Antifungal Ability of DNA-AgNCs under Molecular Crowding and Its Application in Citrus Preservation
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摘要: 为探究分子拥挤对DNA-AgNCs抗真菌能力的影响及其对柑橘的保鲜作用，本实验先将DNA序列（5'-CCCCCCCCCCCC-3'）与AgNO3溶液混合，以50%聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）200溶液模拟分子拥挤环境，制备DNA-AgNCs。以DNA-AgNCs为研究对象，以扩展青霉、黄曲霉、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌为模型，以孢子计数法测定DNA-AgNCs对四种孢子萌发的抑制率，用微量稀释法确定DNA-AgNCs对四种真菌的最低抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。将DNA-AgNCs加入淀粉-壳聚糖基质中制备复合薄膜，通过拉伸实验、水接触角和抑菌圈实验探究其对薄膜力学性能、疏水性和抗菌性的影响，以涂膜的形式应用到柑橘保鲜，记录柑橘失重率、菌斑直径和感官评价。结果表明：分子拥挤DNA-AgNCs对孢子萌发的抑制作用优于正常DNA-AgNCs（P<0.05），MIC均在2.5 μmol/L内；加入分子拥挤DNA-AgNCs的薄膜的拉伸性能由4.729 MPa增加至7.300 MPa，断裂伸长率由51.399%增加至77.287%，水接触角由59.700°增加至66.717°，对四种真菌的抑菌圈分别为23.969、19.176、16.822和13.349 cm；将柑橘在添加分子拥挤DNA-AgNCs溶液中浸泡涂膜，于28 ℃贮藏14 d，失重率（23.8%）和病斑直径（2.3 cm）显著低于对照组（P<0.05），感官评价（52分）显著高于对照组（P<0.05）。因此，分子拥挤能够增强DNA-AgNCs的抗菌能力，所制得涂膜能很好地保持柑橘的贮藏品质。
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关键词:
- 分子拥挤 /
- DNA-AgNCs /
- 抗真菌能力 /
- 淀粉-壳聚糖复合薄膜 /
- 柑橘保鲜
Abstract: In order to investigate the effect of molecular crowding on the antifungal ability of DNA-AgNCs and its preservation effect on citrus, DNA sequence (5'-CCCCCCCCCCCC-3') was mixed with AgNO3 solution in this experiment. DNA-AgNCs was prepared by simulating molecular crowded environment with 50% Polyethylene Glycol (PEG) 200 solution. Taking DNA-AgNCs as the research object, using Penicillium expansum, Aspergillus flavus, Fusarium graminaerum and Fusarium moniliforme as the models, the inhibition rate of DNA-AgNCs on the germination of four kinds of spores was determined by spore counting method, and the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of DNA-AgNCs against four kinds of fungi was determined by microdilution method. DNA-AgNCs was added to starch-chitosan matrix to prepare composite films, and its effects on the mechanical properties, hydrophobicity and antibacterial properties of the films were explored through tensile test, water contact angle and inhibition zone test. The film was applied to citrus preservation in the form of coating film, and the weight loss rate, plaque diameter and sensory evaluation of citrus were recorded. The results showed that the inhibitory effect of molecular crowded DNA-AgNCs on spore germination was better than that of normal DNA-AgNCs (P<0.05), and the MIC was within 2.5 μmol/L. The tensile properties of the films with molecular crowded