Study on the Mechanism of Whey Protein Isolate Masking Bitterness of Zanthoxylum bungeanum Maxim.
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摘要: 花椒是我国重要的香辛料及药用植物，因含有7-甲氧基香豆素而具有明显的苦味。花椒的苦味限制了花椒产品的开发和利用。本实验旨在探索乳清分离蛋白对花椒苦味的掩蔽效果及作用机制。选用花椒油树脂为基质，通过感官实验和电子舌考察了乳清分离蛋白对花椒苦味的掩蔽效果，采用分子对接技术探究了乳清分离蛋白对花椒苦味的掩蔽机制。结果表明，乳清分离蛋白可显著降低花椒油树脂的苦味，且花椒油树脂的苦味降低值与乳清分离蛋白的添加量存在质量浓度-效应关系；当其用量为1.00%，花椒油树脂溶液浓度为0.5%时，苦味降低值ΔBI为1.8，说明苦味掩蔽效果较好。分子对接模型显示7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白在第二个聚类具有20个对接构象，最低结合自由能为−5.90 kcal/mol，是两者发生相互作用最有可能的结合区域。因此，乳清分离蛋白是通过与7-甲氧基香豆素结合后阻止其与苦味受体结合而减少苦味的产生，该研究结果可为花椒加工产品的矫味提供参考依据。Abstract: Zanthoxylum bungeanum Maxim. is an essential spice and medicinal plant in China. Zanthoxylum bungeanum Maxim. has a distinct bitterness due to 7-methoxylcoumarin. The bitterness of Zanthoxylum bungeanum Maxim. restricted the development and utilization of its products. This study aimed to explore the masking effect and mechanism of whey protein isolate on the bitterness of Zanthoxylum bungeanum Maxim.. The masking mechanism of the bitterness of Zanthoxylum bungeanum Maxim. by whey protein isolate was investigated using the method of sensory evaluation, electronic tongue and molecular docking technique with Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin as the matrix. The results indicated that whey protein isolate could significantly mask the bitterness of Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin. Furthermore, there was a mass concentration-effect relationship between bitterness reduction values of Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin and the additive amount of whey protein isolate. When the dosage of whey protein isolate was 1.00% and the concentration of Zanthoxylum bungeanum oleoresin was 0.5%, the reduction value of ΔBI was 1.8, indicating that the bitterness masking effect was good. The molecular docking model showed that 7-methoxycoumarin and β-lactoglobulin had 20 docking conformations in cluster 2, and the lowest binding free energy was −5.90 kcal/mol. Hence, cluster 2 was the most likely binding region for their interaction. It could be concluded that whey protein isolate could mask the bitterness of Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin by binding to 7-methoxycoumarin and preventing it from binding to bitter receptors. The results may provide a reference for the taste correction of Zanthoxylum bungeanum Maxim. products.
