Simultaneous Determination of Vitamins A, D and E in Children's Formula Milk Powder by Combining Online Solid Phase Extraction and Two-Dimensional Liquid Chromatography
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摘要: 建立在线固相萃取（SPE）-二维液相色谱法同时测定儿童配方奶粉中脂溶性维生素A、D2、D3和α-、β-、γ-、δ-维生素E含量的方法。样品经皂化后直接进样，以聚合物为填料的PLRP-S色谱柱为在线固相萃取柱净化皂化液，采用SPE泵反向洗脱目标组分，并通过引入在线稀释将目标组分聚焦在第一维色谱柱柱头。以NuovaSilTM PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm）为第一维色谱柱，甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，分离维生素A和E的4 种异构体。以ChromCore PAH（4.6 mm×150 mm，3 μm）为第二维色谱柱，甲醇-乙腈（90:10，v/v)为流动相，分离维生素D2和D3。结果表明，维生素A在5.0~500.0 ng/mL、维生素D在1.0～100.0 ng/mL、维生素E在50.0～5000.0 ng/mL线性范围内线性良好，相关系数均大于0.9999。维生素A、D2、D3和α-、β-、γ-、δ-维生素E的定量限分别为5.11、1.22、1.25、83.82、57.27、56.61、54.82 µg/100 g。加标回收率为91.20％~104.47％，相对标准偏差为0.94%~3.34%。结果表明本文建立的在线固相萃取-二维液相色谱系统，前处理简单、自动化程度高、分析效率高、准确度高、重复性好，适用于儿童配方奶粉中维生素A、D、E的含量测定。Abstract: A method was developed for the simultaneous determination of fat-soluble vitamins A, D2, D3 and α-, β-, γ-, δ-vitamin E in children's formula milk powder by combining online solid phase extraction (SPE) and two-dimensional liquid chromatography. The saponified samples were directly injected into the constructed system and purified by using the polymeric-based PLRP-S column as the SPE column. Then the target analytes were eluted in back-flush mode from the SPE column by SPE pump and refocused on the head of the first-dimensional column by using online dilution. Vitamins A and four E homologues were separated on a NuovaSilTM PFP column (4.6 mm×150 mm, 3 μm) as the first-dimensional column using a mobile phase consisting of methanol and 0.1% formic acid in water by gradient elution, and vitamins D2 and D3 were separated on a ChromCore PAH column (4.6 mm×150 mm, 3 μm) as the second-dimensional column using a mobile phase consisting of methanol and acetonitrile (90:10, v/v). The results showed good linearity in the range of 5.0~500.0 ng/mL for vitamin A, 1.0~100.0 ng/mL for vitamin D and 50.0~5000.0 ng/mL for vitamin E, and the correlation coefficients were all better than 0.9999. The limits of quantification for vitamins A, D2, D3 and α-, β-, γ-, δ-vitamins E were 5.11, 1.22, 1.25, 83.82, 57.27, 56.61, 54.82 µg/100 g, respectively. The spiked recoveries were 91.20%~104.47%, and the relative standard deviations were 0.94%~3.34%. The results show that the method established in this paper has the advantages of simple pretreatment, high automation, high analytical efficiency, high accuracy and good reproducibility, and is suitable for the determination of vitamins A, D and E in children's formula milk powder.
