Effects and Mechanism of Ethanol Extract of Mulberry Fruit Powder on Aging of Caenorhabditis elegans
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摘要: 目的：探究桑椹果粉乙醇提取液对秀丽隐杆线虫动物模型（Caenorhabditis elegans，C. elegans，线虫）抗衰老的作用机制。方法：研究桑椹果粉乙醇粗提取液（Mulberry ethanol extract，MEE）对线虫刺激后，其寿命、抗热应激、运动能力、吞咽能力、生殖能力的变化，同时进行了线虫体的SOD活力、CAT活力及抗衰老基因转录水平等研究。结果：与对照组相比，用5 mg/mL的MEE刺激线虫后使剂量组最长寿命极显著增加了22.24%（P<0.01）、显著提高了线虫运动能力和抗热应激能力（P<0.05），使吞咽能力提升了30.43%且不显著影响线虫的生殖能力（P>0.05），同时在该刺激下线虫体内的SOD、CAT酶活力分别增加了21.44和13.84 U/mg prot，氧化应激反应阈值降低。经5 mg/mL的MEE处理后，抗氧化基因sir-2.1、skn-1表达水平分别上调了45.70%和51.73%，胰岛素基因daf-16表达水平上调161.63%、daf-2表达水平下调57.10%，寿命和抗压力、热冲击性能的关键调节基因hsp-16.2、hsf-1表达水平分别上调了121.13%和41.07%。结论：桑椹果粉乙醇提取液通过增强线虫体内SOD、CAT的活力，上调体内各组基因的表达水平达到抗衰老的作用。Abstract: Objective: To investigate the mechanism of anti-aging effect of ethanolic extract of mulberry fruit powder on the animal model of Caenorhabditis elegans (C. elegans, nematode). Methods: To study the changes in longevity, resistance to heat stress, motility, swallowing ability and reproductive ability of nematodes after stimulation with mulberry ethanol extract (MEE). And SOD activity, CAT activity and transcript levels of anti-aging genes in nematode bodies were also investigated. Results: When the nematodes were stimulated with 5 mg/mL of MEE, the maximum lifespan extremely significantly increased by 22.24% compared to the control group (P<0.01), significantly improved the nematode motility and resistance to heat stress (P<0.05), and did not affect the reproductive capacity of the nematodes (P>0.05) when the swallowing capacity was improved by 30.43% compared to the control group. Meanwhile, the results showed that the enzymatic activity of SOD and CAT enzymes in nematodes increased by 21.44 and 13.84 U/mg prot, respectively, reducing the threshold of oxidative stress response. After treatment with 5 mg/mL of MEE, the expression levels of antioxidant genes sir-2.1 and skn-1 were up-regulated by 45.70% and 51.73%, respectively, and the expression levels of insulin genes daf-16 were up-regulated by 161.63% and daf-2 were down-regulated by 57.10%. The expression levels of hsp-16.2 and hsf-1, key regulators of life span and resistance to stress and thermal shock, were up-regulated by 121.13% and 41.07%. Conclusion: The ethanolic extract of mulberry fruit powder achieved anti-aging effects by enhancing the activity of SOD and CAT in nematodes and up-regulating the expression levels of various groups of genes in vivo.
