α-Glucosidase Inhibitory Activity and Safety Evaluation of Branch and Leaf Extracts of Phyllanthus acidus
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摘要: 对西印度醋栗（Phyllanthus acidus Skeels）枝叶提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性及安全性进行评价，为该植物的安全食用和药用研发提供参考。采用溶剂回流提取得到西印度醋栗枝叶的全组分样品，然后按照极性大小进一步对全组分进行分组划段，分别得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇组分，以及乙醇洗脱组分和水溶出组分；以半抑制浓度（IC50）为评价指标，比较不同组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性。通过经典急毒实验法测定各组分对小鼠的近似最大耐受量（MTD）和半数致死量（LD50），将全组分样品进行连续灌胃20 d评价其亚急性毒性。结果表明，西印度醋栗枝叶各组分对α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制能力；全组分的MTD为2.0 g/kg，不同组分样品的毒性大小为乙醇洗脱组分>水溶出组分>石油醚组分>乙酸乙酯组分>正丁醇组分>全组分。主要急性毒性症状是惊跳随后怠动、扭体、呼吸急促等。亚急性毒性试验未见明显毒性反应及病变，表明在口服摄入西印度醋栗全组分2 g/kg/d（相当于干燥枝叶8.6 g/kg）是安全的，具有开发为降血糖、减肥食品和药品的潜力。Abstract: To provide reference for the safety consumption of Phyllanthus acidus (PA) as food and its further medicinal development and utilization, a comparative study on acute and short-termtoxicity and α-glucosidase inhibitory ability of different components of its branches and leaves was conducted. The crude extract of PA, prepared under aqueous ethanol reflux extraction, was partitioned successively with petroleum ether, ethyl acetate and N-butanol according to the polarity. Furthermore, an alcohol-eluted and water-eluted fractions were obtained from water-soluble residue by column chromatography. The half inhibitory concentration (IC50) of α-glucosidase was used as the evaluation index to compare the in vitro hypoglycemic activity of different extracts. The acute toxicity of these fractions was screened by maximum tolerated dose (MTD), median lethal dose (LD50) values, and their subacute toxicity was evaluated by continuous oral administration of samples for 20 days. The results showed that each component of PA had a certain inhibitory ability to α-glucosidase. The MTD of crude extract of PA was 2.0 g/kg, and the order of acute toxicity for different fractions was ethanol-eluted fraction>water-eluted fraction>petroleum ether fraction>ethyl acetate fraction>N-butanol fraction>crude extract. The main acute toxicity symptoms were startle followed by idling, writhing, and shortness of breath. Subacute toxicity test showed no obvious toxicity and lesions. It was indicated that it was safe to take 2 g/kg/d (equivalent to 8.6 g/kg of dried branches and leaves) of the whole component of PA at oral ingestion. Thus, they have the potential to be developed as hypoglycemic, weight-loss food and medicine.