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脂溶性维生素A、D、E（VA、VD、VE）是儿童生长发育中不可缺少的微量营养物质，可以保持儿童正常的视觉功能、促进儿童骨骼生长、提高免疫力等[1-4]。儿童配方奶粉是儿童补充维生素的重要途径，准确测定其中的维生素含量对于保证儿童维生素的摄入量具有重要意义。
色谱法是脂溶性VA、VD和VE最常用的检测方法，目前主要有高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法[5-10]。此类分析方法的样品前处理通常包括皂化和有机溶剂液液萃取，并且在VD的分析过程中还需要采用固相萃取或正相色谱的净化过程等[9, 11-14]，操作繁琐、费时、重复性差。近年来，随着二维液相色谱的发展和普及，用于检测VA、VD和VE的文献也时有报道[15-20]。二维液相色谱的应用可显著缩减VD的样品前处理过程，实现VA、VD和VE的同时检测。但是，由于食品基质成分复杂，样品皂化后仍需萃取、洗涤、浓缩和复溶等多步骤处理，依然存在耗时、费力、重复性差的问题，二维液相色谱串联在线固相萃取可以将前处理皂化液直接进样，省去了液液萃取等复杂的前处理过程[21]。但是由于β-和γ-VE的分离难度大，目前，在线固相萃取-二维液相色谱技术基本只能同时测定VA、VD和α-、γ-、δ-VE，未能测定β-VE。研究表明，VE的四种异构体均具有重要的生物活性，在人体中具有重要的作用[22]，因此分离VE的四种异构体也非常重要。
本研究采用在线固相萃取-二维液相色谱法同时测定儿童配方奶粉中的VA、VD2、VD3和α-、β-、γ-、δ-VE，利用在线固相萃取简化样品前处理过程，提高检测灵敏度，通过在线稀释减弱大体积进样引起的溶剂效应。同时对SPE泵洗脱速度、在线稀释速度、第一维色谱分离条件等进行优化。样品经皂化后可直接进样分析，一次进样即可同时完成脂溶性VA、VD2、VD3和α-、β-、γ-、δ-VE的快速检测分析，显著提高了检测效率，具有简单快速、安全、操作简单等优点，为儿童配方奶粉中VA、VD和VE的测定提供了可实施方法和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
VA （C20H30O，CAS号：68-26-8，纯度99.88%）、α-VE（C29H50O2，CAS号：10191-41-0）、β-VE（C28H48O2，CAS号：148-03-8 ）、γ-VE（C28H48O2，CAS号：54-28-4 ）、δ-VE（C27H46O2，CAS号：119-13-1） 分析标准品，TM-standard；VD2（C28H44O，CAS号：50-14-6）、VD3 （C27H44O，CAS号：67-97-0 ） 纯度99.9%，中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、乙醇 色谱纯，美国TEDIA公司；甲酸 色谱纯，德国默克公司；抗坏血酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、氢氧化钾 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；儿童配方奶粉 当地母婴店。
LC5190高效液相色谱系统（配有2个四元泵、1个二元泵、2个紫外检测器、1个柱温箱内置2个两位六通阀、1个自动进样器、1套色谱工作站） 浙江福立分析仪器股份有限公司；第一维分析柱NuovaSilTM PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm） 武汉谱立科技有限公司；第二维分析柱ChromCore PAH（4.6 mm×150 mm，3 μm） 纳谱分析技术（苏州）有限公司；捕集柱Sunniest C18（4.0 mm×10 mm，5 μm） 日本ChromnaNik Technology公司；在线固相萃取小柱PLRP-S（4.6 mm×12.5 mm，15~20 μm） 安捷伦科技有限公司；SOP电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Milli.Q Reference纯水系统 法国默克公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的配制
VA标准储备液（0.5 mg/mL）：准确称取25.0 mg VA标准品，用无水乙醇溶解后，转移至50 mL棕色容量瓶中并用无水乙醇定容。VE混合标准储备液（1.0 mg/mL）：分别准确称取50.0 mg α-、β-、γ-、δ-VE标准品，用无水乙醇溶解后，转移至50 mL棕色容量瓶中并用无水乙醇定容。VD混合标准储备液（0.1 mg/mL）：分别准确称取10.0 mg VD2、VD3标准品，用无水乙醇溶解后，转移至100 mL棕色容量瓶中并用无水乙醇定容。各种标准储备液避光保存于-20 ℃下，有效期为1个月。临用前将溶液回温至20 ℃，并按照GB 5009.86-2016附录2方法进行浓度校正。根据校准后溶液浓度配制混合标准液工作曲线，其中VA浓度为5、10、25、50、100、250、500 ng/mL，VD2、VD3浓度为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL，α-、β-、γ-、δ-VE浓度为50、100、250、500、1000、2500、5000 ng/mL。