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人体对环境的生理和心理适应能力降低，从而逐渐趋于死亡的现象，称为衰老。随着全球人口老龄化进程加剧，研究预防抗衰老和加强抗衰老治疗已成为各个领域的研究热点话题，同时也成为人们最关心的健康问题[1-2]。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种理想的模式生物，其作为研究模型具有易于培养、周期短、易于观察、成本低等特点。研究发现，秀丽隐杆线虫是一种多细胞真核生物，其约有65%的基因与人类有关。同时，还有12条与人体相同的信号通路，其中大部分与人体的营养代谢密切相关，这使C. elegans成为食品营养评价中的优秀模型[3-4]。
桑椹（Fructus mori）又名桑果、葚子，是桑科植物桑树的成熟果穗，成熟后呈长椭圆状。大量研究证明在桑椹中含有多种游离酸和氨基酸，富含人体缺少的锌、铁、钙、锰等微量元素，以及桑椹多糖、黄酮、多酚、花青素等生物活性物质[5-6]，是“药食同源”农产品之一，被赋予“第三代水果”的称号[7-8]。研究表明桑椹具有良好的抗氧化及抗衰老作用。桑椹中的花青素、多糖、多酚类物质是良好的天然自由基清除剂，可以有效地清除新陈代谢产生的有害自由基避免损害体内的生物大分子[9-10]。刘凡等[11]研究发现桑椹提取液能降低小鼠血清、肝脏、脑组织及心脏中的MDA含量，提高小鼠血清、肝脏、脑组织和心脏中的T-SOD活性，同时提高血清、肝脏和心脏中的CAT活性，降低肝脏和脑组织的MAO活性，表现出一定的延缓衰老作用。江岩[12]研究发现用桑椹花青素刺激果蝇，随着浓度升高，果蝇寿命延长，雌雄果蝇体内的GSH-Px、SOD及CAT活力明显升高、MDA含量明显下降，具有一定的抗衰老作用。桑椹作为一种特殊的水果，保质期极短加工成本高，将桑椹制成果粉可以极大地延长桑椹的保质期且方便运输和加工，而对于桑椹果粉的生物活性研究还未见报道，本研究首次将秀丽隐杆线虫模型引入桑椹的抗衰老活性研究中。对于明确桑椹果粉生物活性，以果粉为原料开发产品延长桑椹产业链有着重要作用。
因此，本文选取桑椹乙醇提取液（Mulberry ethanol extract，MEE）为材料，以秀丽隐杆线虫为模型，研究其对线虫衰老的影响，并探讨其作用机制，为以桑椹果粉为原料进行进一步的开发利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
德昌“德果一号”桑椹 四川凉山德昌桑椹自贸中心，采自3月中下旬；N2型秀丽隐杆线虫 秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis elegans Genetics Center）；OP50（尿嘧啶缺陷型大肠杆菌Escherichia coli） 西华大学食品重点实验室提供；超氧化歧酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）试剂盒 购自南京建成生物研究所；蛋白胨、琼脂粉、NaCl、CaCl2、PBS缓冲液、MgSO4·7H2O、酵母提取液、胆固醇 北京奥博星生物技术有限公司；乙醇、NaClO、M9缓冲液、NaOH 成都市科龙化学品有限公司；麦芽糊精 山西隆特酶制有限公司（以上试剂均为分析纯）。
DHP-9082恒温生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；Spectra Max-i3x多功能酶标仪 美谷分子仪器有限公司；GI54DWS全自动高压灭菌锅 致微（厦门）有限公司；TD-5M台式离心机 四川蜀科仪器有限公司；FDU-1200冻干机 东京理化器械有限公司；907型超低温冰箱 赛默飞世尔科技有限公司AK-100SD超声机 深圳钰洁清洗设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 桑椹果粉乙醇提取液（MEE）的制备
桑椹果粉的制备：采取樊晓静等[13]制备紫薯粉的方法，稍作改进。取德昌“德果一号”桑椹（含水率6.28%）50 g去蒂洗净后，按1:4 g/mL的料液比复水后加入3%麦芽糊精（助冻干剂，增稠）匀浆，经−80 ℃超低温预冻12 h后放入冻干机−40 ℃干燥24 h得到桑椹果粉。