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Keywords:
- Phyllanthus acidus /
- branches and leaves /
- α-glucosidase /
- acute toxicity /
- subacute toxicity /
- safety evaluation
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西印度醋栗（Phyllanthus acidus (L.) Skeels）为大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）常绿乔木，树高2~5 m，花后结青色小果，为大戟科内少数能食用的树种之一。该植物原产于马达加斯加岛，目前在热带和亚热带地区，如泰国、印度和越南，以及中国云南西双版纳和元江均有种植[1-2]。研究表明，西印度醋栗枝叶主要含黄酮类[3]、萜类[4-9]以及有机酸、核苷、氨基酸衍生物、酚性化合物等[10-11]，其中部分化合物具有抗菌、抗炎、保肝、降血糖等活性[1-2, 10]。在印度传统医学中，西印度醋栗的叶用于治疗发烧、痔疮、天花、瘙痒和牙龈感染[12-15]，还可以制成用于治疗肝病的汤剂、抗高血压的药物等[16]。在印度尼西亚、泰国和印度等地区，西印度醋栗的叶也被当做一种食用蔬菜[1-2]，表明西印度醋栗枝叶在食品和医药领域具有进一步开发利用的潜力。但在马来西亚人们认为其叶有很强的毒性，而且本课题组前期发现叶的小极性提取物部分对两种正常人体细胞表现了较强的细胞毒活性[10]，目前关于该植物叶研究报道中，缺少毒性和安全性的考察，因此该植物叶作为广泛食用植物尚缺少理论依据。
安全性是确保西印度醋栗枝叶开发利用的前提。不同极性提取物的成分不同，其毒理学安全性也有可能存在差别，针对西印度醋栗枝叶毒理学安全性评价及不同组分α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的研究至今未见报道。本研究对元江引种西印度醋栗枝叶的不同极性样品进行小鼠毒性反应观察和20 d经口毒性试验，同时分析不同组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，以期为该植物的食用安全以及进一步药用研发提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
西印度醋栗枝叶 于2021年8月采自云南省元江县，由中国科学院昆明研究所刘恩德博士鉴定为西印度醋栗（P. acidus）的枝叶，植物标本保存于中国科学院昆明研究所西部植物化学与植物资源国家重点实验室，标本编号（Kib-18-05-22）；实验动物BALB/c小鼠 体重18～22 g，雌雄各半，由中国科学院昆明植物研究所动物实验中心提供，许可证号：SYXK（滇）K2018-0005。试验期间，小鼠自由饮食，进食普通饲料，环境温度23±3 ℃，湿度适宜。动物福利和实验过程均遵循中国科学院昆明植物研究所动物管理委员会的规定；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷 上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖 成都德思特生物技术有限公司；α-葡萄糖苷酶（70万U/mL，酵母来源） 博奥森生物技术有限公司；Diaion HP20树脂 上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO） Sigma公司。
R-1005小型旋转蒸发仪 海道尔夫仪器设备（上海）有限公司；R-1002型旋转蒸发器 上海申顺生物科技有限公司；ALC 210.3电子天平 上海第二天平仪器厂；Infinite M200 Pro多功能酶标仪 长沙市鸿跃实验设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 供试样品的制备
参考文献方法并加以修改[17]，取西印度醋栗干燥枝叶30 kg，粉碎（60~200目）后用70%乙醇室温下提取3次，合并提取液减压浓缩除去有机溶剂得到总提取浓缩液17 L。总提取浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取8次，得到石油醚组分（1.2 kg）、乙酸乙酯组分（285 g）和正丁醇组分（432 g）。溶剂萃取后的水相部分进一步通过Diaion HP-20树脂柱层析，分别用水和乙醇洗脱，得到水洗脱组分（868 g）和乙醇洗脱组分（680 g）。以上组分均经过旋转蒸干挥去有机溶剂。制备流程图如图1所示。
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图 1 西印度醋栗不同极性提取物制备流程图Figure 1. Preparation flowing chart of different polar extracts of Phyllanthus acidus1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