DNA-AgNCs increased from 4.729 to 7.300 MPa, the elongation at break increased from 51.399% to 77.287%, and the water contact angle increased from 59.700° to 66.717°. The inhibition zones of the four fungi were 23.969, 19.176, 16.822 and 13.349 cm, respectively. When citrus was soaked and coated in the solution supplemented with molecular crowded DNA-AgNCs and stored at 28 ℃ for 14 d, the weight loss rate (23.8%) and plaque diameter (2.3 cm) were significantly lower than those of the control group (P<0.05), and the sensory evaluation (52 points) was significantly higher than that of the control group (P<0.05). In conclusion, molecular crowding could enhance the antibacterial ability of DNA-AgNCs, and the coating film could well maintain the storage quality of citrus. -
柑橘（Citrus reticulata Blanco）是芸香科柑橘属植物，我国种植面积和产量位居世界第一，在贮藏阶段容易受到多种真菌侵染导致损失率高达20%~25%[1]。传统的保鲜包装不易降解，对环境造成严重污染，进而促进了新型可降解涂膜保鲜技术的开发。淀粉和壳聚糖因其成本低、可降解和良好的生物相容性，被广泛应用在面包[2-3]、果蔬[4-5]、肉类[6-7]等食品的包装中，但单一的淀粉-壳聚糖包装膜的抗菌能力较弱，需要引入银纳米簇（AgNCs）、纳米ZnO、植物精油等抗菌材料来增强淀粉-壳聚糖包装膜的抗菌性能。
AgNCs是直径小于2 nm的团簇，主要通过破坏细菌形态影响胞内代谢[8]，不仅对细菌有较好的抗菌效果，对白色念珠菌[9]和曲霉[10]等真菌也有较强的抗菌作用，且添加AgNCs的薄膜还能抑制荔枝[11]、甘蔗[12]采后霉菌繁殖延长货架期，对多种食物都有良好的保鲜效果[13]。但单纯的AgNCs性质不稳定，在DNA模板的加持下合成的AgNCs（DNA-AgNCs）具有稳定的荧光和抗菌性能[14]。
细胞内环境被核酸、蛋白质、多糖、小分子、各种离子等密集地占据，这种现象称为分子拥挤，分子拥挤对分子结构和细胞内各种生命活动有高效精确的调控作用[15-16]。平均分子量为200的PEG溶液（PEG 200）与核仁内的环境相似，常用来体外模拟分子拥挤[17]，以稳定DNA结构，确保DNA-AgNCs不受外界干扰[18]。加之PEG有微弱的抗菌作用[19]，因此，在DNA-AgNCs合成时加入PEG 200，可以增强DNA-AgNCs的稳定性和抗菌能力。
本研究选用PEG 200模拟胞内分子拥挤环境来合成DNA-AgNCs，以扩展青霉（Penicillium expausum）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）为模型来评估其抗真菌能力，再以淀粉和壳聚糖为基质制备复合薄膜，并通过涂膜保鲜对接种扩展青霉孢子的柑橘进行青霉病防治效果的研究，以期开发一种环境友好的柑橘保鲜涂膜。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
柑橘 购自湖北省咸丰县，果实大小均匀，成熟程度一致，无机械损伤和病害，采摘后立即运回实验室；扩展青霉、黄曲霉、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌 均为中国农业大学营养与健康系功能核酸实验室保藏；硝酸银、硼氢化钠 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸 分析纯，北京化工厂；甘油 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；壳聚糖 美国Sigma公司；食用玉米淀粉 福建古田荣昌贸易有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDB）、马铃薯葡萄糖肉汤（PDA） 上海索莱宝生物科技有限公司。
GL-3250A磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ-600VD超声仪 昆山市超声仪器有限公司；TA.HD plusC质构仪 英国Stable Micro System公司；OCA25接触角测量仪 德国Dataphysics公司；Amix荧光生物成像系统 美国Spectral Instruments Imaging公司；ELX-800多功能酶标仪 德国Biotek公司；SU5000扫描电镜 日本日立公司；DMIL LED荧光倒置显微镜 德国徕卡公司。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA-AgNCs的制备