MEE的制备：按照迟东泽等[14]制备鹿茸乙醇提取液的方法，稍作改进。取桑椹果粉25 g按照1:20g/mL的比例加入70%乙醇溶液浸溶，40 ℃下300 W进行超声提取，60 min后抽滤，在抽滤后过滤出剩余的滤液10000 r/min离心10 min取上清液体。将上清液经旋转蒸发浓缩至原体积的四分之一后转移到试剂瓶中，摇匀，备用。
1.2.2 线虫生长培养基（NGM）的制备
NGM的配制[15]：取17.0 g琼脂粉、1 mL 5.0 mg/mL胆固醇乙醇溶液、3.0 g NaCl、2.50 g蛋白胨于1000 mL容量瓶内，后加入25.0 mL 1 mol/L的PBS缓冲液、1.0 mL 1 mol/L的CaCl2、1.0 mL 1 mol/L的MgSO4混匀加水，定容，摇匀，备用，121 ℃灭菌15 min，待温度降至室温，倒入培养皿中冷却、备用。
1.2.3 秀丽隐杆线虫的同期化培养
C. elegans的同期化培养[16]：采用次氯酸钠裂解法并稍作改进，用20 mL M9缓冲液将培养基中的线虫冲洗至离心管中振荡后静置，弃掉上清液，后再加入1 mL 1 mol/L NaClO、1 mL 1 mol/L NaOH，后以3000 r/min离心2 min，废弃上清液，再每次加入2 mL M9缓冲液冲洗，重复冲洗三次后得到的沉淀即为线虫卵，将虫卵转移到含有OP50的NGM中在20 ℃的恒温下培养2 d，得到同期化成虫（L4）。
1.2.4 剂量组和对照组NGM的配制
剂量组NGM配制方法同1.2.2，加入桑椹果粉提取液后，分别配制成1 mg/mL（低剂量组，LD）、 2.5 mg/mL（中剂量组，MD）、5 mg/mL（高剂量组，HD）的剂量组NGM[17]，对照组NGM的配制方法同1.2.2，加入等量的蒸馏水，配制成对照组（BC组）NGM。
1.2.5 线虫寿命的测定
随机挑取90只健康L4线虫，分别加入剂量组和BC组NGM中。实验当天记为第0 d，在20 ℃下恒温培养（每48 h进行转板，转移至新的对应浓度的培养基中），观察线虫存活情况。实验持续至最后一条线虫死亡为止，整理数据进行统计[18]。
线虫存活判断标准：以铂丝轻碰线虫头部10 s后是否有反应。
1.2.6 线虫抗热应激能力测定
随机挑取90只健康L4线虫，分别加入剂量组和BC组NGM中。20 ℃培养48 h后，转移至35 ℃下恒温培养，每隔1 h观察存活情况，实验持续至最后一条线虫死亡为止[19]。
1.2.7 线虫运动能力测定
随机挑取若干只健康L4线虫，分别加入剂量组和BC组NGM中。20 ℃恒温培养（每48 h进行转板，转移至新的对应浓度的培养基中），各组挑取10只运动状态相当的线虫于新培养基中显微镜下观察其在第0、4、8、12、16 d时的运动能力作为评价指标。其中不需要外界刺激可自由活动的归为①类，经外界刺激可自由活动的归为②类，经外界刺激仅可活动头尾的归为③类[20]，统计各组线虫数量。
1.2.8 线虫吞咽能力测定
随机挑取若干只健康L4线虫，分别加入剂量组和BC组NGM中。20 ℃恒温培养（每48 h进行转板，转移至新的对应浓度的培养基中），各组随机挑选10只存活的线虫于显微镜下观察其在第1、2、3、4、5 d时1 min内的吞咽次数[21]，并进行统计。
1.2.9 线虫生殖能力测定
随机挑取10只运动状态优良L4线虫分别加入剂量组和BC组NGM中，每组5个培养皿，每个培养皿放置一只线虫，5 d（在第3 d进行转板，转移至新的对应浓度的培养基中）后观察到每个培养基上的线虫数目即为产卵数目并进行统计。
1.2.10 线虫体内抗氧化酶活力测定
随机挑取若干只健康L4线虫至剂量组和BC组NGM平板中产卵3 h，然后将成年线虫挑走，得到虫卵L1，于20 ℃下恒温培养5 d（在第3 d进行转板，转移至新的对应浓度的培养基中）。收集各实验组和对照组的成年线虫按照试剂盒所述的方法测定SOD活力和CAT活力[22]。
1.2.11 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
随机挑取若干只健康L4线虫至含有BC组、HD组NGM平板中产卵3 h，然后将成年线虫挑走，得到虫卵L1，于20 ℃下恒温培养5 d（在第3 d进行转板，转移至新的对应浓度的培养基中）。收集各实验组和对照组的成年线虫，按试剂盒方法提取RNA。测定基因sir-2.1、skn-1、hsp-16.2、daf-16、daf-2、hsf-1的转录水平，以cdc-42基因为内参。使用2－ΔΔCt法对表达基因进行相对定量，各基因引物序列设置如表1。
