大豆拉丝蛋白（drawing soy protein，DSP），是一种以低温食用豆粕、大豆分离蛋白、小麦分离蛋白和谷朊粉等多种谷物蛋白为主要原料，经过双螺杆或三螺杆挤压技术生产出来的高密度纤维状植物蛋白^[1]。与传统大豆组织蛋白的蜂窝状组织结构相比，DSP的丝状结构使其具有类似肌肉纤维的质地和咀嚼感，这也让其成为“植物肉”的最佳原料之一^[2]。此外，DSP的营养价值高，富含8种人体所需的氨基酸，蛋白含量一般在60%以上，具有降低胆固醇、防止心血管疾病以及补充优质蛋白等保健功效^[3-4]。在应用方面，DSP凭借其良好的产品外形稳定性，较低的价格成本，广泛应用在调理菜肴、素食仿肉制品以及休闲食品的制作中^[5-6]。然而，目前以DSP为原料的产品大多采用热加工的形式使其蛋白质发生高度变性，不仅降低其溶解性以及再加工度，而且会对其营养功能造成损失，导致其应用范围受到限制，使得整体市场规模不大^[7-8]。截止到2019年底，我国拉丝蛋白年产量5万吨，年产值仅8亿元^[9]。

超高压技术（high pressure processing，HPP），是一种新型非热食品加工技术，突破了传统热加工技术的约束，可以在较低的处理温度下对食品进行快速、均匀地加压处理，最大限度避免了营养成分损失的同时达到较为理想的加工效果，因此被誉为“21世纪十大尖端科技之一”^[10]。随着研究的逐渐深入，其研究焦点从一开始的杀菌逐渐扩展到蛋白质改性等多个领域。例如Penna等^[11]研究发现，超高压处理主要通过影响蛋白质分子之间和内部的非共价键的作用力，引起蛋白质结构的变化，从而诱导蛋白质的变性，进一步导致其溶解性、表面疏水性等理化特性的变化。

目前，国内外许多研究证明超高压处理是一种安全、高效的蛋白质改性手段，有利于改善蛋白质诸多的特性。例如Tan等^[12]研究发现，超高压协同pH偏移处理大豆分离蛋白可以让蛋白质的结构得到显著展开，从而增加蛋白质的溶解性以及表面电荷，提升其乳化特性。王炳智^[13]研究发现，100~400 MPa超高压处理能显著性提高小麦面筋蛋白的交联度，从而增加其热稳定性、持水性和乳化特性，改性后的小麦面筋蛋白内部形成更加均匀、致密的三维网络结构。这些报道说明了超高压处理会对大分子植物蛋白的结构特性和功能特性产生一定的影响。

目前，不同超高压处理条件对DSP的结构和功能特性影响研究较少，且其中的影响机理尚不明确，在一定程度上限制了DSP非热加工产品的研发以及产业的健康发展^[14]。故本文以DSP为研究对象，设置不同的超高压处理条件对其进行处理，利用内源荧光光谱、紫外光谱和傅里叶红外光谱表征处理前后蛋白结构的变化，通过持水力、疏水性和游离巯基含量分析处理前后对功能特性的影响，从而探究超高压对DSP蛋白特性的影响机理，为超高压进一步应用于DSP的非热加工工艺提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

大豆拉丝蛋白（DSP，食品级，蛋白质含量67%）　河南品正食品有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甘氨酸（GLy）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、8-苯胺基-1-萘磺酸钠（ANS）、5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA）、尿素、溴化钾（分析纯）　国药集团化学试剂有限公司；其他试剂　均为分析纯，北京化工厂。

