Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Conditions of Melleolides from Wild Armillaria mellea and Liquid Culture Mycelium, and Analysis of Their Compounds in Extracts
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摘要: 目的：为分析榛蘑与菌丝体中化合物差异，本研究以东北野生榛蘑子实体和液态菌丝体为研究对象，探究蜜环菌素的最佳提取工艺条件，并对提取物中化合物进行分析。方法：以提取物得率和蜜环菌素含量为指标，采用超声波细胞破碎辅助石油醚进行萃取，通过单因素实验和正交试验对提取工艺参数进行优化；采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，对液态菌丝体和榛蘑子实体中化合物进行分析和鉴定。结果：确定最佳提取工艺条件为料液比1:20 g/mL，超声波功率300 W，超声时间20 min，溶剂回流时间50 min，在该条件下液态菌丝体提取物得率为26.8%，蜜环菌素含量为0.74 mg/g；液态菌丝体和榛蘑子实体中化合物分别为305和592个。解析出16种蜜环菌素类和5种疑似蜜环菌素碎片物质，其中菌丝体中含有15种蜜环菌素和3种碎片，总含量分别为2.551和0.588 µg/mL；子实体中含有7种蜜环菌素和4种碎片，总含量分别为2.413和2.124 µg/mL。两者同有组分有6种蜜环菌素和2种碎片；液态菌丝体独有9种蜜环菌素和1种碎片为：10-dehydroxymelleoloede、蜜环菌辛素、Arnamiol、蜜环菌壬素、A52a、4-dehydroxyarmillarin、蜜环菌丙素、（4R,5S,7R,9S,13R）-2’,5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin、4’-demethoxyarmillaribin以及碎片C；榛蘑子实体独有1种蜜环菌素和2种碎片为：Melledonal以及碎片D和E。结论：液态菌丝体蜜环菌素类化合物多于子实体中，为开发辅助功能食品及药物提供参考。
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关键词:
- 野生榛蘑 /
- 子实体 /
- 液态培养菌丝体 /
- 蜜环菌素 /
- UHPLC-MS/MS
Abstract: Objective: To analyze the differences of compounds in Armillaria mellea and mycelium, this study was conducted to investigate the optimal extraction process conditions of Melleolides and analyze the compounds in the extracts using northeastern wild Armillaria mellea fruit body and liquid mycelium as the research objects. Methods: The indexes of this study were extracted yield and Melleolides content. Ultrasonic cell crushing-assisted petroleum ether was used for extraction, and the extraction process parameters were optimized by single-factor experiments and orthogonal tests. The compounds in the liquid mycelium and Armillaria mellea fruit body were analyzed and identified by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). Results: The optimal extraction process conditions were determined as material-liquid ratio 1:20 g/mL, ultrasonic power 300 W, ultrasonic time 20 min, solvent reflux time 50 min, under which the yield of liquid culture mycelium extract was 26.8% and the content of Melleolides was 0.74 mg/g. 305 and 592 compounds were analyzed and identified in the liquid mycelium and wild Armillaria mellea, respectively. 16 Melleolides and 5 fragments of suspected Melleolides were identified, including 15 Melleolides and 3 fragments in the mycelium, with total contents of 2.551 and 0.588 µg/mL, respectively. 7 Melleolides and 4 fragments in fruit body, with total contents of 2.413 and 2.124 µg/mL, respectively. 