表 1 待测基因的引物序列Table 1. Primer sequence of the gene to be tested引物名称 序列（5’-3’） sir-2.1-F CCCATTTTACAAGTCGATGG sir-2.1-R CTTCCTCTGCAGTTTTTCCA skn-1-F CGTCCAACCACATCATCTC skn-1-R TCGGCTTTTTGAGTTGGATGT daf-16-F CTAACTTCAAGCCAATGCCACTA daf-16-R TCCAGCTTGACTCAGCTCATGTC hsp-16.2-F GGTGCAGTTGCTTCGAATCTT hsp-16.2-R TCTTCCTTGAACCGCTTCTTTC daf-2-F GTTGATAATGCTGCCGAG daf-2-R ATCCCGGTCCGATTTCTT hsf-1-F TTTGCATTTTCTCGTCTCTGTC hsf-1-R TCTATTTCCAGCACACCTCGT cdc-42-F CTGCTGGACAGGAAGATTACG cdc-42-R CTCGGACATTCTCGAATGAAG 1.3 数据处理
试验均独立重复3次。采用Graphpad prism 9.0作图，用One-way ANOVA进行统计分析，试验结果采用均值±标准差（a±b）表示，P<0.05表示存在显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 桑椹果粉乙醇提液对线虫寿命的影响
秀丽线虫的寿命长短是反映其衰老情况最直观的一个指标，也是抗衰老研究中必选的指标之一[23]。本试验测定了不同浓度MEE对秀丽线虫寿命的影响，对其寿命中位数、平均寿命、最长寿命进行分析，结果如图1、表2，可以看出三个剂量组的寿命曲线相较于BC组均有右移，说MEE对线虫寿命有一定的延长功效。LD组平均存活15.12 d，MD组平均存活16.09 d，HD组平均存活16.72 d，分别较BC组增加了10.04%、17.10%、21.69%，中位寿命分别提高了1.33、2.33、3.67 d，最大寿命分别提高了1.67、3.00、4.67 d。剂量组线虫平均寿命、中位寿命、最长寿命与BC组相比均具有显著差异（P<0.05，P<0.01）且呈一定的剂量依赖性。以上分析说明桑椹果粉乙醇提取液能够一定程度地延长线虫的寿命。
表 2 桑椹果粉乙醇提取液对线虫寿命的影响Table 2. The effect of MEE on the longevity of nematodes指标 组别 BC LD MD HD 平均寿命（d） 13.74±0.36 15.12±0.68* 16.09±0.53** 16.72±0.78** 中位寿命（d） 14.00±0.58 15.33±0.58* 16.33±1.15** 17.67±0.58** 最长寿命（d） 21.00±0.00 22.67±0.58* 24.00±0.00** 25.67±1.58** 死亡数 30/30 30/30 30/30 30/30 注：试验数据均以“平均值±标准差”表示；*表示剂量组与BC组间存在显著差异（P<0.05），**表示剂量组与BC组间存在极显著差异（P<0.01）。 2.2 桑椹果粉乙醇提液对线虫抗热应激性的影响
高温可导致生物体内ROS（活性氧簇）水平增加，破坏自由基稳定，引起氧化应激，进而引起衰老[24]。秀丽线虫的耐热能力也是考察抗衰老能力的一个重要指标，抗衰老能力与抗热应激能力呈正相关[25]。本试验测定了35 ℃下不同浓度MEE对秀丽线虫抗热应激能力的影响，结果如图2所示，可以看出三个剂量组的存活时长曲线相较于BC组均有右移，说明线虫的抗热应激能力得到提升。LD组、MD组、HD组较BC组最大存活时长分别显著增加了2、4、4 h（P<0.05）。抗热应激能力明显升高且呈一定的剂量依赖性。
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图 2 桑椹果粉乙醇提取液对线虫抗热应激能力的影响注：不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。Figure 2. The effect of MEE on the heat stress resistance of nematodes2.3 桑椹果粉乙醇提液对线虫运动能力的影响