1.2.2 样品的前处理
样品溶液制备参照GB 5009.82-2016第一法样品前处理中的皂化方法。称取5.0 g儿童配方奶粉置于棕色平底烧瓶中，加入20 mL温水将其溶解，混匀；再加入1.0 g抗坏血酸和1.0 g BHT，混匀；然后加入30 mL乙醇和20 mL氢氧化钾溶液（50 g/100 g），混匀后于80 ℃的恒温水浴中振荡皂化30 min；皂化后冷却至室温，转移至100 mL棕色容量瓶中并用乙醇定容，摇匀后，皂化液用0.22 μm尼龙过滤膜过滤，待测。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：PLRP-S（4.6 mm×12.5 mm，15~20 μm）为皂化液净化柱；NuovaSilTM PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm）为第一维分析柱；ChromCore PAH（4.6 mm×150 mm，3 μm）为第二维分析柱；Sunniest C18（4.0 mm×10 mm，5 μm）为捕集柱。
进样量：200 μL。柱温：30 ℃。检测波长：第一维检测器：0~26.5 min：325 nm，26.5~28 min：264 nm，28~45 min：294 nm；第二维检测器：264 nm。流速：SPE泵：0.8 mL/min；第一维泵：0~11 min：0.4 mL/min，11~35 min：1.0 mL/min；第二维泵：0.43 mL/min。流动相：SPE泵：A：甲醇，B：乙腈，C：纯水；第一维泵：A：甲醇，B：0.1%甲酸水溶液；第二维泵：A：甲醇，B：乙腈，洗脱程序见表1。阀切时间：阀1：0 min（1−6），8.5 min （1−2），11 min（1−6）；阀2：0 min（1−6）；27.3 min（1−2）；27.9 min（1−6）。阀切换过程及说明见表2。
表 1 三泵梯度洗脱程序Table 1. Gradient programs of 3 pumpsSPE泵 第一维泵 第二维泵 时间
（min）A
（%）B
（%）C
（%）时间
（min）A
（%）B
（%）时间
（min）A
（%）B
（%）0 80 0 20 0 20 80 0 90 10 5 80 0 20 11 20 80 45 90 10 5.1 0 90 10 20 87 13 20 0 90 10 28 95 5 20.1 0 100 0 35 95 5 35 0 100 0 35.1 20 80 35.1 80 0 20 45 20 80 45 80 0 20 表 2 阀切换过程及说明Table 2. Switching instructions for two-position six-way valve步骤 阀1切换位置 阀2切换位置 说明 1 1-6 1-6 SPE泵上样，目标物被保留，样品基质和强碱液被淋洗到废液中。 2 1-2 1-6 SPE泵反向冲洗转移目标物至第一维分析柱，同时第一维泵采用高水相进行在线稀释，使目标物在第一维色谱柱柱头聚焦。 3 1-6 1-6 第一维泵分离分析VA和4种VE，并完成VD的净化，SPE泵对SPE柱进行清洗和平衡。 4 1-6 1-2 将VD馏分切割至捕集柱，阀切换的起始时间为VD色谱峰起点出峰时间减去0.1 min，阀切换的结束时间为VD色谱峰终点出峰时间加上0.1 min。 5 1-6 1-6 第二维泵分离分析VD2 和VD3。 1.2.4 定性及定量方法
利用第一维色谱图中对应的保留时间对VA和4种VE异构体进行定性，利用第二维色谱图中对应的保留时间对VD2和VD3进行定性。按照“1.2.1”项配制混合标准液工作曲线，再按“1.2.3”项色谱条件进行分析，以标准品浓度x（ng/mL）为横坐标，各组分的峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，采用外标法进行定量。
1.3 数据处理
采用福立LC5s色谱工作站进行数据采集及色谱图分析，利用Excel软件进行其他数据分析。所有试验均重复3次，试验结果以平均值±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 在线固相萃取-二维液相色谱系统的构建