6 Melleolides and 2 fragments were found in both; The liquid mycelium had 9 unique Melleolides and 1 fragment: 10-dehydroxymelleoloede, Nectarine, Arnamiol, Bexagliflozin, A52a, 4-dehydroxyarmillarin, 9-(2-Chloro-4-hydroxy-5-methoxyphenyl)-3,3,6,6-tetramethyl-3,4,5,6,7,9-hexahydro-1H-xanthene-1,8(2H)-dione, (4R,5S,7R,9S,13R)-2',5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin, 4'-demethoxyarmillaribin, and fragment C. Wild Armillaria mellea uniquely possessed one Melleolides and two fragments as: Melledonal as well as fragments D and E. Conclusion: The results showed that Melleolides were more abundant in the liquid mycelium than in the fruit body, providing reference for the development of complementary functional foods and drugs.-
Keywords:
- wild Armillaria mellea /
- fruiting body /
- liquid culture mycelium /
- Melleolides /
- UHPLC-MS/MS
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食药用菌是一类天然无毒副作用的绿色资源真菌，蜜环菌（Armillaria mellea（Vahl.ex Fr.）Quel）是一种常见的食药用菌，又名榛蘑，属于担子菌亚门（Bsaidiomycotina）、伞菌目（Agaricales）、口蘑科（Tricholomataceae）、蜜环菌属（Armillariella），其产地广泛分布于欧洲、亚洲、北美国家等许多地区以及热带及温带的森林地区[1]，我国主产于黑龙江、吉林、辽宁、河北等地[2]。榛蘑中含有包括蜜环菌素类、多糖类、萜类、多元醇、酚、有机酸、氨基酸、黄酮类、维生素、微量元素在内的多种活性成分，功能丰富，在新型天然药用资源开发利用中占据重要地位，目前，已被开发应用于神经疾病以及心脑血管治疗药物，其菌丝体被国家食品药品监督管理部门批准可用于辅助降血压[3]。榛蘑的子实体对眩晕、肢麻、失眠、耳鸣等有较好治疗作用，有着明目、祛风活筋、强筋壮骨的药用功能[4]，但其成分解析还不够全面，构效关系还有待于深入研究。
蜜环菌素是榛蘑中存在的特征成分，是由倍半萜醇和芳香酸及其衍生物通过酯化而成的原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯类化合物，该种结构在天然产物中独特存在。尽管倍半萜醇和芳香酸及其衍生物都独立存在于自然界中，但二者酯化结合物目前仅在榛蘑中有发现[5-7]，主要有蜜环菌甲素、蜜环菌乙素、蜜环菌戊素、蜜环菌酸等[8]。随着对蜜环菌素类结构解析的深入以及构效关系的研究，近年来，不断有榛蘑抑制癌细胞等研究报道，例如：用蜜环菌乙素可以抑制K562（人慢性骨髓性白血病细胞）、HEL 92.1.7（人慢性红细胞白血病细胞）和U937（人急性单细胞白血病细胞）的生长[9]；蜜环菌乙素对人食管癌和人淋巴癌有细胞毒性作用，且能抑制人食道癌的xe-no生长和增加移植肿瘤模型中的放射性敏感[9-10]，并能抑制巨噬细胞活化和分化[11]；蜜环菌乙素作用于人肝癌细胞（HCC）后，微管相关蛋白1轻链3（LC3）大量聚集，微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）大量转化成微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ），导致癌细胞自噬[12]。蜜环菌庚素与活性氧（ROS）诱导人淋巴瘤和肝癌（HCC）细胞凋亡死亡[13-14]；蜜环菌戊素通过Cys159抑制5-脂氧合酶（5-LO）从而抑制花生四烯酸合成白三烯，增强免疫作用[15-17]。
由于野生榛蘑资源有限，人工分离榛蘑母体纯菌株进行液态培养菌丝体，并获取其生物活性成分，为大规模工业化生产提供可行性。本研究以东北野生榛蘑子实体与其母体纯种人工液态培养菌丝体为研究对象，利用超声细胞破碎辅助溶剂萃取提取物，采用UHPLC-MS/MS对其组分进行检测，在正、负离子模式下进行分析推测并鉴定其中化合物，分析活性物质种类及含量，揭示野生子实体与人工液态菌丝之间差异，为药物开发提供理论依据，并从中寻找新化合物，为辅助抗癌化疗新型药物的开发提供方向，达到降低化疗药物的摄入以及对机体的损伤的目的。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
野生榛蘑 采自黑龙江省孙吴县鲜榛蘑，由本实验室经组织分离并鉴定，奧氏蜜环菌（Armillaria ostoyae）菌种获得的母体纯菌株，PDA培养基4 ℃斜面试管保存；蜜环菌甲素标准品 实验室自制；二-氯苯丙氨酸 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈 色谱级，Merck KGaA公司；甲酸 色谱级，西亚试剂公司；PDA 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；葡萄糖 天津市瑞金特化学品有限公司；蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司； KH2PO4 天津市凯通化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O 天津市天力化学试剂有限公司；石油醚 天津市富宇精细化工有限公司。