衰老可导致肌肉退化，线虫的运动能力直观反映了其生存状态，运动能力与年龄呈明显的反比关系，是评价抗衰老的重要指标之一[26]。本试验测定了不同浓度MEE对秀丽线虫运动能力的影响，对其第0、4、8、12、16 d运动能力进行分析，结果如图3，可以看出0~4 d剂量组与BC组线虫的运动状态近乎相同没有明显差异，到第12 d后BC组②③类线虫数量明显增多，各剂量组①类线虫数量远远大于BC组。到第16 d后BC组无线虫能自主活动，各剂量组仍有部分线虫能保持自主运动，相较于BC组，剂量组线虫运动能力明显增强。以上分析表明桑椹果粉乙醇提取液能提高秀丽线虫的运动能力。
2.4 桑椹果粉乙醇提液对线虫吞咽能力的影响
线虫的吞咽能力反映了线虫对药品的摄入能力及活动能力，与衰老状况呈负相关，本试验测定了不同MEE对秀丽线虫吞咽能力的影响，结果如图4、表3，可以看出三个剂量组的吞咽次数曲线相较于BC组均有明显上移，说明MEE增强了线虫的吞咽功能。BC组平均吞咽次数为第1 d 147.72次/min、第2 d 140.30次/min、第3 d 129.33次/min、第4 d 107.40次/min、第5 d 99.25次/min；LD组平均吞咽次数相较于BC组整体平均提升了13.91%；MD组平均吞咽次数相较于BC组整体平均提升了20.61%；HD组平均吞咽次数相较于BC组整体平均增加了30.43%。剂量组线虫吞咽次数与BC组相比均具有显著差异（P<0.05）且呈一定剂量依赖性。以上分析说明桑椹果粉乙醇提取液能够一定程度增强线虫吞咽能力。
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图 4 桑椹果粉乙醇提取液对线虫吞咽能力的影响Figure 4. The effect of MEE on swallowing ability of nematodes表 3 桑椹果粉乙醇提取液对线虫吞咽能力的影响（次/min）Table 3. The effect of MEE on swallowing ability of nematodes (times/min)天数（d） 组别 BC LD MD HD 1 147.72±1.21 167.50±2.70*a 175.83±3.03*b 192.33±6.14*c 2 140.30±3.82 160.47±3.63*a 168.53±2.72*a 180.57±1.58*b 3 129.33±3.12 147.47±4.31*a 152.07±5.15*a 160.13±5.28*b 4 107.40±2.21 127.70±3.24*a 137.50±3.84*a 147.53±5.94*b 5 99.25±1.46 108.07±4.20*a 117.46±4.34*b 126.53±5.58*c 注：试验数据均以“平均值±标准差”表示；*表示BC组与LD组间存在显著差异（P<0.05）；同行不同字母代表各剂量组间存在显著性差异（P<0.05）。 2.5 桑椹果粉乙醇提液对线虫生殖能力的影响
有报道指出许多生物寿命的延长与生殖能力呈反比关系，王艳菊[27]在研究中发现原花青素在延长线虫寿命的同时降低了线虫的生殖能力，但黄少杰等[28]在研究中发现铁皮石斛多糖在延长线虫寿命的同时不影响线虫的生殖能力。本试验测定了不同剂量MEE对秀丽线虫生殖能力的影响，结果如图5，可以看出三个剂量组的产卵数相较于BC组均无显著变化（P>0.05）。以上分析说明桑椹果粉乙醇提取液可在延长线虫寿命的情况下不影响线虫的生殖能力。
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图 5 桑椹果粉乙醇提取液对线虫生殖能力的影响注：ns表示各组间不存在显著性差异（P>0.05）。Figure 5. The effect of MEE on the reproductive ability of nematodes2.6 线虫体内抗氧化酶活力测定结果
SOD、CAT酶是线虫体内主要的抗氧化酶，线虫体内的抗氧化酶可以清除线虫体内多余的自由基达到促进体内平衡延长寿命的目的[29]。
本试验测定了不同剂量MEE对秀丽线虫体内SOD、CAT活力的影响，结果如图6，可以看出三个剂量组SOD、CAT活力相较于BC组均有提升。在SOD实验中LD、MD、HD组相较于BC组活力增加了6.03、15.28、21.44 U/mg prot，在CAT实验中，LD、MD、HD组相较于BC组活力增加了7.51、9.95、13.84 U/mg prot。剂量组线虫SOD、CAT活力与BC组相比均有提升，具有显著差异（P<0.05）且呈一定剂量依赖性。以上分析说明桑椹果粉乙醇提取液可有效提高线虫抗氧化能力，提升线虫抗氧化应激能力达到延长寿命的目的。
