酶活力的影响Figure 9. Effect of bovine bone peptone on Na+K+-ATPase activity2.5.3 牛骨蛋白胨对菌株β-半乳糖苷酶的影响
β-半乳糖苷酶在乳糖发酵过程中起重要的作用，乳糖在细胞内β-半乳糖苷酶的作用下水解成葡萄糖和半乳糖，是代谢反应过程中的限速步骤[53]。酶活力大小反映菌株的发酵活力，另一方面β-半乳糖苷酶属于内源性酶，当菌体细胞膜发生损害后被释放到细胞外部，因此胞外酶活力也可作为细胞通透性变化的指标[54]，结果见图10。
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图 10 牛骨蛋白胨对β-半乳糖苷酶活力的影响注：a为胞内，b为胞外。Figure 10. Effect of bovine bone peptone on β-galactosidase activity如图10所示，冻干前牛骨蛋白胨组胞内β-半乳糖苷酶比活力较对照组略有提高，受氮源中氨基酸组成的影响[55]，胞外无显著性差异（P>0.05），表明冻干前两组发酵液中菌体细胞膜均较为完整；冻干后两组胞内酶活力均显著下降（P<0.05），牛骨蛋白胨组冻干粉胞内酶活力为2.82 U，较对照组中酶活力1.03 U提高了2.75倍，这可能是由于牛骨蛋白胨中非极性分子能够自发的从培养基中（极性环境）转移至膜脂双层中（非极性环境）[56]，维持正常结构的功能屏障，增强细胞膜对酶的保护作用，有利于菌体的生长和产酸[57-58]。相反对照组胞外酶活力较牛骨蛋白胨组高出0.78 U，冷冻干燥过程中对菌体细胞膜造成损伤，从而增加了细胞膜的通透性，使胞内β-半乳糖苷酶外泄[59]。牛骨蛋白胨更适宜菌体生长促进磷脂的形成[60]，能够减少酶泄漏量，使细胞膜维持正常的通透性[61]。
3. 结论
不同氮源对德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3生长、耐冷冻、耐冻干能力具有显著影响，结果表明，培养过程中，氮源为30 g/L牛骨蛋白胨时，B61-3冻干存活率由9.68%提高至18.90%，冻干菌粉活菌数由9.65 lg CFU/mL提高至10.43 lg CFU/mL，相同菌数下发酵活力提高22.15%。发现牛骨蛋白胨能够明显改变菌体形态，菌体长度明显缩短且呈杆状，冻干后细胞膜具有褶皱但较为完整，这一结果说明菌体抗冷冻干燥性与菌体形态相关。30 g/L牛骨蛋白胨显著提高菌体冻干后胞内胞内乳酸脱氢酶、Na＋K＋-ATP酶及β-半乳糖苷酶活力，说明改善氮源能够提高菌体胞内酶活力以及细胞膜完整性，从而提高菌体抗冷冻干燥性与发酵活力。本研究通过改变氮源影响细胞生理，从而提高乳酸菌活力，为乳酸菌商业化发展提供了新的思路，未来将针对氮源调控乳酸菌耐冻干分子机制进行探索，为高活性乳酸菌发酵剂工业化提供依据。
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图 1 德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3生长曲线
注：菌株生长过程中pH和OD600值变化（a）、活菌数变化（b）。
Figure 1. Growth curve of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaria B61-3
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图 3 不同氮源对菌体冷冻存活率的影响
Figure 3. Effect of different nitrogen sources on freezing survival rate of bacteria
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图 4 不同氮源及添加量对菌体冻干存活率的影响
Figure 4. Effects of different nitrogen sources and addition amount on freeze-drying survival rate of bacteria
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图 5 氮源对菌体发酵活力的影响
注：发酵过程中pH变化（A）、滴定酸度变化（B）和活菌数生长曲线（C）。
Figure 5. Effect of nitrogen source on fermentation activity of bacteria
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图 6 扫描电镜图像
注：对照组冻干前（a）、牛骨蛋白胨组冻干前（b）、对照组冻干后（c）、牛骨蛋白胨组冻干后（d）；图7同。
Figure 6. Scanning electron microscope image
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图 9 牛骨蛋白胨对Na+K+-ATP酶活力的影响
Figure 9. Effect of bovine bone peptone on Na+K+-ATPase activity
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图 10 牛骨蛋白胨对β-半乳糖苷酶活力的影响
注：a为胞内，b为胞外。
Figure 10. Effect of bovine bone peptone on β-galactosidase activity
表 1 牛骨蛋白胨对菌体冻干的影响
Table 1 Effect of bovine bone peptone on freeze-drying of bacteria
培养基 冻干存活率
（%）冻干菌粉活菌数
（lg CFU/g）乳糖MRS基础培养基（对照组） 9.68±0.56b 9.65±0.41b 牛骨蛋白胨培养基（牛骨蛋白胨组） 18.90±0.76a 10.43±0.20a 注：同列不同字母表示组间具有显著性差异（P<0.05），表2同。 
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表 2 对照组与牛骨蛋白胨组菌体长度、直径、长径比、面积体积比统计结果
Table 2 Statistical results of bacterial length, diameter, aspect ratio and volume between control group and bovine bone peptone group
组别 菌体长度
（l, μm）菌体直径
（d, μm）长径比
（l/d）面积体积比
（S/V）对照组冻干前 6.85±0.68a 0.68±0.03a 10.07±0.92a 6.69±0.27c 牛骨蛋白胨组冻干前 4.51±1.08b 0.66±0.04a 6.83±0.31b 6.39±0.57c 对照组冻干后 6.24±0.79a 0.60±0.05a 10.42±0.99a 14.55±0.51a 牛骨蛋白胨组冻干后 3.98±0.30b 0.64±0.03a 6.22±1.02b 7.66±0.46b
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