AR1140分析天平　上海奥豪斯国际贸易有限公司；LFP-750A高速多功能粉碎机　上海菲力博宝业公司；ARC120电子天平　美国奥豪斯公司；HWS-24恒温水浴锅　上海一恒科学仪器有限公司；DZ-260B真空包装机　北京恺欣世纪科技有限公司；L2-700/1超高压设备　天津华泰森淼生物工程技术有限公司；LGJ-12冷冻干燥机　北京松源华兴科技发展有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计　日本岛津公司；爱丁堡FS5荧光分光光度计　英国爱丁堡仪器公司；TDL-5-A台式离心机　上海安亭科学仪器厂制造；Spectrum 100傅立叶红外变换光谱仪　美国Perkin-Elmer公司。

1.2   实验方法

1.2.1   DSP的超高压处理

参考黄薇^[15]的方法进行测定。称取一定质量的DSP放置于粉碎机中粉碎过60目筛，将其加入去离子水中，配成浓度为8%（g/100 mL，w/v）的悬浊液，之后装入聚乙烯袋中。用真空包装机抽真空封口，抽真空时间为25 s，热封3 s，降温3 s，热封后尽量避免蛋白质悬浊液中有起泡现象。将密封完好的样品放入超高压设备的高压腔中，以水为传压介质，使得样品完全浸没于水中，设置处理压力分别为200、400、600 MPa，处理时间为10、20、30 min，升压速率为6.5 MPa/s，降压速率为20 MPa/s，并以未经超高压处理的常压样品（0.1 MPa）作为对照组。将超高压处理前后的样品冷冻干燥，置于4 ℃冰箱保存，24 h之后进行后续的检测与分析。

1.2.2   傅里叶变换红外光谱的测定

参考Chen等^[16]的方法进行测定。称取2 mg的样品粉末与198 mg溴化钾置于玛瑙研钵内，充分混合研磨，利用压片机将其压成透明均匀的薄片，置于光谱仪中进行全波长的扫描，检测范围4000~500 cm⁻¹，扫描信号累加32次，光谱分辨率4 cm⁻¹。使用peakfit软件对光谱进行分析处理。

1.2.3   紫外吸收光谱的测定

参考Jahanban等^[17]的方法进行测定。称取8 mg的样品粉末，用0.1 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲溶液进行溶解配制成浓度为1.0 mg/L的悬浮液，4000 r/min离心10 min，利用紫外-可见分光光度计测定样品在200~400 nm波长范围内的吸光度（间隔0.5 nm），绘制紫外吸收光谱图。

1.2.4   内源荧光光谱的测定

参考臧燕妮^[18]的方法进行测定。称取10 mg的样品粉末，用0.1 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲溶液进行溶解配制成浓度为0.25 mg/L的悬浮液，室温振荡1 h，8000 r/min离心10 min，取离心后的上清液进行测定，设定荧光分光光度计的参数为：激发波长为280 nm，发射波长为300~500 nm，夹缝宽度为5 nm，并以相应的空白缓冲溶液作为背景进行荧光光谱扫描，重复测定3次。

1.2.5   持水力的测定

参考Tang等^[19]的方法进行测定。称取约0.2 g的样品置于离心管中，加入8 mL去离子水，充分混匀，在25 ℃静置20 min，在25 ℃条件下以5000 r/min离心15 min，去除上清液，控干水分，称重并重复测定3次。

式中：m₁：样品质量，g；m₂：离心管质量，g；m₃：离心后，吸出上层液体后离心管的质量，g。

1.2.6   表面相对疏水性的测定

参考ANS荧光探针^[20]的方法进行测定。称取8 mg的样品蛋白粉末，加入0.1 mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲溶液进行溶解配制成浓度为1 mg/L的悬浮液，放置在25 ℃恒温水浴锅中反应1 h，然后以10000 r/min的转速离心10 min。取离心后的上清液6 mL作为待测样，吸取2 mL作为空白样，剩余溶液加入20 μL 8 mmol/L的ANS荧光探针，充分混匀避光静置30 min后进行测定，设定荧光分光光度计的参数为：激发波长为390 nm，发射波长为400~700 nm，夹缝宽度为5 nm，并以相应的空白缓冲溶液作为背景进行荧光光谱扫描，重复测定3次。