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花椒为芸香科花椒属（Zanthoxylum）花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）和青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb. Et Zucc.）植物的干燥成熟果皮，是我国重要的香辛料和药用植物[1-2]。花椒以香和麻著称，花椒果皮中含有较多的挥发性成分，一般称为挥发油或精油，包括烯萜类、醇类、酮类和酯类等物质，这些挥发性成分使花椒具有独特的芳香味[3]。花椒果皮中含有丰富的不饱和脂肪酸酰胺，以山椒素为代表，具有强烈的刺激性，这些酰胺类物质使花椒具有麻味[4]。然而，花椒还具有苦味。近年来，随着政府脱贫攻坚政策实施，花椒成称为了经济林产业的主要抓手，花椒的种植面积不断扩大，市场上花椒的加工制品种类增加[5]。但是，在花椒产业迅速发展的同时，花椒的劣质指标——苦味，逐渐被消费者和相关企业发现，并提出掩蔽花椒产品中苦味的需求。花椒的苦味属于花椒的内部品质，是由于花椒含有的次级代谢产物所产生的负面风味[6]。在调味品中，当花椒（花椒或者花椒提取物等产品）添加量较多时，苦味就会愈发的明显，会降低调味品的质量。
苦味是一种基本味道，是甜、酸、苦、咸、鲜五种基本味觉之一[7-8]。苦味的特点之一就是其阈值极低，人对苦味的感知比对其他四种基本味觉都敏感[9]。消费者出于趋利避害的本能一般不喜欢苦味[10]。这也是苦味对花椒品质影响较大的原因。因此，开发一种可有效掩蔽花椒提取物苦味的方法是花椒产业发展的迫切需要。在食品工业中常用的苦味掩蔽技术有选择分离法（吸附和过滤）[11]、酶法[12]和掩蔽法等[13]。分离法是采用分离手段将苦味成分脱除出去。但食品中的苦味物质大多具有显著的生理活性[14]，对于人体健康具有一定的益处[15-16]，分离法在降低苦味的同时，也降低了食品中活性成分的含量[17-18]。掩蔽法可以通过阻断苦味物质与苦味受体结合来降低食品中的苦味，同时又能使对人体有益的苦味成分保留[19]。所以，研究食品的苦味掩蔽技术具有一定的重要性和必要性[20]。
乳清分离蛋白是牛奶中存在的一种营养价值很高且容易消化吸收的优质蛋白质[21]。乳清分离蛋白还可以作为食品添加剂或者苦味掩蔽剂[22]。苦味掩蔽剂是通过阻止苦味受体与苦味成分结合、阻断苦味信号传递等方式来降低或消除物质苦味的一类化合物[23]。Tenney等[24]研究了乳清分离蛋白对苦味剂（奎宁和咖啡碱）苦味感知的影响，感官结果表明添加乳清分离蛋白对咖啡因溶液的苦味无影响，而对相同浓度奎宁溶液的苦味有抑制作用。作者采用AUTODOCK软件分别对乳清分离蛋白和奎宁、咖啡碱进行分子对接，结果表明，乳清分离蛋白与奎宁的结合大于与咖啡碱的结合，说明乳清分离蛋白是通过与奎宁结合后阻止其与苦味受体结合而减少苦味的产生。
目前，关于花椒苦味掩蔽的研究报道较少。本课题组前期研究结果表明，7-甲氧基香豆素是花椒中的主要苦味成分之一，通过刺激人苦味受体TAS2R14产生苦味[6]。但是，如何有效的掩蔽7-甲氧基香豆素产生的苦味是花椒相关产业亟待解决的问题。因此，本研究首先以花椒油树脂为基质，通过感官评价及电子舌技术考察乳清分离蛋白对花椒油树脂苦味的掩蔽效果；同时，采用分子对接技术，探索了乳清分离蛋白对7-甲氧基香豆素苦味的掩蔽机制。本实验以突破降低花椒苦味强度技术瓶颈为导向，创新性的将感官分析、电子舌与分子对接技术相结合，从味觉感知、仪器测定与微观分子相互作用机制三个方面较深刻的探究了乳清分离蛋白对花椒油树脂苦味的掩蔽效果及作用机制。该研究结果不仅为探索降低花椒苦味方法提供了新思路，还有助于提高花椒产品在市场上的可接受性。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
花椒（汉源大红袍，7~9月份采于四川汉源清溪镇） 购于雅安当地农贸市场；乳清分离蛋白 购于湖北糖柜食品有限公司；7-甲氧基香豆素（纯度≥95%） 购于成都克洛玛生物技术有限公司；奎宁（纯度≥98%） 购于上海源叶生物科技有限公司；乙醇 购于成都市科龙化工试剂厂；纯净水（感官实验用水） 购于杭州娃哈哈集团有限公司。