参考文献方法建立体系[18-19]，采用96微孔板，加入30 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，再加入不同待测样品30 μL，浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL，置于37 ℃的恒温反应10 min，再加入40 μL浓度4 mmol/L对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液，然后恒温孵育30 min，再加入120 μL浓度0.2 mol/L的碳酸钠溶液用于终止反应，利用多功能酶标仪于405 nm处检测吸光度值（OD），阳性对照为阿卡波糖，对照为不加抑制剂，对照空白为不加抑制剂和α-葡萄糖苷酶溶液，按照以下公式计算抑制率。
抑制率(%)=[1−(样品OD−样品空白OD)(对照OD−对照空白OD)]×100 1.2.3 急性毒性试验
LD50是反映急性毒性的重要指标，按照经典急毒试验方法[20]，先进行预试验，找出LD0值和LD100值，并确定组间距r值。根据预实验结果，各组分设置六个试验组，包括五个剂量组和一个生理盐水对照组，各组分60只小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，以10 mL/kg给药一次。石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分的给药剂量分别为400、500、625、781、976 mg/kg，水洗脱组分别为256、320、400、500、625 mg/kg，乙醇洗脱组分别为70、88、109、137、171 mg/kg（r=0.8），各组分剂量由低到高分别为药物1组~药物5组，通过统计学软件SPSS 26.0概率单位加权回归法（Bliss）计算LD50[21]。
1.2.4 全组分MTD测定
根据预试验结果，取小鼠20只，雌雄各半，体重为18～22 g小鼠灌胃生理最大耐受量为按体重0.4 mL/10 g。因此，最大耐受量试验中以全组分浓度2.0 g/kg（最大浓度），40 mL/kg（最大体积）连续灌胃小鼠2次（每隔6 h灌胃一次）。灌胃后着重观察药后0~12 h内小鼠急毒反应及死亡情况，每隔15 min观察一次，记录14 d内存活小鼠的体重以及毒性反应和死亡状况。死亡动物进行解剖，观察死亡小鼠主要脏器有无异常。
1.2.5 亚急性毒性试验
参考文献方法[22-24]，取小鼠40只，雌雄各半，分为药物组和空白组，药物组以250 mg/kg总提物部分灌胃，空白组以相同比例的DMSO灌胃，均灌胃小鼠20 d，每天灌喂一次，给药后每天注意观察记录小鼠的精神状况、体重变化和死亡情况，实验结束后将小鼠脱颈处死，解剖观察是否有病变[25]，除去多余组织，用4 ℃生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分后称重，计算脏器指数；同时采集肝脏、脾脏、肾脏组织进行固定和制作石蜡切片，用于组织病理学检测。脏器系数计算公式如下：
脏器系数(%)=脏器重量(g)小鼠体重(g)×100 1.3 数据处理
试验数据采用SPSS 26.0进行统计处理，数据以均数±标准差表示，用单因素方差分析（ANOVA）进行差异性检验，图表采用GraphPad Prims 8.0.2绘制分析。
2. 结果与分析
2.1 西印度醋栗枝叶各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性
为初步判定西印度醋栗枝叶提取物不同组分的体外抗糖活性，选取α-葡萄糖苷酶作为靶点[26]。结果如图2，各组分及阳性对照IC50排序为阿卡波糖（0.34±0.065 mg/mL）<正丁醇组分（0.92±0.011 mg/mL）<乙醇洗脱组分（1.11±0.055 mg/mL）<石油醚组分（1.29±0.031 mg/mL）<乙酸乙酯组分（1.35±0.047 mg/mL）<水溶出组分（1.49±0.023 mg/mL）。各组分及阳性对照的抑制能力与IC50排序相反，各组分均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制能力，但均不及阳性对照阿卡波糖组。
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图 2 西印度醋栗枝叶各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 2. α-Glucosidase inhibition ability of different fractions from branch and leaf extracts of P. acidus2.2 西印度醋栗枝叶各组分的急性毒性
2.2.1 急性毒性试验中小鼠体重变化情况
由表1可见，各剂量组小鼠的初始体重与对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。通过第3、5、7、10、14 d小鼠体重与对照组的比较，存在显著性差异（P<0.05）。说明西印度醋栗枝叶不同组分提取物对小鼠体重有显著影响。