二维液相色谱系统可以实现脂溶性VA、VD和VE的同时检测[15]，在线固相萃取可以代替液液萃取等复杂的前处理过程[21]，因此，结合两者各自的优势，构建了在线SPE-二维液相色谱系统。皂化液直接进样后经在线SPE柱净化，目标物被吸附，样品基质和强碱溶液进入废液管路。此时，系统处于上样阶段，第一维和第二维系统处于平衡状态。切换六通阀1，SPE 泵反向冲洗SPE柱转移目标物至第一维分析柱，第一维泵采用高水相进行在线稀释，目标物在第一维色谱柱柱头聚焦。再次切换六通阀1，SPE泵冲洗SPE柱，第一维泵在第一维分析柱上分析VA和4种VE，并完成VD的净化。通过切换六通阀2，将第一维色谱分离中的VD流出物切割到VD捕集柱上，再将捕集柱中的VD转移到第二维分离系统进行VD2和VD3的分离分析。在线SPE-二维液相色谱系统流程图、标液和样品的第一维和第二维分离色谱图见图1～图5。
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图 1 在线SPE-二维液相色谱系统流程图Figure 1. The scheme of online SPE two-dimensional liquid chromatography![]()
图 2 混合标准溶液的第一维色谱图注：λ=325 nm, 294 nm；VA：500 ng/mL，VE：5000 ng/mL。Figure 2. One-dimensional chromatogram of mixed standard solution![]()
图 3 混合标准溶液的第二维色谱图注：λ=264 nm；VD：20 ng/mL。Figure 3. Two-dimensional chromatogram of mixed standard solution![]()
图 4 儿童配方奶粉样品的第一维色谱图注：λ=325 nm, 294 nm。Figure 4. One-dimensional chromatogram of children's formula milk powder![]()
图 5 儿童配方奶粉样品的第二维色谱图注：λ=264 nm。Figure 5. Two-dimensional chromatogram of children's formula milk powder在线SPE通常采用分析泵的直/反冲洗模式进行样品制备，但是，在线SPE进样体积大，会导致峰展宽和峰变形，尤其是样品溶液中含有高比例的有机溶剂[23]。为了减弱溶剂效应并快速转移目标物，加入了在线稀释以保证第一维色谱柱的分离性能。不同于传统的在线SPE设计，上样泵不仅负责加载样品溶液和清洗SPE柱，还用于洗脱保留在SPE柱上的目标分析物。同时，含有“强溶剂”的流出物被第一维泵经三通输送的高水相稀释。因此，目标组分重新聚焦在第一维色谱柱的柱头，以确保其色谱性能不受溶剂影响。从图1（系统流程图）可以看出，在线稀释显著改善了色谱峰形及其分离性能。
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 在线SPE色谱条件和在线稀释条件的优化
本实验采用在线SPE柱净化皂化液，但是皂化液的碱性极强（pH>12），传统的以二氧化硅为基质的净化柱在高pH条件下会破坏硅胶的Si-O-Si结构，因此无法在强碱性条件下使用。而PLRP-S净化柱以刚性聚合物（苯乙烯/二乙烯苯）为基质，不受酸碱溶液的影响，同时PLRP-S净化柱对VA、VD和VE均有保留作用，可以将皂化液中的VA、VD和VE完全吸附到PLRP-S柱上[24-29]，因此本实验采用PLRP-S柱作为皂化液净化柱。强碱皂化液经过PLRP-S时目标物被保留，碱性溶液和极性样品基质被80%甲醇水冲洗到废液管路，而净化柱和仪器系统不受任何破坏。
为了快速、有效地将PLRP-S柱上吸附的VA、VD和VE洗脱下来，选择90%乙腈水作为洗脱溶剂。洗脱的速度越快，洗脱时间越短，但是由于VA、VD和VE洗脱过程中洗脱溶剂和在线稀释溶剂一起进入第一维色谱柱，当洗脱的流速太大，会引起第一维色谱柱压力突然升高过大，甚至超过系统压力，对色谱柱造成一定的损伤。因此选择洗脱流速为0.8 mL/min，此时洗脱时间为2.5 min，相比洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱时间为2.0 min，洗脱时间只增加了0.5 min，但是压力明显下降。
在线稀释对于减弱SPE流出物引起的溶剂效应至关重要。一般来说，在线稀释溶剂的水溶液比例越高，稀释效果越好。但是，由于VE的溶解度对在线稀释溶剂的比例比其他目标分析物更敏感，稀释溶剂的水溶液比例太高，可能会使VE的峰面积变小，因此选择在线稀释溶剂为20%甲醇水。在线稀释流速太大，容易引起稀释溶剂和洗脱溶剂混合不完全，流速太小，又会达不到稀释效果，目标组分无法完全聚焦在第一维色谱柱柱头，因此选择在线稀释流速为0.4 mL/min，在线稀释后的最终流动相为60%乙腈、6.7%甲醇、33.3%水，此时既能保证VA、VD和VE在第一维色谱柱柱头聚焦，又能保证VE的溶解度，VE直接进样与通过在线SPE进样的峰面积基本保持一致。
2.2.2 第一维和第二维色谱条件的优化