RE-2000B旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；KH-300DE型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；Sartorius CP225D型电子天平 德国赛多利斯股份公司；FW-100高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；α-ASTREE电子舌（含7个化学传感器阵列：ZZ、JE、BB、CA、GA、HA、JB和一个参比电极Ag/AgCl） 法国Alpha M.O.S公司。
1.2 实验方法
1.2.1 花椒油树脂提取
将适量花椒放入高速粉碎机中粉碎成粉，过60目筛，密封置于阴凉干燥处备用。采用前期研究得出的提取方法[6]，按固液质量体积比1:10（w/v），称取200 g花椒粉置于烧杯中，以2000 mL的70%乙醇为提取剂，室温下浸提24 h后置于数控超声波清洗器中超声30 min （超声功率为210 W，超声温度为40 ℃），减压抽滤除去滤渣，利用旋转蒸发器减压旋蒸直至1 min内无液滴滴下，除去溶剂，得到花椒油树脂。
1.2.2 感官评价
1.2.2.1 感觉小组训练
8名感官评价员（4名女性和4名男性，年龄在19~28岁之间），均没有已知的味觉障碍病史，并对他们进行味觉强化训练，以确保感官评价员在苦味识别和强度评级方面的可靠性。首先，用下列标准味觉成分的1 mL水溶液进行识别和区别口腔感觉的训练：蔗糖（20 g/L）为甜味，NaCl（3.5 g/L）为咸味，柠檬酸（4 g/L）为酸味，明矾（1.5 g/L）为涩味，奎宁（0.05 g/L）为苦味[25]。其次，采用一系列奎宁浓度溶液为标准（0.005、0.01、0.025、0.05、0.1 g/L），其非线性苦味强度范围为0.5（几乎感觉不到苦味），1.0（轻微的苦），2.5（较苦），5.0（苦），10.0（非常苦）[24]。
1.2.2.2 感官评价分析
在味觉训练的基础上，对提取物进行感官评价。为了克服苦味成分水溶性的有限性，并最大限度的评估其在花椒中的苦味影响，将花椒油树脂溶于2.5%的乙醇中，然后在25 ℃水浴中进行感官评价。小组成员每次品尝1 mL溶液，到舌根处，然后在口中快速旋转，吐出，每个样品评估两次。为了防止感官疲劳，相邻两次评估之间间隔10 min。为了防止与气味的交叉交互，小组成员被要求使用鼻夹。此外，水被用作味蕾清洁剂。由于麻味是花椒的主要味觉特性，因此在评价各组的苦味强度时，也要评价其麻味的强度。麻味强度的执行标准为，花椒油树脂的麻味强度为10分（强烈）到0（几乎感觉不到）。
1.2.3 乳清分离蛋白掩蔽花椒油树脂苦味实验
花椒油树脂用200 mL含有2.5%乙醇的饮用纯净水配制成一定浓度（0.25%、0.50%和1.00%），超声促进成分溶解，然后进行减压抽滤除去油脂，分别加入0、0.75%、1.00%和1.25%的乳清分离蛋白，磁力搅拌（转速为720 r/min）20 min后，置于25 ℃的水浴锅中，根据1.2.2中的方法进行感官评价，评价苦味强度。
1.2.4 乳清分离蛋白掩蔽花椒油树脂苦味规律
探索在0.5%的花椒油树脂中分别加入乳清分离蛋白（0.10%、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%）（添加量按照GB 2760-2014《食品安全国家标准-食品添加剂使用标准》和GB 14880-2012《食品安全国家标准-食品营养强化剂使用标准》执行），磁力搅拌20 min，使其充分均匀溶解，置于25 ℃的水浴锅中，按照1.2.2中的感官评价方法进行苦味评价，同时评价花椒麻味的变化。本实验所选择的掩蔽效果评价指标为苦味降低值（ΔBI），公式为BI=（BI1+BI2+…+BIn）/n（n=8），ΔBI=BIa−BIb。其中，BI1、BI2……BIn为每位感官评价员测试的具体苦度值；BIa为掩味前苦度；BIb为掩味后苦度；n为参与口尝实验的感官评价员人数。同时还评价了麻味降低值（ΔNI），公式为NI=（NI1+NI2+…+NIn）/n（n=8），ΔNI=NIa−NIb。其中，NI1、NI2……NIn为每位感官评价员测试的具体麻度值；NIa为掩味前麻度；NIb为掩味后麻度。分别以乳清分离蛋白添加量为横坐标，感官评价苦味降低值（ΔBI）和麻味降低值（ΔNI）为纵坐标，综合考察乳清分离蛋白添加量对花椒油树脂苦味掩蔽效果和对花椒麻味的影响。然后，根据苦味感官符合韦伯-费希纳定律（S=KlgR）[26-27]，推测乳清分离蛋白对苦味的影响也应符合该规律，故建立对数关系模型，拟合出对数拟合曲线，探索乳清分离蛋白对花椒油树脂溶液的掩味变化规律。两者关系式为ΔBI=f（x）=alnx+b，其中f（x）表示花椒油树脂溶液苦味降低值，x表示乳清分离蛋白的添加量（%），a、b为待定参数。
1.2.5 电子舌测定
在0.5%的花椒油树脂中分别加入乳清分离蛋白（0.10%、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%），磁力搅拌20 min，使其充分均匀溶解待测，减压抽滤除去难容油脂，取滤液200 mL置于电子舌专用烧杯中。电子舌仪器经校准、诊断及自检后，开始测定，每秒采集1个数据，采集时间为120 s，每个样品重复测定3次，两个样品测定之间进行传感器清洗，清洗时间为120 s。记录传感器数据，并进行主成分分析[28]。