1.2.7   游离巯基含量的测定

参考Guo等^[21]的方法进行测定。首先称取4 mg DTNB溶解于1 mL Tris-GLy缓冲溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L GLy，4 mmol/L Na₂EDTA）后充分振荡，配制成Ellman’s试剂（10 mmol/L）。其次称取240.24 g尿素加入到500 mL的Tris-GLy缓冲溶液后充分振荡，配制成Tris-GLy-尿素溶液（8 mol/L）。

称取40 mg蛋白冻干粉末，加入8 mL Tris-GLy-尿素溶液，再加入40 μL Ellman’s试剂，充分振荡均匀后，在25 ℃下避光1 h，10000 r/min离心10 min，以对应的缓冲液作为空白对照。取上清液用紫外-可见分光光度计测定样品在412 nm处的吸光值，每个样品测定3次后取平均值。样品的游离巯基含量可以通过以下公式进行计算：

式中：A₄₁₂：412 nm下的吸光度值；C：样品浓度，mg/mL；D：稀释倍数（本试验中未进行稀释）。

1.3   数据处理

所有实验均来自3次及以上实验结果的平均值。通过Excel和Origin 2021对数据进行整理和绘图。数据采用SPSS 18.0软件进行方差分析。采用单因素方差分析和Duncan’s法进行统计学分析，显著性水平为0.05。

2.   结果与分析

2.1   超高压对DSP二级结构的影响

傅里叶变换红外光谱作为研究蛋白质二级结构的一种热门、有效的手段，有着蛋白用量少、不受蛋白状态、环境、浓度等影响的优点^[22]。超高压处理后的DSP在酰胺A带（3300 cm⁻¹左右）、酰胺B带（3000 cm⁻¹左右）、酰胺I带（1660 cm⁻¹左右）、酰胺II带（1540 cm⁻¹左右）和酰胺III带（1240 cm⁻¹左右）都有吸收峰出现^[23]。与对照组相比，各特征峰的峰值都有不同程度的增加，说明超高压对蛋白质的二级结构会产生一定的影响。具体来说，随着压力的增大，酰胺A带峰值逐渐增加并向短波数方向移动，如600 MPa、10 min时红移9 cm⁻¹，说明HPP可以使得DSP二级结构中的氢键发生变化^[24]；酰胺I带峰值逐渐增加并向着长波数方向移动，如600 MPa、10 min时蓝移4 cm⁻¹，说明碳氧双键（C=O）所处的化学环境或者结构发生变化，使得双键上的电子云密度增加^[25]。此外，酰胺B带、酰胺II、III带的偏移的变化并不明显。以上现象可能是由于水分子在HPP处理过程中进入DSP内部，使得蛋白质内部结构发生变化，从而使得蛋白二级结构发生改变，如图1所示。

图  1  超高压处理前后DSP的傅里叶变换红外光谱

注：A：保压时间为10 min；B：保压时间为20 min；C：保压时间为30 min；图2~图4同。

Figure  1.  FTIR of DSP before and after high pressure processing treatment

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其中酰胺I带对蛋白质的结构分析十分重要，它与蛋白质的二级结构存在一定对应关系。β-折叠吸收峰处于1600~1640 cm⁻¹，无规则卷曲吸收峰处于1640~1650 cm⁻¹，ɑ-螺旋吸收峰处于1650~1660 cm⁻¹，β-转角吸收峰处于1660~1700 cm^−1[26]。利用peakfit软件对光谱进行去卷积、分峰、拟合，根据不同吸收峰的反应结构，计算峰的面积与比例。