根据先前的文献报道，通常采用PFP色谱柱来测定植物油、补充剂胶囊和食品中的VE同系物和衍生物[9, 30]。此外，VD2 和 VD3 在 PFP 色谱柱上为合峰，减小了 VD流出物切割到第二维色谱中的时间窗和体积，有利于控制溶剂对第二维分离的影响。因此，选用PFP为第一维色谱柱。在第一维流动相的选择上，对比了甲醇、水，甲醇、0.1%甲酸水溶液，甲醇、0.1%乙酸水溶液和甲醇、0.1%磷酸水溶液，结果发现使用甲醇和水作为流动相进行梯度洗脱时，α-、β-和γ-VE色谱峰均出现不同程度的峰变形，导致α-、β-和γ-VE无法准确定量，在水相中加入0.1%甲酸、0.1%乙酸或0.1%磷酸，使用甲醇和0.1%甲酸水溶液、甲醇和0.1%乙酸水溶液或甲醇和0.1%磷酸水溶液进行相同条件的梯度洗脱，α-、β-和γ-VE色谱峰峰形均正常，且β-和γ-VE分离度在1.5以上，其中甲醇和0.1%甲酸水溶液作为流动相，α-和δ-VE的比值最大。因此，第一维分离的流动相最终确定为甲醇和0.1%甲酸水溶液。VD2和VD3之间的基线分离有利于允许两种化合物互为内标，根据文献报道，多环芳烃（PAH）专用柱可以实现VD2和VD3的基线分离[17]。因此，本试验选用ChromCore PAH作为第二维色谱柱分离VD，VD2和VD3分离度在2以上。
2.3 方法学验证
2.3.1 线性范围、定量限考察
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到线性方程、线性范围和相关系数。在空白样（儿童乳清蛋白粉）中进行低浓度加标试验，加标样按照“1.2”项的实验方法进行测定，直到目标化合物浓度添加量至信噪比为3（检出限）和10（定量限）。结果如表3所示，VA在5.0～500.0 ng/mL线性范围内，VD2和VD3在1.0～100.0 ng/mL线性范围内，4种VE在50.0～5000.0 ng/mL线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9999。VA、VD2、VD3和α-、β-、γ-、δ-VE的定量限分别为5.11、1.22、1.25、83.82、57.27、56.61、54.82 µg/100 g，该定量限低于GB 5009.82.2016的方法一、方法四的定量限（VA：30 µg/100 g，VD：2 µg/100 g，VE：120 µg/100 g），能够满足儿童配方奶粉的检测要求。
表 3 VA、VD和VE的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 3. Regression equations, linear ranges, correlation coefficient, LODs and LOQs of VA, VD and VE组分名 回归方程 线性范围（ng/mL） 线性相关系数 方法检出限（µg/100 g） 方法定量限（µg/100 g） VA y=0.0007x+0.6315 5.0～500.0 0.99998 1.53 5.11 VD2 y=0.0009x+0.0099 1.0～100.0 0.99996 0.37 1.22 VD3 y=0.0008x+0.2035 1.0～100.0 0.99993 0.38 1.25 α-VE y=0.0229x+55.838 50.0～5000.0 0.99993 25.15 83.82 β-VE y=0.0139x+33.115 50.0～5000.0 0.99993 17.18 57.27 γ-VE y=0.0141x+18.368 50.0～5000.0 0.99995 16.98 56.61 δ-VE y=0.0152x+29.373 50.0～5000.0 0.99991 16.45 54.82 2.3.2 准确度和精密度考察
分别在已知各检测目标物含量的实际样品中进行加标回收实验。其中加标浓度的低点为定量限，中浓度点为VA、VD和VE在儿童配方奶粉中的平均添加量，高浓度点为中浓度点的2倍。每个加标水平测定6次（n=6）。样品的平均加标回收率和相对标准偏差（RSD）见表4。由表4可知，VA加标回收率在94.80%~104.47%之间，RSD为1.13%~1.61%；VD2、VD3的加标回收率在91.20%~96.59%之间，RSD为1.52%~3.34%；4种VE的加标回收率在95.54 %~104.12%之间，RSD为0.94%~2.67%。符合GB/T 27404-2008[31]《实验室质量控制规范 食品理化检测》的技术要求，表明本方法具有良好的准确度和精密度。
表 4 VA、VD和VE加标回收率与精密度（n=6）Table 4. Spiked recoveries and RSD of VA, VD and VE (n=6)组分名 本底值
（μg/100 g）加标量
（μg/100 g）平均值
（μg/100 g）平均加标回
收率（%）RSD