1.2.6 乳清分离蛋白对7-甲氧基香豆素苦味掩蔽分析
一系列不同浓度的7-甲氧基香豆素（0.5、0.25、0.175、0.0625、0.0315 mg/mL）分别添加1%的乳清分离蛋白，磁力搅拌20 min，充分混匀，并置于25 ℃的水浴锅当中。按照1.2.2中的方法进行苦味感官评价。同时感官评价未添加乳清分离蛋白的7-甲氧基香豆素溶液的苦味。
1.2.7 分子对接
乳清分离蛋白的主要成分是β-乳球蛋白（β-lactoglobulin（BLG），60%）[29]，其蛋白结构可作为受体用于分子模拟研究。因此采用分子对接技术研究β-乳球蛋白与7-甲氧基香豆素结合位点，进而阐述二者的结合机制，解释其掩蔽苦味的原因。β-乳球蛋白晶体结构来源于PDB数据库（www.rcsb.org），其ID为3BLG。分子对接参考Tenney等[24]的方法。蛋白受体的准备：在pymol1.7程序中，去除β-乳球蛋白结构中的结晶水，并进行加氢处理。随后，在autodocktool1.5.6程序中，合并蛋白非极性氢，并添加电荷、分配原子类型。对接配体的准备：7-甲氧基香豆素结构则在chemoffice中进行绘制，并在chem3D程序中用MM2力场进行优化。随后，用autodocktool1.5.6程序对小分子添加电荷、分配原子类型。对接空腔参数设置为：网格大小106×76×98，间距0.375 Å，grid box中心坐标为（−4.342，15.208，19.865）。通过autogrid4.2计算格点能量。对接参数设置为：构象搜索算法为拉马克遗传算法，蛋白和配体之间的结合情况用半经验的自由能计算方法评价。能量评估迭代次数（ga_num_evals）设为2500000，其余参数则默认。对接过程中将蛋白设置为刚性，小分子则设置为柔性，利用autodock4.2程序，共运行50次独立的对接，以2.0 Å为截断值，进行对接构象进行聚类。采用score function 函数对对接过程进行打分。
1.3 数据处理
采用SPSS 22.0软件处理数据，计算数据平均值，并采用方差分析及邓肯多重比较方法进行显著性分析（P<0.05），结果表示为平均值±标准差（n=3），采用Origin 2017软件进行主成分分析及作图。
2. 结果与分析
2.1 乳清分离蛋白添加量对花椒油树脂苦味掩蔽效果的影响
分别向0.25%、0.50%和1.00%的花椒油树脂中添加0、0.75%、1.00%和1.25%乳清分离蛋白，评价其苦味强度，结果如图1所示。由图1可知，添加乳清分离蛋白后，三种浓度水平的花椒油树脂的苦味强度均有所降低。随着乳清分离蛋白添加量的增加，花椒油树脂的苦味值越低，在乳清蛋白添加量为1.25%，花椒油树脂浓度为0.25%和0.50%时，苦味强度分别为0.75±0.37和0.86±0.32，当苦味强度在1以下时为轻微的苦，说明此时乳清蛋白的添加使花椒油树脂的苦味降低在可接受的范围内。当花椒油树脂浓度为1.00%时，添加1.25%的乳清分离蛋白，其苦味强度依然大于1，仍具有明显的苦味。分析其原因为花椒油树脂浓度较高，含有较多的苦味成分，需要更多的苦味掩蔽剂（乳清分离蛋白）来掩蔽其苦味[9]。以上结果说明乳清分离蛋白可有效降低花椒油树脂的苦味。
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图 1 乳清分离蛋白添加量对花椒油树脂苦味掩蔽效果的影响注：不同小写字母表示同一花椒油树脂浓度下不同添加量差异显著（P<0.05）。Figure 1. Effect of whey protein isolate dosage on bitterness masking of the Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin2.2 乳清分离蛋白掩蔽花椒油树脂苦味规律
通过图2A可以看出，随着乳清分离蛋白添加量的增加，花椒油树脂溶液的苦味降低值增大。当其用量为1.00%时，花椒油树脂溶液的苦味降低值ΔBI为1.8，苦味强度降低到1.1，苦味已经基本上被掩蔽。当乳清分离蛋白添加量达到1.00%时，此时花椒的麻味降低值仅为0.21±0.13，添加乳清分离蛋白基本上不影响花椒油树脂的麻味。因此，乳清分离蛋白对花椒油树脂溶液的苦味有较好的掩蔽作用（掩蔽机制见2.4部分），且较好的保留花椒的麻味。通过建立对数关系模型，得到对数拟合曲线为ΔBI=0.7082lnx+1.6374（R2=0.9501），这说明花椒油树脂的苦味降低值与乳清分离蛋白的质量浓度之间符合韦伯-费希纳定律，即中等强度刺激下，人类感官强度与物理刺激量之间存在对数关系。另外，李学林等[27]研究了4种苦味抑制剂（大豆多糖、HP-β-CD、黄原胶、阿斯巴甜）对3种苦味成分（穿心莲内酯、芦荟苷、氧化苦参碱）苦味的掩味效果，结果表明，随着苦味抑制剂添加量的增加，苦味成分对感官的刺激降低值越大，符合韦伯-费希纳定律，苦味掩蔽规律与本实验研究结果一致。