超高压处理前后DSP二级结构相对含量如图2所示，在同一保压时间下，随着压力的增加，样品中的β-折叠、无规则卷曲含量总体呈现上升趋势，ɑ-螺旋的含量为下降趋势，β-转角含量呈现先上升后下降的趋势。如在保压10 min的条件下，对照组的β-折叠、无规则卷曲相对含量分别为32.81%与12.29%，当压力增加至600 MPa时，β-折叠、无规则卷曲相对含量分别增加至36.92%与14.85%；ɑ-螺旋的相对含量下降更为明显，从对照组的23.15%下降至600 MPa时的12.47%；β-转角的相对含量则在400 MPa时达到最大，为36.76%。这说明超高压可以使蛋白质的紧密结构变得松散，进一步促进DSP的二级结构展开，使其向着无序化方向进行转变^[27]。黄薇^[15]在研究超高压对小麦面筋蛋白的影响也发现，超高压处理完后的小麦面筋蛋白ɑ-螺旋含量下降，β-转角含量上升，与本研究结果类似。

图  2  超高压处理前后DSP二级结构相对含量的变化

Figure  2.  Changes of relative content of DSP secondary structure before and after high pressure processing treatment

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此外，实验发现在同一压强条件下，随着保压时间的增加，样品中的无规则卷曲、β-折叠的含量均有所增加，ɑ-螺旋、β-转角含量有所降低，这说明随着保压时间的逐渐延长，蛋白质的二级结构同样向着无序化方向进行，保压时间过长也能对蛋白质的二级结构造成破坏^[28]。总的来说，随着超高压处理时间和压强的增加，DSP二级结构中的β-折叠、无规则卷曲相对含量上升，这说明超高压破坏了DSP的二级结构，使其向着无序化方向进行，其中600 MPa、30 min条件对DSP的二级结构影响程度最大。

2.2   超高压对DSP三级结构的影响

2.2.1   紫外吸收光谱的分析

DSP富含多种氨基酸，其中酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）等中的苯环含有共轭双键，使其具有吸收紫外光的性质^[29]。超高压处理后会导致蛋白质结构发生改变，从而影响氨基酸残基位置和周围环境，使紫外吸收光谱发生相应的变化。DSP有两个吸收峰，第一个吸收峰在波长210 nm附近，主要是肽键的吸收峰；第二个吸收峰波长的范围在250~280 nm，主要是Phe、Trp、Tyr的特征吸收峰；通过分析紫外吸收光谱特征峰的差异探究超高压前后氨基酸暴露的情况^[30]。

超高压处理前后DSP的紫外吸收光谱如图3所示，随着超高压压力的增加，Phe、Trp、Tyr的特征吸收峰呈现先上升后下降的趋势，在400 MPa时达到最大；随着超高压保压时间的增加，Phe、Trp、Tyr的特征吸收峰呈现逐渐减小的趋势，在30 min时达到最小。出现这种现象可能是由于适当的压力和保压时间会使得蛋白质的空间结构展开，内部疏水氨基酸得以暴露，导致吸光度上升；而较高的压力和较长的保压时间则会导致蛋白质结构重新闭合，导致吸光度下降^[31]。秦瑞旗^[32]研究超高压对谷朊粉的改性时也发现，只有在适当的压力和时间条件下，蛋白质的紫外吸收峰才会增加，与本实验结果相似。从图中实验结果看，DSP在210 nm处的吸收峰强度远大于280 nm处的吸收峰强度，并且肽键与Phe、Trp、Tyr的特征吸收峰的变化保持一致。超高压处理虽然主要作用于非共价键，对肽键的影响较小，但是蛋白结构的展开或闭合会影响肽键特征峰吸光度的变化。同时，本研究发现尤其在400 MPa条件下，肽键的吸收峰（210 nm）的峰位发生较为明显的红移，也说明DSP结构发生一定的改变。以上结果表明超高压处理确实会对DSP的三级结构造成一定的影响，其中400 MPa、10 min时蛋白的三级结构得到最大程度的伸展，这可能有利于持水力等加工特性的提升。

图  3  超高压处理前后DSP紫外吸收光谱的变化

Figure  3.  Changes of UV absorption spectrum of DSP before and after high pressure processing treatment