（%）VA 363.48 10 372.96 94.80 1.32 400 752.27 97.20 1.61 800 1199.2 104.47 1.13 VD2 ND 2 1.84 92.10 3.34 10 9.39 93.85 2.41 20 19.18 95.89 2.36 VD3 7.47 2 9.29 91.20 1.65 10 17.01 95.36 2.25 20 26.79 96.59 1.52 α-VE 5250 100 5346.32 96.32 0.94 4000 9239.33 99.73 1.47 8000 13579.36 104.12 1.29 β-VE 240 100 335.54 95.54 2.67 4000 4146.18 97.65 2.15 8000 8154.44 98.93 1.15 γ-VE 2620 100 2717.43 97.43 1.02 4000 6568.64 98.72 1.21 8000 10678.71 100.73 1.42 δ-VE 510 100 607.25 97.25 1.18 4000 4426.02 97.90 2.09 8000 8499.06 99.86 1.53 注：ND表示未检出，表5同。 2.3.3 实际样品检测
分别采用本方法和GB 5009.82.2016（第一法和第四法）对市售的6种品牌儿童配方奶粉中VA、VD和VE的含量进行测定，每个样品取平行样3份，其中VD2均为未检出，其他结果见表5。结果显示，本方法相对国标方法的结果偏差均小于10%。表明采用本方法的结果与国标法检测结果一致性较高，可以应用于实际的样品检测。
表 5 实际样品中VA、VD和VE的测定结果（n=3）Table 5. Determination results of VA, VD and VE in samples (n=3)样品名称 VA
（µg/100 g）VD3
（µg/100 g）α-VE
（mg/100 g）β-VE
（mg/100 g）γ-VE
（mg/100 g）δ-VE
（mg/100 g）圣元优强儿童配方奶粉 本方法 363.48±2.43 7.47±0.26 5.25±0.08 0.24±0.01 2.62±0.03 0.51±0.03 国标 355.59±3.57 7.33±0.42 5.07±0.12 0.23±0.02 2.53±0.05 0.48±0.04 相对偏差（%） 2.19 1.89 3.49 6.45 3.50 6.06 伊利金领冠儿童配方奶粉 本方法 405.67±1.38 6.54±0.07 1.63±0.02 ND 0.78±0.01 0.16±0.01 国标 412.55±3.06 6.69±0.09 1.71±0.03 ND 0.83±0.02 0.17±0.01 相对偏差（%） 1.68 2.27 4.79 6.21 7.81 合生元阿尔法星学龄前儿童配方奶粉 本方法 289.23±0.34 4.78±0.02 1.37±0.01 ND 0.53±0.02 0.11±0.01 国标 283.37±2.16 4.57±0.03 1.32±0.02 ND 0.49±0.02 0.10±0.01 相对偏差（%） 2.05 4.49 3.72 7.84 6.57 爱他美学龄前儿童成长奶粉 本方法 283.48±1.27 4.82±0.03 2.83±0.05 ND 1.02±0.03 0.32±0.02 国标 275.50±1.89 4.65±0.05 2.72±0.05 ND 0.99±0.03 0.31±0.02 相对偏差（%） 2.86 3.59 3.96 3.49 4.47 美赞臣安儿健儿童配方奶粉 本方法 515.42±2.17 6.26±0.12 4.27±0.13 0.13±0.01 1.85±0.06 0.14±0.01 国标 498.49±3.76 6.13±0.13 4.18±0.13 0.12±0.02 1.76±0.07 0.13±0.01 相对偏差（%） 3.34 2.10 2.13 7.17 5.16 5.13 卡洛塔妮儿童配方羊奶粉 本方法 558.63±1.36 8.05±0.21 4.82±0.11 ND 1.65±0.03 0.12±0.01 国标 547.77±3.82 7.68±0.23 4.68±0.12 ND 1.56±0.03 0.11±0.01 相对偏差（%） 1.96 4.70 2.95 5.93 6.90 3. 结论
本文建立了在线固相萃取-二维液相色谱技术同时测定儿童配方奶粉中脂溶性VA、VD2、VD3和α-、β-、γ-、δ-VE的分析方法。实验将在线稀释技术应用于在线固相萃取中，可以减弱大体积进样引起的溶剂效应，使目标分析物在第一维色谱中的分离良好，并通过优化SPE泵洗脱流速、在线稀释流速等在线固相萃取条件有效减小洗脱过程中压力变化对系统造成的影响，通过在第一维流动相中加入甲酸溶液，使4种VE异构体均有较好的峰形和较高的响应。建立的检测方法，在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9999，检出限低，灵敏度高。奶粉样品中的3个浓度水平加标回收率在91.20%~104.47%之间，相对标准偏差为0.94%~3.34%（n=6），结果较为满意。该方法实现了对VA、VD2、VD3和4种VE异构体的同时检测，简化了样品前处理过程，自动化程度高，重复性好，方法回收率高，可以作为儿童配方奶粉中VA、VD和VE含量的测定方法推广应用。