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图 2 乳清分离蛋白掩蔽花椒油树脂苦味规律注：（A）不同乳清蛋白添加量时花椒油树脂苦味及麻味降低值及韦伯-费希纳模型拟合；（B）不同乳清蛋白添加量对花椒油树脂苦味影响主成分分析结果；不同小写字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。Figure 2. Rule of whey protein isolate on bitterness masking of the Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin图2B为在0.50%的花椒油树脂溶液中添加不同浓度乳清分离蛋白后电子舌响应值的主成分分析图。由图2B可知，前两个主成分的贡献率分别为74.5%和15.6%，累计贡献率达到90.1%，能够反应样品的大量信息。观察样品分布可知，不同样品分布在二维图的不同区域，尤其是未添加乳清分离蛋白的样品与添加了乳清分离蛋白样品之间具有明显的区分，说明添加乳清分离蛋白对花椒油树脂味觉具有较大的影响。由于所用电子舌配备的传感器无法直接对苦味强度进行评价，只能对不同味觉之间进行区分，因此由主成分分析结果可知添加乳清分离蛋白后，花椒油油树脂味觉发生了变化，且不同乳清分离蛋白添加量对花椒油树脂味觉的影响不同。结合感官评价结果，可以判断乳清分离蛋白可以掩蔽花椒油树脂的苦味，且不同乳清蛋白添加量对花椒油树脂苦味掩蔽的效果不同。
2.3 乳清分离蛋白对不同浓度的7-甲氧基香豆素苦味的影响
本课题组前期研究结果表明，7-甲氧基香豆素在花椒中的含量高达103.65 mg/kg，是花椒苦味的主要贡献者[6]。因此，以7-甲氧基香豆素为花椒典型苦味成分，探索了乳清分离蛋白对7-甲氧基香豆素苦味的掩蔽效果。在一系列不同浓度的7-甲氧基香豆素（0.5、0.25、0.175、0.0625、0.0315 mg/mL）中分别添加1.00%的乳清分离蛋白，对5个样品溶液进行感官评定。以7-甲氧基香豆素的浓度为横坐标，苦味降低值（ΔBI）为纵坐标，绘制出图3。由图3可知，随着7-甲氧基香豆素浓度的增大，苦味降低值逐渐增大。当其浓度为0.5 mg/mL时，苦味降低值ΔBI为1.6。通过建立对数关系模型，得到对数拟合曲线为ΔBI=0.4790lnx+1.8832（R2=0.9946）。在实验浓度范围内，7-甲氧基香豆素的浓度-味觉强度曲线与对数函数拟合良好。因此，可以进一步确定乳清分离蛋白可有效抑制7-甲氧基香豆素苦味。
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图 3 乳清分离蛋白对不同浓度7-甲氧基香豆素苦味的影响注：不同小写字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。Figure 3. Effect of whey protein isolate on bitterness of 7-methoxycoumarin at different concentrations2.4 分子对接分析
2.4.1 聚类及结合自由能分析
如前所述，β-乳球蛋白在乳清分离蛋白中占较高比例，它常被用作模拟小分子与乳清分离蛋白结合的主要蛋白质。在分子对接研究中使用的β-乳球蛋白构象被视为刚性分子，即其构象在对接搜索过程中是固定的。表1显示了7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白结合的AUTODOCK结果的聚类分析数据，最低能量构象的结合自由能和解离常数显示在表2中。由此数据可知，分子对接总共产生8个聚类，说明7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白有8个独特结合位点。在8个结合位点中，有7个作为簇的成员具有多于1个对接构象，并且只有这些被认为是敏感的潜在结合位点。从最低结合能来看，各个聚类的最低结合能相差不大，在−4.86~−5.93之间，以范德华能、氢键和去溶剂能贡献为主。从对接构象来看，第二个聚类数目最多，有20个构象，其最低结合自由能为−5.90 kcal/mol，平均结合自由能为−5.89 kcal/mol。因此，第二个聚类所在的结合位点，最有可能是小分子7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白结合位点。
表 1 7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白分子对接聚类信息Table 1. Docking clustering information of 7-methoxycoumarin and β-lactoglobulin molecule聚类等级 最低结合能
（kcal/mol）运行 平均结合能