表 1 急性毒性试验中小鼠体重变化情况Table 1. Changes of body weight of mice in acute toxicity test组别 剂量（mg/kg） 始重（g） 第3 d体重（g） 第5 d体重（g） 第7 d体重（g） 第10 d体重（g） 第14 d体重（g） 石油醚组分 400 21.33±0.60 20.04±1.03** 20.41±0.96** 20.90±0.96** 21.16±0.92** 21.83±0.81** 500 20.87±0.79 19.23±0.97** 19.37±1.01** 19.87±1.15** 20.37±1.11** 20.72±1.05** 625 20.91±1.06 19.53±0.86** 19.78±0.65** 20.18±0.93** 20.68±0.71** 21.13±0.55** 781 21.15±0.69 18.73±0.32** 19.37±0.31** 19.70±0.36** 19.97±0.40** 20.33±0.55** 976 20.66±0.89 − − − − − 乙酸乙酯组分 400 20.96±0.86 19.89±1.57* 20.02±1.70* 20.28±1.77** 20.78±1.48** 21.51±1.27** 500 20.73±1.08 19.64±1.05** 20.03±1.04** 20.60±0.69** 21.21±0.68** 22.10±0.59** 625 20.81±0.77 18.96±0.78** 20.20±0.84** 20.76±0.78* 21.30±0.69** 22.08±0.60** 781 20.64±0.83 19.30±0.44** 19.87±0.25** 20.30±0.17** 20.97±0.25** 22.13±0.32** 976 21.12±0.64 − − − − − 正丁醇组分 400 21.01±0.87 19.89±1.57** 20.02±1.70** 20.28±1.77** 20.78±1.48** 21.51±1.27** 500 21.01±0.83 19.90±0.86** 20.31±0.99** 20.53±0.96** 20.81±0.85** 21.51±0.85** 625 20.79±0.70 19.59±0.76** 19.96±1.02** 20.33±1.09** 20.71±0.96** 21.16±0.88** 781 21.09±0.77 19.26±1.11** 19.70±1.10** 20.13±1.15** 20.50±1.14** 21.34±1.28** 976 20.77±1.09 18.80±0.42** 19.45±0.21** 20.15±0.35** 20.90±0.07** 21.95±0.07** 水溶出组分 256 21.42±0.53 19.74±0.77** 20.55±0.97** 21.11±1.00* 21.69±0.78* 22.78±0.79 320 21.14±0.65 19.63±1.11** 20.05±1.10** 20.47±1.13** 20.85±1.23** 21.52±1.27** 400 21.15±0.69 19.97±0.51** 20.13±0.31** 20.77±0.32** 21.17±0.15** 21.93±0.67** 500 20.91±1.06 19.95±0.78** 20.15±0.50** − − − 625 21.33±0.60 17.73±1.01** − − − − 乙醇洗脱组分 70 20.97±0.84 22.14±0.63* 23.12±1.18** 24.16±0.95** 25.74±0.93** 27.58±0.96** 88 20.73±0.66 18.95±0.63** 19.33±0.69** 19.97±0.94** 20.00±0.57** 20.44±0.46** 109 20.95±0.62 18.62±0.77** 19.15±0.85** 19.80±1.29** 20.63±2.23* 21.67±3.65 137 20.70±0.86 19.05±0.78** 19.75±0.64** 20.10±0.42** 21.40±0.71* 22.85±0.50 171 20.73±0.77 − − − − − 对照组 0 20.94±0.63 21.45±0.62 21.77±0.63 22.02±0.62 22.57±0.59 23.16±0.51 注：与对照组比较，*：差异显著，P<0.05，**：差异极显著，P<0.01；“−”表示小鼠已死亡，无法测得体重。 2.2.2 小鼠急性毒性试验症状观察
急性毒性试验不应只关注小鼠死亡数据，也应重视动物的毒性反应[27]，通过中毒的表现分析死因，通过监测过程获得更多有关毒理学的信息，以便有针对性地为找到毒性靶组织提供参考。因此本试验还考察了小鼠急性毒性症状谱，包括各症状的发生时间和发生频率。如图3，经解剖发现部分死亡小鼠胃肠有明显的出血点，推测西印度醋栗枝叶提取物对胃肠可能有刺激作用。存活小鼠基本在3 d时身体状态得到缓解，毒性反应消失，后期存活小鼠无异常现象。说明西印度醋栗枝叶不同组分提取物对小鼠有急性毒性。各组分急性症状谱见表2。5个组分急性毒性试验小鼠死亡情况见图4。
表 2 西印度醋栗枝叶各组分小鼠急性毒性症状谱Table 2. Acute toxicity symptom profile of each fraction of P. acidus in mice组分 症状 项目 药物5组 药物4组 药物3组 药物2组 药物1组 石油醚组分 蹿跳 发生率（%） 50 40 20 10 − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 − 反应迟钝 发生率（%） 80 70 50 10 − 发生时间（h） 12~24 12~24 12~24 12~24 − 乙酸乙酯组分 抽搐 发生率（%） 30 20 − − − 发生时间（h） 12~24 12~24 − − − 眼睛分泌粘液 发生率（%） 20 − − − − 发生时间（h） 12~24 − − − − 正丁醇组分 蹿跳 发生率（%） 60 30 10 − − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 − − 反应迟钝 发生率（%） 50 40 20 − − 发生时间（h） 12~24 12~24 12~24 − − 水溶出组分 蹿跳 发生率（%） 50 30 30 10 − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 − 呼吸急促 发生率（%） 80 40 − − − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 − − − 反应迟钝 发生率（%） 60 40 20 − − 发生时间（h） 12~24 12~24 12~24 − − 乙醇洗脱组分 怠动 发生率（%） 100 90 80 30 20 发生时间（h） 0.2~2.0 0.20~2.0 0.6~2.0 0.6~3.0 1.0~3.0 瞳孔缩小 发生率（%） 100 90 80 30 − 发生时间（h） 0.20~0.25 0.5~3.0 0.5~3.0 0.5~3.0 − 角膜浑浊 发生率（%） 90 90 80 − − 发生时间（h） 0.2~3.0 0.2~3.0 0.2~3.0 − − 反应迟钝 发生率（%） 100 90 80 40 − 发生时间（h） 0.2~3.0 0.2~3.0 0.2~3.0 0.2~3.0 − 注：“−”表示小鼠无以上症状，药物 1~5 组代表各组分给药剂量由低到高。 ![]()
图 4 西印度醋栗枝叶各组分LD50 测定死亡-时间曲线注：药物1~5组代表各组分给药剂量由低到高。Figure 4. Death-time curve for LD50 determination of each fraction of P. acidus2.2.3 各组分LD50测定结果
采用经典急性毒性试验方法，以不同的给药剂量分别对西印度醋栗枝叶的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水溶出和醇洗脱等各组分对小鼠的急性毒性进行了研究。由表3数据可知，不同极性部分毒性大小为：乙醇洗脱组分>水溶出组分>石油醚组分>乙酸乙酯组分>正丁醇组分。小鼠死亡率与剂量浓度大小呈相关性。用Bliss法计算西印度醋栗枝叶各组分小鼠腹腔注射的LD50见表3。
表 3 西印度醋栗枝叶不同组分LD50比较Table 3. LD50 comparison of different fraction of P. acidus组别 剂量
（mg/kg）动物数
（只）死亡数
（只）死亡百分
率（%）LD50及95%可信
限（mg/kg）石油醚组分 400 10 0 0 614.899
（521.806~716.199）500 10 4 40 625 10 6 60 781 10 7 70 976 10 9 90 乙酸乙酯组分 400 10 0 0 652.061
（580.414~737.162）500 10 2 20 625 10 5 50 781 10 7 70 976 10 10 100 正丁醇组分 400 10 0 0 767.755
（661.36~981.621）500 10 2 20 625 10 3 30 781 10 4 40 976 10 8 80 水溶出组分 256 10 2 20 368.516
（309.15~430.148）320 10 4 40 400 10 7 70 500 10 9 90 625 10 9 90 乙醇洗脱组分 70 10 1 10 103.887
（89.718~119.486）88 10 4 40 109 10 4 40 137 10 8 80 171 10 10 100 2.3 西印度醋栗枝叶全组分的MTD试验结果
由于全组分浓度限值，预实验无法测出使得小鼠全部死亡的LD100值，因此无法测出LD50，所以测定最大耐受量来评价全组分的安全性。给小鼠灌胃西印度醋栗枝叶全组分悬浮液（2.5 g/mL，即流程图中全组分浸膏部分）。个别小鼠给药不久出现蹿跳，1 h时观察无强烈毒性反应，略微怠动，给药1 d后发现小鼠略微有扎堆现象，给药3 d后恢复。用药后14 d内毛发颜色、精神状态和粪便都正常，但药物组小鼠的体重增长较慢，明显低于空白组，7 d后体重增长趋于正常，与空白组增长趋于一致，1~6 d药物组与空白组体重变化组间差异极显著（P<0.01），最终小鼠无死亡或强烈毒性反应。可能由于灌胃使小鼠胃里内容物增多食欲减退，而后逐渐适应灌胃及药物浓度。综上所述，西印度醋栗枝叶全组分MTD值为2.0 g/kg，根据急性毒性分级标准，属于低毒级。西印度醋栗枝叶全组分小鼠急毒MTD试验体重自身变化量见图5。
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图 5 西印度醋栗枝叶全组分小鼠急毒MTD试验体重自身变化量注：与空白组比较，*：差异显著，P<0.05，**：差异极显著，P<0.01；图6同。Figure 5. Body weight self-change in the all-component of P. acidus mouse acute MTD test2.4 西印度醋栗枝叶全组分的亚急性毒性试验结果
2.4.1 全组分对小鼠日常状态和体重增长的影响
为探究西印度醋栗枝叶较低剂量（250 mg/kg）下是否有亚急性毒性，进行为期20 d的灌胃实验。由图6可知，给药第2 d空白组和药物组小鼠体重均有小幅度下降，后空白组小鼠又恢复正常并呈上升趋势。小鼠体重轻微减小，没有超过体重10%属于正常范围，背毛较顺，行动正常，无死亡。空白组小鼠体重下降的原因可能是由于初次灌胃对小鼠产生一定的刺激，从而导致小鼠第2 d采食量较低，第4 d开始小鼠逐渐适应灌胃过程，体重有所上升。药物组与空白组组间差异性极显著（P<0.01）。Chongsa等[13]的研究也证实西印度醋栗枝叶在安全剂量下灌胃大鼠，可观察到大鼠体重减轻，但进食量未减少，最终可导致中年大鼠内脏和皮下脂肪以及血清、肝脏脂质的减少。说明西印度醋栗枝叶提取物实验剂量下食用较为安全，可能是开发减肥食品或保健品的一种有效材料。