Thermo Vanquish UHPLC型超高效液相色谱仪、Q-Exactive HF型高分辨质谱 美国赛默飞世尔科技有限公司；Zorbax Eclipse型 C18（1.8 µm×2.1 mm×100 mm）色谱柱 美国安捷伦科技公司；723N UV5100型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器公司；JY92-IIN型超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技；HC-200型多功能粉碎机 浙江省金穗机械制造厂；JJ200型精密电子天平 美国双杰兄弟有限公司；R-201型旋转蒸发器 上海申胜公司；SW-CJ-ECU型超净工作台 苏州其嘉净化设备有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱、GHP-9050型隔水式恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；SHB-III型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 榛蘑液态菌丝体培养
将葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 1.0 g，加1000 mL水配制培养基，取100 mL置于250 mL锥形瓶中，高压灭菌121 ℃、0.105 MPa 30 min，待冷却至室温，用灭菌打孔器取直径为1 cm的榛蘑菌块，单块接种于三角瓶中，纱布包扎瓶口置于转速为160 r/min的摇床中，温度为26 ℃，振荡培养13 d后，获得液态培养菌丝体。
1.2.2 液态菌丝体与子实体粉末制备
将榛蘑的菌丝体和发酵液真空抽滤，收集菌丝体，用流水冲洗数次，置于60 ℃，干燥至恒重取出；野生榛蘑子实体用流水冲洗表面沙尘，同样在60 ℃下进行干燥，2种干燥物，用粉碎机粉碎后过40目筛，分别获得菌丝体与子实体粉末，具体操作流程与样品形态见图1、图2。
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图 2 榛蘑野生子实体、液态菌丝体及粉末形态注：A，野生榛蘑子实体；B，野生子实体粉末；C，母体纯菌株培养菌丝体；D，液态培养菌丝体粉末。Figure 2. Wild fruiting body, liquid mycelium, and powder of Armillaria mellea1.2.3 蜜环菌素的超声辅助提取
称取预处理好的液态菌丝体和野生子实体粉末各1 g，分别加入石油醚溶液10 mL，设置好超声波细胞破碎仪参数：功率300 W、时间20 min，放入原料粉末和提取溶剂后进行超声波破碎，再将破碎后的粉末和石油醚转入到索氏提取器中进行溶剂回流50 min，过滤后转入设置好参数为真空度−0.085 MPa，水浴温度60 ℃，转速120 r/min的旋转蒸发仪中进行浓缩处理，等到提取液减少至原体积的1/5后即停，获得提取物。
1.2.4 蜜环菌素标准曲线绘制
称取蜜环菌甲素标准品（纯度HPLC≥98%，实验室自制）1 mg，加入甲醇溶液定容至10 mL，即配制成浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，分别稀释成为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的工作液，进行标准曲线的绘制。
在紫外可见分光光度计波长217 nm处测量得到蜜环菌甲素质量浓度随吸光度值变化的方程为Y＝1.84x＋0.0961（R2=0.9997）。
1.2.5 蜜环菌素含量及提取物得率计算
将浓缩液移入被烘干的蒸发皿中，等到它冷却至室温后称定质量。并取1 mL浓缩液以甲醇稀释至100倍后，以甲醇为空白对照进行校正，测其吸光度，超声辅助法下液态菌丝体/野生子实体提取物得率及其中蜜环菌素含量的计算公式如下：
式中：Y-吸光度；c-蜜环菌素浓度（mg/mL）；C-蜜环菌素含量（mg/g）； V-体系总体积（mL）；n-稀释倍数；m-蜜环菌素提取物质量（g）；M1-提取物浓缩液质量（g）；M2-榛蘑用量（g）。
1.2.6 单因素实验
精密称取适量的榛蘑菌丝体粉、子实体粉和一定量的石油醚于烧杯中，超声波细胞破碎仪处理后，将实验原料和石油醚转移到索氏提取器中，让蜜环菌素充分溶解出。固定因素水平为料液比1:20 g/mL、超声波功率300 W、超声波时间20 min和溶剂回流时间50 min，考察不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）、超声波功率（200、250、300、350、400 W）、超声时间（10、15、20、25、30 min）和溶剂回流时间（10、30、50、70、90 min）对榛蘑中提取物得率和蜜环菌素类物质含量的影响情况，用以确定超声波辅助法提取液态菌丝体和野生子实体提取物各个因素的优水平。
1.2.7 正交试验
根据单因素实验所得结果，选择适当的水平进行正交试验优化设计，确定超声波辅助法提取液态菌丝体和野生子实体提取物的最佳工艺条件。采用四因素三水平的正交试验方法进行实验，实验方案的因素水平表如表1所示。
表 1 L9（34）正交实验因素水平设计Table 1. L9 (34) Orthogonal experimental design factor level table因素 因素 A料液比
（g/mL）B超声波功率
（W）C超声波时间
（min）D溶剂回流时间