（kcal/mol）对接构象 1 −5.93 27 −5.92 4 2 −5.90 42 −5.89 20 3 −5.78 32 −5.52 5 4 −5.68 49 −5.67 9 5 −5.59 39 −5.58 7 6 −5.33 16 −5.33 1 7 −5.23 38 −5.23 2 8 −4.86 13 −4.86 2 表 2 各聚类解离常数及最低能量构象组成Table 2. The inhibition constant and the lowest energy conformation composition of each cluster聚类 抑制常数
（µmol）结合能
（kcal/mol）范德华能+氢键+去溶剂能
（kcal/mol）静电
（kcal/mol）最终总内能
（kcal/mol）扭转自由能
（kcal/mol）未结合体系能量
（kcal/mol）1 44.65 −5.93 −6.12 −0.11 −0.06 +0.30 −0.06 2 47.53 −5.90 −5.98 −0.21 −0.06 +0.30 −0.06 3 57.63 −5.78 −6.10 +0.02 −0.06 +0.30 −0.06 4 68.64 −5.68 −5.98 +0.01 −0.06 +0.30 −0.06 5 79.99 −5.59 −5.89 +0.00 −0.07 +0.30 −0.07 6 123.99 −5.33 −5.61 −0.01 −0.06 +0.30 −0.06 7 145.59 −5.23 −5.49 −0.04 −0.08 +0.30 −0.08 8 273.07 −4.86 −4.72 −0.44 −0.08 +0.30 −0.08 注：结合能=范德华能+氢键+去溶剂能+静电+最终总内能+扭转自由能−未结合体系能量。 2.4.2 结合位点分析
7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白的结合位点如图4A所示。图中青色表示α-螺旋，紫色表示β-折叠，黄色表示活性位点附近与底物相互作用形成氢键的氨基酸。聚类1、聚类2结合位点与小分子形成氢键的残基为Serine21；聚类3、聚类7结合位点与小分子形成氢键的残基为Isoleucine12，Threonine76；聚类4、5、6结合位点没有与小分子形成氢键的残基；聚类8结合位点与小分子形成氢键的残基为Leucine1，Lysine91[30]。从聚类结果可知，聚类2中含有20个对接构象，占总构象的40%，且其平均结合能为-5.89 kcal/mol，结合能为负值，表明两个分子之间结合较好[31-32]。因此，该结合位点是小分子7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白最有可能的结合位点。该结合位点位于蛋白表面一个较为开放的区域，与溶剂接触，有利于与小分子结合。
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图 4 7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白的结合位点（A）和聚类2构象二维图（B）Figure 4. Binding sites of 7-methoxycoumarin and β-lactoglobulin (A) and two-dimensional diagram of cluster 2 conformation (B)7-甲氧基香豆素是花椒中的主要苦味成分之一，β-乳球蛋白是乳清分离蛋白的主要成分，分子对接模型显示，7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白最有可能在聚类2所在的区域结合。聚类2构象二维图如图4B所示。由图4B可知，7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白之间的主要相互作用力包括范德华力、氢键、Pi-阴离子相互作用。由此可知，乳清分离蛋白是通过以上作用力与7-甲氧基香豆素结合，从而阻止其与苦味受体结合而在一定程度上成功掩蔽了苦味。与该结果相似，壳聚糖-环糊精加合物可以通过琥珀酰基或马来酰基与咖啡因结合，从而掩蔽咖啡因的苦味[33]。因此，乳清分离蛋白可作为苦味掩蔽剂添加到花椒油树脂或者花椒提取物中，掩蔽其苦味，改善花椒产品的风味。
3. 结论
本文以花椒油树脂为依据，通过感官分析、电子舌测定和分子对接技术系统研究了乳清分离蛋白对花椒油树脂苦味的掩蔽效果与机制。结果表明添加乳清分离蛋白可以显著降低花椒油树脂的苦味，这说明乳清分离蛋白对花椒油树脂的苦味有较好的掩蔽效果。乳清分离蛋白可以通过与7-甲氧基香豆素结合，从而阻止其与苦味受体结合，掩蔽了花椒的苦味，揭示了乳清分离蛋白掩蔽花椒苦味的作用机制。与通过分离出苦味成分来降低苦味的技术相比，该苦味掩蔽技术操作简便，作用效果显著，不仅较好的保留了花椒中的次级代谢产物，还显著的降低了花椒的苦味，具有较强的理论研究意义与在花椒产业实际应用的潜力。本结果在一定程度上能为食品工业中花椒苦味的掩蔽提供理论基础，从而可以扩大花椒的应用范围，提高花椒的经济价值。