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图 6 亚急性毒性试验小鼠体重自身变化率Figure 6. Self-change rate in body weight of mice in sub-acute toxicity test2.4.2 全组分对小鼠脏器系数的影响
由表4可知，实验结束对小鼠进行解剖，将各脏器称重。药物组（250 mg/kg）小鼠的脏器比与空白组小鼠相比无显著性差异（P>0.05），表明西印度醋栗枝叶全组分对小鼠的脏器无显著影响。结合2.4.1可见，西印度醋栗枝叶在250 mg/kg低剂量下无亚急性毒性。
表 4 西印度醋栗枝叶全组分对小鼠脏/体比值的影响Table 4. Effects of all-component of P. acidus on liver/body weight ratio of mice性别 组别 肝/体比值（%） 脾/体比值（%） 肾/体比值（%） 雄 药物组 4.91±0.18 0.34±0.05 0.86±0.04 空白组 4.77±0.11 0.33±0.05 0.84±0.03 雌 药物组 4.88±0.21 0.32±0.03 0.85±0.03 空白组 4.76±0.09 0.32±0.05 0.84±0.04 注：相同性别组间比较，同列数据无肩标表示差异不显著（P>0.05）。 2.4.3 组织病理学检查结果
试验结束后剖检小鼠，经肉眼观察主要从脏器的颜色、形态、结构、体积及质地观察，均未见明显的异常（图7）。采集西印度醋栗枝叶药物组（250 mg/kg）和空白组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏组织进行组织病理学检查[28-30]。a. 肝脏：药物组肝组织中见有片状或散在肝细胞坏死（五角星），表现为肝细胞胞核固缩、核消失，胞浆嗜酸性增强。空白组肝组织胞浆嗜酸性增强，程度较药物组轻。未见其他明显病变；b. 肾脏：药物组皮质和髓质结构清楚，见皮质区少量肾小管上皮细胞轻微空泡变性，间质轻微充血。空白组皮质、髓质结构清晰，肾单位形态结构正常。两者间未见明显差异；c. 脾脏：药物组与空白组的白髓、红髓结构清楚，未见淤血及纤维组织增生，均未见明显病变。药物组脾脏结构看起来比空白组的松散，跟制片出现裂痕有关。由此可知，在实验剂量内，西印度醋栗提取物灌胃小鼠，未见有明显毒性意义的病理变化，但提示更高剂量或长期使用下需注意肝毒性。
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图 7 口服剂量组和对照组小鼠的肝、肾、脾组织HE染色病理学观察结果注：A：药物组肝脏；B：空白组肝脏；C：药物组肾脏；D：空白组肾脏；E：药物组脾脏；F：空白组脾脏（HE染色，100倍）。Figure 7. Pathological observation results of HE staining of liver, kidney and spleen tissue of mice in oral dose group and control group3. 结论
本实验通过比较西印度醋栗枝叶急性毒性数据发现，不同极性部分毒性大小为：乙醇洗脱组分>水溶出组分>石油醚组分>乙酸乙酯组分>正丁醇组分>全组分。经观察亚急性毒性实验中元江引种西印度醋栗枝叶全组分的小鼠毒性反应，发现全组分低剂量（250 mg/kg/d）下安全，无亚急性毒性，这符合民间常用药理用途。但是高剂量下有低毒，高于2.0 g/kg/d（相当于干燥枝叶8.6 g/kg）时有毒性危害。同时不同组分萃取物均有一定的α-葡萄萄糖苷酶抑制能力，具有体外抗糖尿病活性，因此西印度醋栗枝叶具有抗糖尿病药物开发潜力。后续拟在体外抗糖活性测定的基础上，进一步通过建立糖尿病小鼠模型，测定小鼠生理生化指标评价其体内降血糖能力。这一结论可为初步估计人群允许接触水平提供有价值的信息，为西印度醋栗枝叶的食用和药用开发提供参考。但是否可以根据毒性特征来分离出毒性物质以及毒性机制尚待探究，以期为开发安全高效药物提供实验和理论依据。
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图 1 西印度醋栗不同极性提取物制备流程图
Figure 1. Preparation flowing chart of different polar extracts of Phyllanthus acidus
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图 2 西印度醋栗枝叶各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性
Figure 2. α-Glucosidase inhibition ability of different fractions from branch and leaf extracts of P. acidus
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图 4 西印度醋栗枝叶各组分LD50 测定死亡-时间曲线
注：药物1~5组代表各组分给药剂量由低到高。