（min）1 1:15 250 15 30 2 1:20 300 20 50 3 1:25 350 25 70 1.2.8 榛蘑菌丝体提取物的UHPLC-MS/MS检测分析
取榛蘑液态菌丝体、野生榛蘑子实体提取物0.01 g于5 mL离心管中，加入1.5 mL的70%甲醇，涡旋1 min，于4 ℃冰箱冷藏浸提过夜，加入100 µg/mL的内标二-氯苯丙氨酸10 µL，使样品溶液中内标浓度1 µg/mL。再进行4 ℃、5000 r/min离心5 min，取出上清液根据物质内含物含量进行稀释，过0.22 µm滤膜后上机。参数设置为30 ℃柱温，0.3 mL/min流速，A相水+0.1%甲酸和B相纯乙腈组合的流动相，2 µL进样量，4 ℃自动进样器温度。正模式参数设置为325 ℃加热器温度，45 arb鞘气流速，15 arb辅助气流速，1 arb吹扫气流速，3.5 kV电喷雾电压，330 ℃毛细管温度，55% S-Lens RF Level。负模式参数设置为325 ℃加热器温度，45 arb鞘气流速，15 arb辅助气流速，1 arb吹扫气流速，3.5 kV电喷雾电压，330 ℃毛细管温度，55% S-Lens RF Level。扫描模式为一级全扫描（Full Scan，m/z 100～1500）与数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2，TopN=10），参数设置为120000（一级质谱）、60000（二级质谱）分辨率，高能量碰撞解离（HCD）碰撞模式。流动相梯度洗脱程序：0.0～11.1 min，95%～10% A；11.0～12.0 min，10% A；12.0～12.1 min，10%～95% A；12.1～14.0 min，95% A。利用色谱图中对应的保留时间和MS/MS信息对被检测物质进行定性，采用内标法对化合物浓度进行定量。
1.3 数据处理
实验中所有数据均进行3次平行实验，数据以平均值±标准形式表示。利用Excel 2007和 Origin 2018对生物学特性实验进行数据处理，差异显著水平为P<0.05。
2. 结果与分析
2.1 超声波辅助提取蜜环菌素条件优化
2.1.1 料液比对蜜环菌素提取的影响
根据1.2.6进行单因素实验，考察料液比对蜜环菌素提取的影响，所得结果如下图3所示。
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图 3 料液比对菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响Figure 3. Effect of solid-liquid ratio on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides超声波细胞破碎法是利用超声在提取溶剂中使能量产生和传递，生成强烈的空化效应[18]，瞬间破裂细胞壁和整个生物体，可使有效成分充分溶出达到提高提取率的目的。如图3所示，随着料液比的增加，榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素提取量也逐渐增加，当料液比1:20 g/mL的情况下，液态菌丝体和野生子实体提取物得率和提取出的蜜环菌素都达到最高值，液态菌丝体提取物得率为20.5%，蜜环菌素含量为0.401±0.0049 mg/g；野生子实体提取物得率为18.9%，蜜环菌素含量为0.386±0.008 mg/g，均低于菌丝体，可能是由于子实体的细胞壁较坚固，破碎率低于菌丝体，从而导致溶于溶剂成分较少。杨峻山等[19]以1 kg榛蘑菌丝体干燥物为原料，用丙酮进行溶剂萃取，最终得到35 mg蜜环菌寅素、56 mg蜜环菌丑素、42 mg蜜环菌丁素，综合蜜环菌素得率为0.013%，较于本实验验证石油醚作为提取溶剂更佳。之后随着料液比的增加，提取物得率和蜜环菌素提取量逐渐降低，可能是因为当所使用的石油醚量较少时，提取溶剂不能充分进入榛蘑的子实体和菌丝体中，不能充分带出有效活性成分，使其溶解于提取溶剂中。随着提取溶剂用量的增加，子实体和菌丝体与溶剂接触面积增大，利于蜜环菌素的提取，但提取溶剂用量过大时，溶剂吸收到超声波能会增大，子实体和菌丝体吸收的超声波能减少，细胞壁破坏不充分，蜜环菌素无法充分溶出[15]。综合考虑提取效率和经济效应等因素，确定最佳料液比为1:20 g/mL。
2.1.2 超声波功率对蜜环菌素提取的影响
根据1.2.6进行单因素实验，考察超声波功率对蜜环菌素提取的影响，所得结果如下图4所示。
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图 4 超声波功率对榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响Figure 4. Effect of ultrasonic power on the yield of Armillaria mellea extracts and the content of Melleolides如图4所示，随着超声波功率的增加，榛蘑菌丝提取物得率和蜜环菌素提取量也逐渐增加，当超声波功率为300 W时，菌丝体和子实体提取出的蜜环菌素都达到最高值，菌丝体提取物得率为22.7%，蜜环菌素的含量为0.582±0.0052 mg/g；子实体提取物得率为19.8%，蜜环菌素的含量为0.533±0.006 mg/g。王春兰等[20]以石油醚为提取溶剂，采用索氏提取器回流提取榛蘑12 h，菌丝体中得到0.0085%的蜜环菌甲素、0.0002%蜜环菌戊素，子实体中得到0.002%蜜环菌甲素，0.0011%蜜环菌戊素，菌丝体中蜜环菌素提取率优于子实体，并对比本实验发现超声波细胞破碎仪的加入明显优化了蜜环菌素的提取率。之后蜜环菌素提取量与超声波功率呈负相关。这种变化情况可能是由于较低超声波功率时，子实体和菌丝体完整细胞被破碎程度都较低，蜜环菌素从细胞内透过细胞壁渗出到提取溶剂的量较少。随着超声波功率的提升，增强了空化效应强度，使得完整细胞的细胞壁和整个生物体都能够破裂，加速提取物及其蜜环菌素的溶出。但当超声波功率过大时，一方面可能空化气泡产生过多，阻碍超声波在液体介质的传播；另一方面可能细胞破碎程度过大，多余成分溶出，甚至蜜环菌素类物质结构都能遭到破坏[15,21]。综合考虑提取效率和成本等因素，确定最佳超声波功率为300 W。