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图 1 乳清分离蛋白添加量对花椒油树脂苦味掩蔽效果的影响
注：不同小写字母表示同一花椒油树脂浓度下不同添加量差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Effect of whey protein isolate dosage on bitterness masking of the Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin
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图 2 乳清分离蛋白掩蔽花椒油树脂苦味规律
注：（A）不同乳清蛋白添加量时花椒油树脂苦味及麻味降低值及韦伯-费希纳模型拟合；（B）不同乳清蛋白添加量对花椒油树脂苦味影响主成分分析结果；不同小写字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Rule of whey protein isolate on bitterness masking of the Zanthoxylum bungeanum Maxim. oleoresin
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图 3 乳清分离蛋白对不同浓度7-甲氧基香豆素苦味的影响
注：不同小写字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。
Figure 3. Effect of whey protein isolate on bitterness of 7-methoxycoumarin at different concentrations
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图 4 7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白的结合位点（A）和聚类2构象二维图（B）
Figure 4. Binding sites of 7-methoxycoumarin and β-lactoglobulin (A) and two-dimensional diagram of cluster 2 conformation (B)
表 1 7-甲氧基香豆素与β-乳球蛋白分子对接聚类信息
Table 1 Docking clustering information of 7-methoxycoumarin and β-lactoglobulin molecule
聚类等级 最低结合能
（kcal/mol）运行 平均结合能
（kcal/mol）对接构象 1 −5.93 27 −5.92 4 2 −5.90 42 −5.89 20 3 −5.78 32 −5.52 5 4 −5.68 49 −5.67 9 5 −5.59 39 −5.58 7 6 −5.33 16 −5.33 1 7 −5.23 38 −5.23 2 8 −4.86 13 −4.86 2 
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表 2 各聚类解离常数及最低能量构象组成
Table 2 The inhibition constant and the lowest energy conformation composition of each cluster
聚类 抑制常数
（µmol）结合能
（kcal/mol）范德华能+氢键+去溶剂能
（kcal/mol）静电
（kcal/mol）最终总内能
（kcal/mol）扭转自由能
（kcal/mol）未结合体系能量
（kcal/mol）1 44.65 −5.93 −6.12 −0.11 −0.06 +0.30 −0.06 2 47.53 −5.90 −5.98 −0.21 −0.06 +0.30 −0.06 3 57.63 −5.78 −6.10 +0.02 −0.06 +0.30 −0.06 4 68.64 −5.68 −5.98 +0.01 −0.06 +0.30 −0.06 5 79.99 −5.59 −5.89 +0.00 −0.07 +0.30 −0.07 6 123.99 −5.33 −5.61 −0.01 −0.06 +0.30 −0.06 7 145.59 −5.23 −5.49 −0.04 −0.08 +0.30 −0.08 8 273.07 −4.86 −4.72 −0.44 −0.08 +0.30 −0.08 注：结合能=范德华能+氢键+去溶剂能+静电+最终总内能+扭转自由能−未结合体系能量。
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