Figure 4. Death-time curve for LD50 determination of each fraction of P. acidus
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图 5 西印度醋栗枝叶全组分小鼠急毒MTD试验体重自身变化量
注：与空白组比较，*：差异显著，P<0.05，**：差异极显著，P<0.01；图6同。
Figure 5. Body weight self-change in the all-component of P. acidus mouse acute MTD test
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图 6 亚急性毒性试验小鼠体重自身变化率
Figure 6. Self-change rate in body weight of mice in sub-acute toxicity test
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图 7 口服剂量组和对照组小鼠的肝、肾、脾组织HE染色病理学观察结果
注：A：药物组肝脏；B：空白组肝脏；C：药物组肾脏；D：空白组肾脏；E：药物组脾脏；F：空白组脾脏（HE染色，100倍）。
Figure 7. Pathological observation results of HE staining of liver, kidney and spleen tissue of mice in oral dose group and control group
表 1 急性毒性试验中小鼠体重变化情况
Table 1 Changes of body weight of mice in acute toxicity test
组别 剂量（mg/kg） 始重（g） 第3 d体重（g） 第5 d体重（g） 第7 d体重（g） 第10 d体重（g） 第14 d体重（g） 石油醚组分 400 21.33±0.60 20.04±1.03** 20.41±0.96** 20.90±0.96** 21.16±0.92** 21.83±0.81** 500 20.87±0.79 19.23±0.97** 19.37±1.01** 19.87±1.15** 20.37±1.11** 20.72±1.05** 625 20.91±1.06 19.53±0.86** 19.78±0.65** 20.18±0.93** 20.68±0.71** 21.13±0.55** 781 21.15±0.69 18.73±0.32** 19.37±0.31** 19.70±0.36** 19.97±0.40** 20.33±0.55** 976 20.66±0.89 − − − − − 乙酸乙酯组分 400 20.96±0.86 19.89±1.57* 20.02±1.70* 20.28±1.77** 20.78±1.48** 21.51±1.27** 500 20.73±1.08 19.64±1.05** 20.03±1.04** 20.60±0.69** 21.21±0.68** 22.10±0.59** 625 20.81±0.77 18.96±0.78** 20.20±0.84** 20.76±0.78* 21.30±0.69** 22.08±0.60** 781 20.64±0.83 19.30±0.44** 19.87±0.25** 20.30±0.17** 20.97±0.25** 22.13±0.32** 976 21.12±0.64 − − − − − 正丁醇组分 400 21.01±0.87 19.89±1.57** 20.02±1.70** 20.28±1.77** 20.78±1.48** 21.51±1.27** 500 21.01±0.83 19.90±0.86** 20.31±0.99** 20.53±0.96** 20.81±0.85** 21.51±0.85** 625 20.79±0.70 19.59±0.76** 19.96±1.02** 20.33±1.09** 20.71±0.96** 21.16±0.88** 781 21.09±0.77 19.26±1.11** 19.70±1.10** 20.13±1.15** 20.50±1.14** 21.34±1.28** 976 20.77±1.09 18.80±0.42** 19.45±0.21** 20.15±0.35** 20.90±0.07** 21.95±0.07** 水溶出组分 256 21.42±0.53 19.74±0.77** 20.55±0.97** 21.11±1.00* 21.69±0.78* 22.78±0.79 320 21.14±0.65 19.63±1.11** 20.05±1.10** 20.47±1.13** 20.85±1.23** 21.52±1.27** 400 21.15±0.69 19.97±0.51** 20.13±0.31** 20.77±0.32** 21.17±0.15** 21.93±0.67** 500 20.91±1.06 19.95±0.78** 20.15±0.50** − − − 625 21.33±0.60 17.73±1.01** − − − − 乙醇洗脱组分 70 20.97±0.84 22.14±0.63* 23.12±1.18** 24.16±0.95** 25.74±0.93** 27.58±0.96** 88 20.73±0.66 18.95±0.63** 19.33±0.69** 19.97±0.94** 20.00±0.57** 20.44±0.46** 109 20.95±0.62 18.62±0.77** 19.15±0.85** 19.80±1.29** 20.63±2.23* 21.67±3.65 137 20.70±0.86 19.05±0.78** 19.75±0.64** 20.10±0.42** 21.40±0.71* 22.85±0.50 171 20.73±0.77 − − − − − 对照组 0 20.94±0.63 21.45±0.62 21.77±0.63 22.02±0.62 22.57±0.59 23.16±0.51 注：与对照组比较，*：差异显著，P<0.05，**：差异极显著，P<0.01；“−”表示小鼠已死亡，无法测得体重。 