2.1.3 超声时间对蜜环菌素提取的影响
根据1.2.6进行单因素实验，考察超声时间对蜜环菌素提取的影响，所得结果如图5所示。
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图 5 超声波时间对榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响Figure 5. Effects of ultrasonic time on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides如图5所示，随着超声时间的增加，榛蘑菌丝中提取物得率和蜜环菌素提取量也逐渐增加，当超声时间为20 min时，菌丝体和子实体提取出的蜜环菌素都达到最高值，菌丝体提取物得率为25.9%，蜜环菌素的含量为0.582±0.0053 mg/g；子实体提取物得率为21.4%，蜜环菌素的含量为0.533±0.0078 mg/g，略低于菌丝体。之后随着超声波时间的增加，提取物得率和提取出的蜜环菌素逐渐降低。这可能是因为当超声波时间较短时，超声波产生的空化效应不够持久，不利于榛蘑子实体和菌丝体的细胞破碎和蜜环菌素的溶出。随着超声波时间的继续增加，细胞壁和整个生物体都能够充分破裂，加速蜜环菌素的溶出。但当超声时间过长时，造成提取溶剂的挥发，并增加榛蘑内其他成分的溶出，使提取溶剂中含有过多其他成分，一部分蜜环菌素结构可能遭到破坏[18]，导致蜜环菌素得率的降低。因此选取超声提取时间20 min进行后续实验。
2.1.4 溶剂回流时间对蜜环菌素提取的影响
根据1.2.6进行单因素实验，考察溶剂回流时间对蜜环菌素提取的影响，所得结果如下图6所示。
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图 6 溶剂回流时间对榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响Figure 6. Effect of solvent reflux time on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides如图6所示，随着溶剂回流时间的增加，榛蘑中蜜环菌素提取量也逐渐增加，当溶剂回流时间为50 min时，菌丝体提取物得率为26.8%，蜜环菌素的含量为0.741±0.0054 mg/g；子实体提取物得率为22.7%，蜜环菌素的含量为0.689±0.008 mg/g。之后随着溶剂回流时间的增加，提取物得率和提取出的蜜环菌素变化幅度较小。这种现象的发生可能是由于当溶剂回流时间较短时，榛蘑子实体和菌丝体粉末与提取溶剂接触不够充分，不利于蜜环菌素的溶出。随着溶剂回流时间的继续增加，子实体与菌丝体的粉末能达到与提取溶剂多次充分接触的效果，蜜环菌素溶出较充分。但当溶剂回流时间过长时，一方面会导致提取溶剂的挥发过多，提取溶剂的减少导致溶剂的溶解度达到上限，因此限制了蜜环菌素的渗出；另一方面可能是由于物料本身的蜜环菌素剩余含量低，溶解速度减慢，导致蜜环菌素提取速率下降[22]。综合经济效益和环境保护等因素，溶剂回流时间50 min时提取率最优，但综合考虑各种因素和效应，发现溶剂回流时间对蜜环菌素提取的得率影响不是很大，后期投入工业生产时可舍去该因素。
2.1.5 蜜环菌素提取正交试验结果与分析
根据单因素实验结果，采用正交试验设计优化工艺方案，所得实验结果如表2所示。
表 2 正交试验结果Table 2. Orthogonal test results实验号 A料液比
（g/mL）B超声波
功率（%）C超声波
时间（min）D溶剂回流
时间（min）蜜环菌素
含量（mg/g）1 1 1 1 1 0.235 2 1 2 2 2 0.615 3 1 3 3 3 0.250 4 2 1 2 3 0.480 5 2 2 3 1 0.340 6 2 3 1 2 0.315 7 3 1 3 2 0.280 8 3 2 1 3 0.300 9 3 3 2 1 0.265 K1 1.1 0.995 0.85 0.84 K2 1.135 1.255 1.36 1.21 K3 0.845 0.83 0.87 1.03 R 0.29 0.425 0.49 0.37 k1 0.366667 0.331667 0.283333 0.280000 k2 0.378333 0.418333 0.453333 0.403333 k3 0.281667 0.276667 0.290000 0.343333 r 0.096667 0.141667 0.163333 0.123333 因素主次 C>B>D>A 优方案 C2B2D2A2 表2结果所示，以蜜环菌素的含量为考察指标，可知上述四个单因素影响蜜环菌素提取程度的紧要顺序为C>B>D>A，即超声波时间>超声波功率>溶剂回流时间>料液比。超声波辅助萃取对蜜环菌素提取最佳优化条件为C2B2D2A2，即料液比1:20 g/mL，超声波功率300 W，超声波时间20 min，溶剂回流时间50 min。根据上述条件，平行测定3次，提取物得率为26.0%、26.8%、27.6%，提取物中蜜环菌素的含量分别为0.733、0.74、0.747 mg/g，实验证明此条件下提取物得率为26.8%，蜜环菌素含量为0.74 mg/g。
2.2 野生榛蘑子实体和液态菌丝体提取物中化合物的分析