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图 6 桑椹果粉乙醇提取液对线虫SOD、CAT活力的影响注：*表示剂量组与BC组间存在显著差异（P<0.05），**表示剂量组与BC组间存在极显著差异（P<0.01）；图7同。Figure 6. The effect of MEE on SOD and CAT activities of nematodes2.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定结果
本试验研究MEE（HD组）对秀丽线虫体内基因的影响，结果如图7，可以看出HD组所测的六组基因除daf-2相较于BC组均有提升。HD组相较于BC组sir-2.1转录水平提升了45.70%；skn-1转录水平提升了51.73%，sir-2.1、skn-1同为抗氧化基因，表达水平会随着抗氧化能力的上升而增加，抗氧化基因表达水平的上升表明抗氧化能力的上升[30]。daf-16转录水平提升了161.63%；daf-2转录水平降低了57.10%，daf-2、daf-16同属于IIS信号通路，daf-2的表达水平会随着寿命的增加而降低，daf-16表达水平会随着寿命的增加而增加[31-32]，IIS信号通路是研究衰老模型的经典信号通路，daf-16是线虫体内提高应激抵抗及代谢基因表达的重要转录因子，可在一定程度上延长寿命。其作用机制胰岛素信号通路的激活引起一系列磷酸化级联反应，最终导致FOXOS/daf-16核转录因子排出细胞核失活[33]。hsp-16.2转录水平提升了121.13%；hsf-1提升了41.07%（P<0.05），热休克蛋白中的hsp-16.2、hsf-1同为抗热性基因，表达水平的上升表明抗热性能力的上升[34]。以上分析说明桑椹果粉乙醇提取液可改变线虫体内基因的表达水平，达到延长寿命的目的。
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图 7 桑椹果粉乙醇提取液对线虫基因转录水平的影响Figure 7. The effect of MEE on gene transcription of nematode3. 结论
本试验通过利用秀丽隐杆线虫为研究模型，研究了桑椹果粉乙醇提取液对线虫衰老进程的影响，并对其作用机制做了初步探究。试验结果表明，桑椹果粉提取液能显著提升线虫的寿命（P<0.05），并使线虫的运动能力、抗应激能力、吞咽能力得到显著提升（P<0.05），且不显著影响线虫的生殖能力（P>0.05），同时显著增加线虫体内SOD、CAT的活力（P<0.05），提升抗氧化应激能力。试验表明，MEE能显著提升daf-16表达水平、显著降低daf-2表达水平（P<0.05），达到延长寿命的目的。在线虫体内，sir-2.1及其下游因子skn-1是调控机体氧化应激的重要转录因子，同样受IIS信号通路的调控[35]，结果表明桑椹果粉提取液能显著提升sir-2.1及其下游因子skn-1的表达水平（P<0.05）。hsp-16.2、hsf-1是线虫体内寿命和抗压力、热冲击性能的关键调节因子，结果表明桑椹果粉提取液能显著提升hsp-16.2、hsf-1的表达水平（P<0.05）。
综上，本研究结果表明桑椹果粉乙醇提取液对秀丽隐杆线虫有延缓衰老的功效，为之后以桑葚果粉为母体开发一系列具有抗衰老功效的产品奠定了基础。
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图 2 桑椹果粉乙醇提取液对线虫抗热应激能力的影响
注：不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。
Figure 2. The effect of MEE on the heat stress resistance of nematodes
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图 4 桑椹果粉乙醇提取液对线虫吞咽能力的影响
Figure 4. The effect of MEE on swallowing ability of nematodes
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图 5 桑椹果粉乙醇提取液对线虫生殖能力的影响
注：ns表示各组间不存在显著性差异（P>0.05）。