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2.2.2   内源荧光光谱的分析

紫外吸收光谱中起主要作用的三种芳香族氨基酸中Phe残基的荧光被激发的可能性较小，蛋白质的内源荧光往往依靠Trp和Tyr残基进行激发，故选择激发波长为280 nm^[33]。

超高压处理前后DSP的内源荧光光谱如图4所示，由于起作用的氨基酸残基基本一致，内源荧光光谱与紫外吸收光谱的变化也趋势基本一致，其结果可以相互印证。DSP的最大吸收波长（λ_max）分布在350 nm左右，随着压力和保压时间的增加，λ_max并没有发生显著的红移和蓝移。同时，荧光强度随着压力的增加呈现先上升后下降的趋势，随着保压时间的增加呈现逐渐下降的趋势。这表明适当的HPP处理可以使得更多的Trp和Tyr残基暴露在蛋白质分子表面的极性环境中^[34]；随着保压时间的延长，荧光强度的下降可能是由于蛋白质结构的重新闭合以及磷酸缓冲溶液中含有${\rm{H}}_2 {\rm{PO}}_4^-$与${\rm{HPO}}_4^{2-}$离子，会对荧光的产生有强烈的猝灭作用^[35]。综上，DSP的内源荧光光谱和紫外光谱具有相似的变化趋势，这充分说明了HPP处理可以使其三级结构发生改变。

图  4  超高压处理前后DSP内源荧光光谱的变化

Figure  4.  Changes of endogenous fluorescence spectrum of DSP before and after high pressure processing treatment

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2.3   超高压对DSP持水力的影响

持水力是指干燥的DSP能够吸附水分的能力，适当的持水力可以延长产品的保质期，提升产品品质^[36]。

超高压处理对DSP持水力的影响如图5所示，对照组DSP的持水力为3.62 g/g，超高压处理对蛋白的持水力有着显著性影响（P<0.05），其中400 MPa、10 min时DSP的持水力达到最大值为4.81 g/g。在同一保压时间下，其持水力随着处理压力的增大呈现先增加后减少的趋势，在压力为400 MPa时达到最大，这可能由于适当加压会使得蛋白非共价键平衡被破坏，使得空间结构松散，允许更多的水进入蛋白质分子的内部；较高的压力可能会导致蛋白质结构重新致密^[37]。而DSP的持水力随着保压时间的延长而逐渐下降，这可能是由于较长时间的超高压处理使得DSP发生变性，其中不溶性蛋白质含量逐渐增多，从而使得其持水力下降，这说明在较短的保压时间下才能有效地提高DSP对水的吸附性能^[32]。以上实验结果说明适当条件下的超高压处理可以使得DSP空间结构松散、持水能力上升，其中以400 MPa、10 min的条件最佳。

图  5  超高压处理对DSP持水力的影响

注：小写字母不同表示不同压强和保压时间的处理组之间差异显著，P<0.05；图6~图7同。

Figure  5.  Effects of high pressure processing treatment on water holding capacity of DSP

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2.4   超高压对DSP表面相对疏水性的影响

表面相对疏水性是表征蛋白质三级结构变化中非常重要的指标。通常情况下，非极性氨基酸会在蛋白质内部形成疏水内核，极性氨基酸则排布于蛋白质表面，以此来保证蛋白质整体的稳定性^[38]。ANS荧光探针主要是通过与疏水性基团结合，提高其荧光强度，从而达到对表面相对疏水性测定的目的。本实验设定激发波长为390 nm，DSP最大发射波长（520 nm）的荧光强度变化程度反映了蛋白表面相对疏水性。