经过UHPLC-MS/MS技术对野生榛蘑子实体、液态菌丝体提取物在正、负离子模式下进行鉴定和定性分析，所得离子流（TIC）图如图7所示。菌丝体、子实体提取物分别共检测到482、1147个化合物，经化源网（https://www.chemsrc.com/）、Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Chemspider（http://www.chemspider.com/）数据库中化学式、分子量、结构、色谱行为等相关信息比对，分析出液态菌丝体提取物中305个化合物，总含量为40.18 µg/mL，野生榛蘑子实体提取物中592个化合物，总含量为129.588 µg/mL。化合物种类的鉴定结果：除蜜环菌素类物质外，检测还发现了萜类、酚类、黄酮类、香豆素类、酯类、固醇类、鞘脂类、氨基酸类、多肽类、蛋白类、酸、醛、醇、嘌呤、嘧啶、核苷类、酰胺类、生物碱、胺类、巴比妥类、酮类、醌类、杂环类以及其它等多类物质。本研究榛蘑菌丝体提取物与已报道的榛蘑活性物质研究相比[4,6,20-26]，新检出了石竹素、白术内酯Ⅱ、去氢木香内酯、圆柚酮、咖啡油醇、小白菊内酯、异土木香内酯、七叶胆皂甙、梓苷、甲基柏木酮、豨莶精醇、木香烃内酯、黑麦草内酯、丙泊酚、异草甘素、含羞草素化合物。
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图 7 UHPLC-MS/MS分析榛蘑菌丝体、子实体提取物得到的一级总离子流图注：A+，菌丝体正离子模式；A−，菌丝体负离子模式；B+，子实体正离子模式；B−，子实体负离子模式。Figure 7. First-order total ion chromatograms obtained from UHPLC-MS/MS analysis of Armillaria mycelium and fruit body extracts2.3 提取物中蜜环菌素类成分解析
如表3所示，本实验从榛蘑中分离鉴定出16种蜜环菌素和5种疑似蜜环菌素碎片，其中液态菌丝体和野生榛蘑子实体同有成分有8种：化合物1、3～5、7、12，碎片A、B，菌丝体独有成分有10种：化合物6、9、10、13～18，碎片C，子实体独有成分有3种：化合物19、碎片D和E。杨峻山等[23]对液态丝体中蜜环菌素的质谱进行研究，解析其化学结构与质谱裂解方式关系，将本实验所呈现的结果与其进行比对后发现碎片A、B、C、D、E均有出现，对其进行部分裂解方式还原推导。化学结构式如图8所示。
表 3 蜜环菌素类化合物分析结果Table 3. Results of Melleolide compounds analysisNO. 化合物 离子
模式化学式 分子量+/- 保留时间
（min）菌丝体峰
面积+/-菌丝体相对浓
度+/-（µg/mL）子实体峰
面积+/-子实体相对浓
度+/-（µg/mL）1 蜜环菌甲素 + C24H30O6 414.20421 11.911 416709065 1.319 439872767 1.584 2 碎片A + C9H10O4 182.05801 12.971 138760682 0.439 14108978 0.051 3 蜜环菌癸素 + C24H30O6 414.20419 12.305 106225970 0.336 159325636 0.574 4 melleolide B - C24H32O7 432.21529 12.611 54350496.1 0.172 2878460 0.010 5 蜜环菌丁素 + C24H28O5 396.19364 12.971 44566661.5 0.141 3961758.7 0.014 6 10-dehydroxymelleoloede - C24H32O6 416.22035 14.794 42204080.5 0.134 0 0 7 4-Methyoxymelleolide + C24H30O6 414.20421 11.538 27128532.5 0.086 20727571 0.075 8 碎片B + C9H7ClO3 198.00854 13.108 26164975.6 0.083 4221072.7 0.015 9 蜜环菌辛素 - C24H30O7 430.1996 12.388 23292384.8 0.074 0 0 10 Arnamiol - C24H31ClO6 450.1814 15.102 22623958 0.072 0 0 11 碎片C + C9H10O4 182.058 12.622 20770352.6 0.066 0 0 12 6’-Dechloroarnamial + C24H30O6 414.20418 12.77 19754775.9 0.063 38897385 0.140 13 蜜环菌壬素 - C24H29ClO7 464.16093 13.505 14907736.5 0.047 0 0 14 A52a - C24H31ClO6 450.1816 13.912 9262806 0.029 0 0 15 4-dehydroxyarmillarin + C24H30O5 398.20943 14.8 8452258.19 0.027 0 0 16 蜜环菌丙素 + C24H27ClO5 430.15499 13.104 6893854.01 0.022 0 0 17 （4R,5S,7R,9S,13R）-2’，