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图 1 在线SPE-二维液相色谱系统流程图
Figure 1. The scheme of online SPE two-dimensional liquid chromatography
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图 2 混合标准溶液的第一维色谱图
注：λ=325 nm, 294 nm；VA：500 ng/mL，VE：5000 ng/mL。
Figure 2. One-dimensional chromatogram of mixed standard solution
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图 3 混合标准溶液的第二维色谱图
注：λ=264 nm；VD：20 ng/mL。
Figure 3. Two-dimensional chromatogram of mixed standard solution
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图 4 儿童配方奶粉样品的第一维色谱图
注：λ=325 nm, 294 nm。
Figure 4. One-dimensional chromatogram of children's formula milk powder
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图 5 儿童配方奶粉样品的第二维色谱图
注：λ=264 nm。
Figure 5. Two-dimensional chromatogram of children's formula milk powder
表 1 三泵梯度洗脱程序
Table 1 Gradient programs of 3 pumps
SPE泵 第一维泵 第二维泵 时间
（min）A
（%）B
（%）C
（%）时间
（min）A
（%）B
（%）时间
（min）A
（%）B
（%）0 80 0 20 0 20 80 0 90 10 5 80 0 20 11 20 80 45 90 10 5.1 0 90 10 20 87 13 20 0 90 10 28 95 5 20.1 0 100 0 35 95 5 35 0 100 0 35.1 20 80 35.1 80 0 20 45 20 80 45 80 0 20 
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表 2 阀切换过程及说明
Table 2 Switching instructions for two-position six-way valve
步骤 阀1切换位置 阀2切换位置 说明 1 1-6 1-6 SPE泵上样，目标物被保留，样品基质和强碱液被淋洗到废液中。 2 1-2 1-6 SPE泵反向冲洗转移目标物至第一维分析柱，同时第一维泵采用高水相进行在线稀释，使目标物在第一维色谱柱柱头聚焦。 3 1-6 1-6 第一维泵分离分析VA和4种VE，并完成VD的净化，SPE泵对SPE柱进行清洗和平衡。 4 1-6 1-2 将VD馏分切割至捕集柱，阀切换的起始时间为VD色谱峰起点出峰时间减去0.1 min，阀切换的结束时间为VD色谱峰终点出峰时间加上0.1 min。 5 1-6 1-6 第二维泵分离分析VD2 和VD3。
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表 3 VA、VD和VE的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限
Table 3 Regression equations, linear ranges, correlation coefficient, LODs and LOQs of VA, VD and VE
组分名 回归方程 线性范围（ng/mL） 线性相关系数 方法检出限（µg/100 g） 方法定量限（µg/100 g） VA y=0.0007x+0.6315 5.0～500.0 0.99998 1.53 5.11 VD2 y=0.0009x+0.0099 1.0～100.0 0.99996 0.37 1.22 VD3 y=0.0008x+0.2035 1.0～100.0 0.99993 0.38 1.25 α-VE y=0.0229x+55.838 50.0～5000.0 0.99993 25.15 83.82 β-VE y=0.0139x+33.115 50.0～5000.0 0.99993 17.18 57.27 γ-VE y=0.0141x+18.368 50.0～5000.0 0.99995 16.98 56.61 δ-VE y=0.0152x+29.373 50.0～5000.0 0.99991 16.45 54.82