Figure 5. The effect of MEE on the reproductive ability of nematodes
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图 6 桑椹果粉乙醇提取液对线虫SOD、CAT活力的影响
注：*表示剂量组与BC组间存在显著差异（P<0.05），**表示剂量组与BC组间存在极显著差异（P<0.01）；图7同。
Figure 6. The effect of MEE on SOD and CAT activities of nematodes
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图 7 桑椹果粉乙醇提取液对线虫基因转录水平的影响
Figure 7. The effect of MEE on gene transcription of nematode
表 1 待测基因的引物序列
Table 1 Primer sequence of the gene to be tested
引物名称 序列（5’-3’） sir-2.1-F CCCATTTTACAAGTCGATGG sir-2.1-R CTTCCTCTGCAGTTTTTCCA skn-1-F CGTCCAACCACATCATCTC skn-1-R TCGGCTTTTTGAGTTGGATGT daf-16-F CTAACTTCAAGCCAATGCCACTA daf-16-R TCCAGCTTGACTCAGCTCATGTC hsp-16.2-F GGTGCAGTTGCTTCGAATCTT hsp-16.2-R TCTTCCTTGAACCGCTTCTTTC daf-2-F GTTGATAATGCTGCCGAG daf-2-R ATCCCGGTCCGATTTCTT hsf-1-F TTTGCATTTTCTCGTCTCTGTC hsf-1-R TCTATTTCCAGCACACCTCGT cdc-42-F CTGCTGGACAGGAAGATTACG cdc-42-R CTCGGACATTCTCGAATGAAG 
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表 2 桑椹果粉乙醇提取液对线虫寿命的影响
Table 2 The effect of MEE on the longevity of nematodes
指标 组别 BC LD MD HD 平均寿命（d） 13.74±0.36 15.12±0.68* 16.09±0.53** 16.72±0.78** 中位寿命（d） 14.00±0.58 15.33±0.58* 16.33±1.15** 17.67±0.58** 最长寿命（d） 21.00±0.00 22.67±0.58* 24.00±0.00** 25.67±1.58** 死亡数 30/30 30/30 30/30 30/30 注：试验数据均以“平均值±标准差”表示；*表示剂量组与BC组间存在显著差异（P<0.05），**表示剂量组与BC组间存在极显著差异（P<0.01）。
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表 3 桑椹果粉乙醇提取液对线虫吞咽能力的影响（次/min）
Table 3 The effect of MEE on swallowing ability of nematodes (times/min)
天数（d） 组别 BC LD MD HD 1 147.72±1.21 167.50±2.70*a 175.83±3.03*b 192.33±6.14*c 2 140.30±3.82 160.47±3.63*a 168.53±2.72*a 180.57±1.58*b 3 129.33±3.12 147.47±4.31*a 152.07±5.15*a 160.13±5.28*b 4 107.40±2.21 127.70±3.24*a 137.50±3.84*a 147.53±5.94*b 5 99.25±1.46 108.07±4.20*a 117.46±4.34*b 126.53±5.58*c 注：试验数据均以“平均值±标准差”表示；*表示BC组与LD组间存在显著差异（P<0.05）；同行不同字母代表各剂量组间存在显著性差异（P<0.05）。
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