5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin+ C24H28O5 396.19362 12.632 6376315.28 0.020 0 0 18 4’-demethoxyarmillaribin - C23H26O5 382.17854 14.213 2690301.77 0.009 0 0 19 Melledonal - C23H28O8 432.17875 11.193 0 0 4386967.5 0.016 20 碎片D + C9H9O2 149.05263 2.239 0 0 528174756 1.902 21 碎片E + C9H8O3 164.04759 1.22 0 0 43206518 0.156 液态菌丝体提取物中蜜环菌素类总量约为2.551 µg/mL，碎片总含量约为0.588 µg/mL，其中蜜环菌甲素含量最高，约为1.319 µg/mL，碎片A次之，约为0.439 µg/mL；子实体提取物中蜜环菌素类总量约为2.413 µg/mL，碎片总含量约为 2.124 µg/mL，其中碎片D的含量最高，约为1.902 µg/mL，蜜环菌甲素次之，约为1.584 µg/mL。从表中数据可以分析出液态菌丝体提取物种类和蜜环菌素含量都优于野生子实体提取物，且10-dehydroxymelleoloede、蜜环菌辛素、Arnamiol、蜜环菌壬素、A52a、4-dehydroxyarmillarin、蜜环菌丙素、（4R,5S,7R,9S,13R）-2’,5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin、4’-demethoxyarmillaribin都只在菌丝体中有检测出。程显好等[24]对榛蘑菌丝体和子实体进行蜜环菌素类的HPLC-DAD检测分析，发现只有菌丝体检测图谱上存在蜜环菌素类吸收峰，并猜测可能是由于蜜环菌素在子实体中含量低于可检测水平而未检测出，也证明了榛蘑菌丝体中的蜜环菌素类成分高于子实体的，且差异明显。
与张珊珊等[25-26]对榛蘑菌丝体进行超声波提取相比，本实验利用超声波细胞破碎辅助石油醚萃取榛蘑菌丝体中蜜环菌素成分新增了0.086 µg/mL 4-Methyoxymelleolide、0.072 µg/mL Arnamiol、0.063 µg/mL 6’-Dechloroarnamial。其中Arnamiol能起到抑制人白血病T细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人急性淋巴白血病细胞、人结肠癌HCT-116细胞作用，对癌细胞存在毒性[27-28]。蜜环菌素具有抗菌活性和对癌细胞的细胞毒性[29]，能作为癌症治疗或辅助治疗的潜在候选药物。
3. 结论
本研究利用超声波细胞破碎仪，以东北榛蘑子实体及其分离所得母体菌株在液态培养下的菌丝体为研究对象，获得了优化的提取工艺为料液比1:20 g/mL，超声波功率300 W，超声时间20 min，溶剂回流时间50 min，该条件下液态菌丝体提取物得率为26.8%，蜜环菌素含量0.74 mg/g；采用UHPLC-MS/MS技术对榛蘑菌丝体提取物和子实体提取物的组分进行检测分析，得出榛蘑菌丝体提取物种类及含量都优于子实体提取物，且10-dehydroxymelleoloede、蜜环菌辛素、Arnamiol、蜜环菌壬素、A52a、4-dehydroxyarmillarin、蜜环菌丙素、(4R,5S,7R,9S,13R)-2’,5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin、4’-demethoxyarmillaribin都只在菌丝体中有检测出。对液态菌丝体提取物成分的深入研究，为寻找新化合物，辅助抗癌新型药物的开发或降低化疗药物对机体的损伤，开发辅助功能食品提供了新资源。
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图 2 榛蘑野生子实体、液态菌丝体及粉末形态
注：A，野生榛蘑子实体；B，野生子实体粉末；C，母体纯菌株培养菌丝体；D，液态培养菌丝体粉末。
Figure 2. Wild fruiting body, liquid mycelium, and powder of Armillaria mellea
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图 3 料液比对菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响
Figure 3. Effect of solid-liquid ratio on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides
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图 4 超声波功率对榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响
Figure 4. Effect of ultrasonic power on the yield of Armillaria mellea extracts and the content of Melleolides
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图 5 超声波时间对榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响
Figure 5. Effects of ultrasonic time on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides
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图 6 溶剂回流时间对榛蘑菌丝提取物得率及其中蜜环菌素含量的影响
Figure 6. Effect of solvent reflux time on yield of Armillaria mellea extract and the content of Melleolides
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图 7 UHPLC-MS/MS分析榛蘑菌丝体、子实体提取物得到的一级总离子流图
注：A+，菌丝体正离子模式；A−，菌丝体负离子模式；B+，子实体正离子模式；B−，子实体负离子模式。