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表 2 西印度醋栗枝叶各组分小鼠急性毒性症状谱
Table 2 Acute toxicity symptom profile of each fraction of P. acidus in mice
组分 症状 项目 药物5组 药物4组 药物3组 药物2组 药物1组 石油醚组分 蹿跳 发生率（%） 50 40 20 10 − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 − 反应迟钝 发生率（%） 80 70 50 10 − 发生时间（h） 12~24 12~24 12~24 12~24 − 乙酸乙酯组分 抽搐 发生率（%） 30 20 − − − 发生时间（h） 12~24 12~24 − − − 眼睛分泌粘液 发生率（%） 20 − − − − 发生时间（h） 12~24 − − − − 正丁醇组分 蹿跳 发生率（%） 60 30 10 − − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 − − 反应迟钝 发生率（%） 50 40 20 − − 发生时间（h） 12~24 12~24 12~24 − − 水溶出组分 蹿跳 发生率（%） 50 30 30 10 − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 0.2~1.0 − 呼吸急促 发生率（%） 80 40 − − − 发生时间（h） 0.2~1.0 0.2~1.0 − − − 反应迟钝 发生率（%） 60 40 20 − − 发生时间（h） 12~24 12~24 12~24 − − 乙醇洗脱组分 怠动 发生率（%） 100 90 80 30 20 发生时间（h） 0.2~2.0 0.20~2.0 0.6~2.0 0.6~3.0 1.0~3.0 瞳孔缩小 发生率（%） 100 90 80 30 − 发生时间（h） 0.20~0.25 0.5~3.0 0.5~3.0 0.5~3.0 − 角膜浑浊 发生率（%） 90 90 80 − − 发生时间（h） 0.2~3.0 0.2~3.0 0.2~3.0 − − 反应迟钝 发生率（%） 100 90 80 40 − 发生时间（h） 0.2~3.0 0.2~3.0 0.2~3.0 0.2~3.0 − 注：“−”表示小鼠无以上症状，药物 1~5 组代表各组分给药剂量由低到高。
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表 3 西印度醋栗枝叶不同组分LD50比较
Table 3 LD50 comparison of different fraction of P. acidus
组别 剂量
（mg/kg）动物数
（只）死亡数
（只）死亡百分
率（%）LD50及95%可信
限（mg/kg）石油醚组分 400 10 0 0 614.899
（521.806~716.199）500 10 4 40 625 10 6 60 781 10 7 70 976 10 9 90 乙酸乙酯组分 400 10 0 0 652.061
（580.414~737.162）500 10 2 20 625 10 5 50 781 10 7 70 976 10 10 100 正丁醇组分 400 10 0 0 767.755
（661.36~981.621）500 10 2 20 625 10 3 30 781 10 4 40 976 10 8 80 水溶出组分 256 10 2 20 368.516
（309.15~430.148）320 10 4 40 400 10 7 70 500 10 9 90 625 10 9 90 乙醇洗脱组分 70 10 1 10 103.887
（89.718~119.486）88 10 4 40 109 10 4 40 137 10 8 80 171 10 10 100
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表 4 西印度醋栗枝叶全组分对小鼠脏/体比值的影响
Table 4 Effects of all-component of P. acidus on liver/body weight ratio of mice
性别 组别 肝/体比值（%） 脾/体比值（%） 肾/体比值（%） 雄 药物组 4.91±0.18 0.34±0.05 0.86±0.04 空白组 4.77±0.11 0.33±0.05 0.84±0.03 雌 药物组 4.88±0.21 0.32±0.03 0.85±0.03 空白组 4.76±0.09 0.32±0.05 0.84±0.04 注：相同性别组间比较，同列数据无肩标表示差异不显著（P>0.05）。
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