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表 4 VA、VD和VE加标回收率与精密度（n=6）
Table 4 Spiked recoveries and RSD of VA, VD and VE (n=6)
组分名 本底值
（μg/100 g）加标量
（μg/100 g）平均值
（μg/100 g）平均加标回
收率（%）RSD
（%）VA 363.48 10 372.96 94.80 1.32 400 752.27 97.20 1.61 800 1199.2 104.47 1.13 VD2 ND 2 1.84 92.10 3.34 10 9.39 93.85 2.41 20 19.18 95.89 2.36 VD3 7.47 2 9.29 91.20 1.65 10 17.01 95.36 2.25 20 26.79 96.59 1.52 α-VE 5250 100 5346.32 96.32 0.94 4000 9239.33 99.73 1.47 8000 13579.36 104.12 1.29 β-VE 240 100 335.54 95.54 2.67 4000 4146.18 97.65 2.15 8000 8154.44 98.93 1.15 γ-VE 2620 100 2717.43 97.43 1.02 4000 6568.64 98.72 1.21 8000 10678.71 100.73 1.42 δ-VE 510 100 607.25 97.25 1.18 4000 4426.02 97.90 2.09 8000 8499.06 99.86 1.53 注：ND表示未检出，表5同。
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表 5 实际样品中VA、VD和VE的测定结果（n=3）
Table 5 Determination results of VA, VD and VE in samples (n=3)
样品名称 VA
（µg/100 g）VD3
（µg/100 g）α-VE
（mg/100 g）β-VE
（mg/100 g）γ-VE
（mg/100 g）δ-VE
（mg/100 g）圣元优强儿童配方奶粉 本方法 363.48±2.43 7.47±0.26 5.25±0.08 0.24±0.01 2.62±0.03 0.51±0.03 国标 355.59±3.57 7.33±0.42 5.07±0.12 0.23±0.02 2.53±0.05 0.48±0.04 相对偏差（%） 2.19 1.89 3.49 6.45 3.50 6.06 伊利金领冠儿童配方奶粉 本方法 405.67±1.38 6.54±0.07 1.63±0.02 ND 0.78±0.01 0.16±0.01 国标 412.55±3.06 6.69±0.09 1.71±0.03 ND 0.83±0.02 0.17±0.01 相对偏差（%） 1.68 2.27 4.79 6.21 7.81 合生元阿尔法星学龄前儿童配方奶粉 本方法 289.23±0.34 4.78±0.02 1.37±0.01 ND 0.53±0.02 0.11±0.01 国标 283.37±2.16 4.57±0.03 1.32±0.02 ND 0.49±0.02 0.10±0.01 相对偏差（%） 2.05 4.49 3.72 7.84 6.57 爱他美学龄前儿童成长奶粉 本方法 283.48±1.27 4.82±0.03 2.83±0.05 ND 1.02±0.03 0.32±0.02 国标 275.50±1.89 4.65±0.05 2.72±0.05 ND 0.99±0.03 0.31±0.02 相对偏差（%） 2.86 3.59 3.96 3.49 4.47 美赞臣安儿健儿童配方奶粉 本方法 515.42±2.17 6.26±0.12 4.27±0.13 0.13±0.01 1.85±0.06 0.14±0.01 国标 498.49±3.76 6.13±0.13 4.18±0.13 0.12±0.02 1.76±0.07 0.13±0.01 相对偏差（%） 3.34 2.10 2.13 7.17 5.16 5.13 卡洛塔妮儿童配方羊奶粉 本方法 558.63±1.36 8.05±0.21 4.82±0.11 ND 1.65±0.03 0.12±0.01 国标 547.77±3.82 7.68±0.23 4.68±0.12 ND 1.56±0.03 0.11±0.01 相对偏差（%） 1.96 4.70 2.95 5.93 6.90
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