Figure 7. First-order total ion chromatograms obtained from UHPLC-MS/MS analysis of Armillaria mycelium and fruit body extracts
表 1 L9（34）正交实验因素水平设计
Table 1 L9 (34) Orthogonal experimental design factor level table
因素 因素 A料液比
（g/mL）B超声波功率
（W）C超声波时间
（min）D溶剂回流时间
（min）1 1:15 250 15 30 2 1:20 300 20 50 3 1:25 350 25 70 
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表 2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
实验号 A料液比
（g/mL）B超声波
功率（%）C超声波
时间（min）D溶剂回流
时间（min）蜜环菌素
含量（mg/g）1 1 1 1 1 0.235 2 1 2 2 2 0.615 3 1 3 3 3 0.250 4 2 1 2 3 0.480 5 2 2 3 1 0.340 6 2 3 1 2 0.315 7 3 1 3 2 0.280 8 3 2 1 3 0.300 9 3 3 2 1 0.265 K1 1.1 0.995 0.85 0.84 K2 1.135 1.255 1.36 1.21 K3 0.845 0.83 0.87 1.03 R 0.29 0.425 0.49 0.37 k1 0.366667 0.331667 0.283333 0.280000 k2 0.378333 0.418333 0.453333 0.403333 k3 0.281667 0.276667 0.290000 0.343333 r 0.096667 0.141667 0.163333 0.123333 因素主次 C>B>D>A 优方案 C2B2D2A2
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表 3 蜜环菌素类化合物分析结果
Table 3 Results of Melleolide compounds analysis
NO. 化合物 离子
模式化学式 分子量+/- 保留时间
（min）菌丝体峰
面积+/-菌丝体相对浓
度+/-（µg/mL）子实体峰
面积+/-子实体相对浓
度+/-（µg/mL）1 蜜环菌甲素 + C24H30O6 414.20421 11.911 416709065 1.319 439872767 1.584 2 碎片A + C9H10O4 182.05801 12.971 138760682 0.439 14108978 0.051 3 蜜环菌癸素 + C24H30O6 414.20419 12.305 106225970 0.336 159325636 0.574 4 melleolide B - C24H32O7 432.21529 12.611 54350496.1 0.172 2878460 0.010 5 蜜环菌丁素 + C24H28O5 396.19364 12.971 44566661.5 0.141 3961758.7 0.014 6 10-dehydroxymelleoloede - C24H32O6 416.22035 14.794 42204080.5 0.134 0 0 7 4-Methyoxymelleolide + C24H30O6 414.20421 11.538 27128532.5 0.086 20727571 0.075 8 碎片B + C9H7ClO3 198.00854 13.108 26164975.6 0.083 4221072.7 0.015 9 蜜环菌辛素 - C24H30O7 430.1996 12.388 23292384.8 0.074 0 0 10 Arnamiol - C24H31ClO6 450.1814 15.102 22623958 0.072 0 0 11 碎片C + C9H10O4 182.058 12.622 20770352.6 0.066 0 0 12 6’-Dechloroarnamial + C24H30O6 414.20418 12.77 19754775.9 0.063 38897385 0.140 13 蜜环菌壬素 - C24H29ClO7 464.16093 13.505 14907736.5 0.047 0 0 14 A52a - C24H31ClO6 450.1816 13.912 9262806 0.029 0 0 15 4-dehydroxyarmillarin + C24H30O5 398.20943 14.8 8452258.19 0.027 0 0 16 蜜环菌丙素 + C24H27ClO5 430.15499 13.104 6893854.01 0.022 0 0 17 （4R,5S,7R,9S,13R）-2’，
5-epoxy-4-dehydroxyarmillarin+ C24H28O5 396.19362 12.632 6376315.28 0.020 0 0 18 4’-demethoxyarmillaribin - C23H26O5 382.17854 14.213 2690301.77 0.009 0 0 19 Melledonal - C23H28O8 432.17875 11.193 0 0 4386967.5 0.016 20 碎片D + C9H9O2 149.05263 2.239 0 0 528174756 1.902 21 碎片E + C9H8O3 164.04759 1.22 0 0 43206518 0.156
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