超高压处理前后DSP的表面相对疏水性如图6所示，在10 min时，经过超高压处理的DSP样品的相对荧光强度随着压力的增加总体呈现先上升后下降的趋势最为明显。与对照组样品的相对荧光强度相比，400 MPa、10 min条件下的相对荧光强度显著增加15.66%（P<0.05）；600 MPa、30 min条件下的相对荧光强度显著下降16.35%（P<0.05）。以上结果说明较低的压力可以使得DSP高级结构伸展，肽链结构松散，导致内部部分疏水基团暴露^[39]。在相同处理压力下，保压时间为10 min时有助于提高DSP的表面相对疏水性，但继续延长时间则会使得其表面相对疏水性下降。与对照组样品的相对荧光强度相比，200 MPa下处理10 min，相对荧光强度显著增加9.66%（P<0.05），但处理时间延长至30 min，相对荧光强度与对照组差异不显著（P>0.05）。这表明过长的保压时间会导致蛋白质重新聚集，疏水基团被重新隐藏^[40]。以上结果也佐证了紫外、荧光光谱的结论，说明超高压处理可以使得蛋白质三级结构伸展，暴露其中的疏水基团，使得蛋白质的表面疏水性提高，但400 MPa以上的压强或10 min以上的保压时间均不利于表面疏水性的提高。

图  6  超高压处理前后DSP表面相对疏水性的变化

Figure  6.  Changes of surface hydrophobicity of DSP before and after high pressure processing treatment

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图  7  超高压处理前后DSP游离巯基的变化

Figure  7.  Changes of free SH content of DSP before and after high pressure processing treatment

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2.5   超高压对DSP游离巯基含量的影响

蛋白质中游离巯基的含量与蛋白质结构伸展程度、蛋白质中二硫键的转化程度等因素有关，通过测定游离巯基的含量变化可以在一定程度上用于反映蛋白质之间二硫键的形成趋势^[41]。

超高压处理前后DSP的游离巯基含量如图7所示，随着压力的增大，蛋白质中游离巯基的含量先上升后下降，在400 MPa、10 min时达到最大，为3.4 μmol/g（P<0.05）。这可能是由于当压力低于400 MPa时，二硫键断裂，DSP的结构部分展开，隐藏在分子内部的半胱氨酸残基逐渐暴露出来，导致游离巯基的含量逐渐增多；但当压力高于400 MPa时，可能由于暴露的巯基转化为二硫键，也可能由于蛋白的空间结构重新闭合，暴露的巯基重新折叠包埋，从而导致游离巯基含量减少^[42]。保压时间由10 min延长至30 min时，游离巯基含量呈现下降的趋势，其中200、600 MPa处理组在20、30 min时差异均不显著（P>0.05）。这下降的趋势可能是过长的保压时间导致暴露的巯基发生氧化反应转化成二硫键所致^[43]。以上实验结果表明，适当的超高压处理有助于提高游离巯基的含量；但较高的压强或较长的保压时间会使游离巯基氧化或者重新包埋，进而降低其含量。

3.   结论

本文主要研究了超高压处理对DSP特性的影响。首先，超高压处理对DSP的结构特性有一定的影响。随着压力和时间的增加，原有的三级结构得到伸展，发色氨基酸得以暴露，荧光和紫外光谱强度增强，在400 MPa、10 min时达到最大；但过大的压力以及过长的时间，反而使得三级结构重新闭合，光谱强度减弱，在600 MPa、30min时达到最小。同时，傅里叶红外光谱显示超高压处理对二级结构向着无序化方向进行，这主要表现在随着压力和时间的增加，β-折叠、无规则卷曲含量总体呈现上升趋势。其次，超高压处理对DSP的功能特性有一定的影响。DSP的持水力、游离巯基含量以及表面相对疏水性随着压力和时间的增加呈现出先上升后下降的趋势，在10 min时最为明显，这与超高压处理对其结构的变化规律一致。

综上所述，超高压处理能够使DSP高级结构伸展，从而暴露出内部更多的反应位点和基团，有利于提高其持水力等再加工特性。此外，超高压处理DSP的非热加工产品目前还处于待开发状态，值得研发人员关注和研究。后续可以深入探究超高压处理对DSP分子的解离和重新聚合的有关机制，对扩展DSP应用范围，提高其市场接受程度，提升其相关产品的国际竞争力有着重要意义。