根据Yeh等[20]的方法，将序列（5'-CCCCCCCCCCCC-3'）与AgNO3溶液混合，室温孵育30 min，然后加入新鲜配制的NaBH4溶液，振荡1 min。最终浓度为DNA 15 μmol/L，AgNO3 180 μmol/L，NaBH4 180 μmol/L，pH6.8的PB缓冲液20 mmol/L。在混合液中加入50% PEG 200溶液模拟分子拥挤环境（记为Ag+PEG），以不加PEG溶液做对照（记为Ag），使用前在4 ℃避光条件下反应12 h。
1.2.2 DNA-AgNCs的表征
将制备好的DNA-AgNCs溶液放入96孔板中测定其在350~600 nm的吸光度。将DNA-AgNCs溶液用PB缓冲液稀释10倍后，滴在喷有碳膜的铜网上，自然干燥后，使用透射电子显微镜观察其形貌以及大小。
1.2.3 DNA-AgNCs对四种真菌孢子萌发的影响
取1 mL PDB培养基至保藏的真菌平板上，晃动平板，将洗下的孢子收集到离心管中，用血球计数板计数并将孢子悬浮液终浓度调至1×106 CFU/mL，4 ℃保存备用。参考付瑞敏等[21]的方法，在10 mL PDB培养基中加入100 μL DNA-AgNCs溶液，同时加入100 μL 1×106 CFU/mL孢子悬浮液，于(28±1) ℃摇床中180 r/min培养18 h。以无菌水为空白对照组，每个处理至少观察100个孢子，实验重复3次。用荧光倒置显微镜观察孢子萌发，计算孢子萌发抑制率。
孢子萌发抑制率(%)=1−视野内萌发的孢子数视野内总孢子数×100 1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的确定
根据Espinel-Ingroff等[22]方法，将四种1×104 CFU/mL孢子悬液分别接种300 μL到96孔板中，依次加入0.25~2.75 μmol/L DNA-AgNCs溶液，在(28±1) ℃培养箱中培养3 d，用酶标仪测定570 nm处的吸光度，以无浑浊的第一个孔的浓度为MIC，实验重复3次。
1.2.5 复合薄膜的制备
根据李雪等[5]的方法稍作修改，将5%的玉米淀粉（w/w）用磁力搅拌器在90 ℃，700 r/min糊化30 min，将1%壳聚糖（w/w）溶于1%的冰醋酸（v/v）溶液中600 W超声至溶解，二者以8:2（v/v）的比例均匀混合，以60%的甘油（w/w）为增塑剂，搅拌均匀后超声，用于柑橘的涂膜，其余溶液倒入玻璃板，室温下干燥36 h，得到复合薄膜。不加DNA-AgNCs的薄膜记为S+C，加入10% DNA-AgNCs溶液（v/v）的薄膜记为S+C+Ag，加入10%分子拥挤DNA-AgNCs溶液（v/v）的薄膜记为S+C+Ag+PEG。
1.2.6 复合薄膜的表征
用扫描电镜观察和拍摄薄膜的形貌特征，薄膜先用液氮浸泡后破碎，每个样品都做喷金处理，并在1.0 kV的加速电压下操作。
力学性能按照国标GB/T 1040.1-2018[23]测定并加以改进。将复合薄膜裁成15 mm×70 mm长条，实际测量长度为55 mmol/L，测试速度为200 mm/min，每个样品重复测量3次。
用接触角测量仪测定复合薄膜与水的接触角。将10 μL的蒸馏水滴在薄膜（20 cm2）表面，测量液滴两侧的接触角，确保对称和水平，取3次测量结果的平均值。
抗真菌性能参照Spasova等[24]的方法，将四种真菌的孢子悬液调至1×106 CFU/mL，分别涂布在PDA平板上，将薄膜剪成直径10 mm的圆片，经酒精擦拭待其挥发后放置在平板表面，(28±1) ℃培养3 d，采用十字交叉法测量各处理的抑菌圈直径，每个样品重复3次。
1.2.7 复合薄膜对柑橘青霉病抑制作用的研究
1.2.7.1 柑橘处理
参照黄姣丽等[25]的方法，柑橘共分为四组，每组6个，分别记为：对照组，淀粉-壳聚糖膜处理组（S+C），加入10% DNA-AgNCs溶液（v/v）的淀粉-壳聚糖膜处理组（S+C+Ag），加入10%分子拥挤的DNA-AgNCs溶液（v/v）的淀粉-壳聚糖膜处理组（S+C+Ag+PEG）。柑橘经流水冲洗后，将三个处理组分别在三种膜溶液中浸泡1 min，对照组在无菌水中浸泡1 min，待其自然晾干后，用无菌打孔器在表面赤道处对称刺两个深2 mm、宽2 mm的伤口，在伤口表面接种10 μL 1×106 CFU/mL扩展青霉孢子悬液，将相同处理的柑橘装在一个塑料袋内，于恒温培养箱(28±1) ℃贮藏14 d，每隔2 d测量病斑直径和称重，实验重复3次，采用十字交叉法测量果实的病斑直径，失重率按照下式计算。
失重率(%)=贮藏前果实质量−测定时果实质量贮藏前果实质量×100 1.2.7.2 感官评价
根据裴少培[26]的方法稍作修改，采用综合评价的方法对柑橘进行感官评价（100分制），由10位具有感官评价经验的人组成评价小组，根据柑橘的硬度、色泽、皱缩和腐烂程度分为四个等级，重复3次，结果取平均值。感官评价标准见表1。
表 1 感官评价标准Table 1. Sensory evaluation criteria指标 评分标准 分值（分） 硬度（20分） 软硬适中，有一定弹性 15~20 质地较硬，手感粗糙 8~14 质地较软，受力易变形 0~7 外观（40分） 颜色鲜艳，有光泽 27~40 颜色较暗，果皮紧致 14~26 颜色暗淡，皱缩严重 0~13 腐烂程度（40分） 无腐烂，无异味 27~40 轻微腐烂，无明显异味 14~26 严重腐烂，异味严重，有液体流出 0~13 1.3 数据处理
采用Excel 2020软件对数据进行整理，数据以均数±标准差表示，运用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，用Origin 8.6软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 DNA-AgNCs的表征
Javani等[14]结果表明，DNA序列5'-CCCCCCCCCCCC-3'合成的DNA-AgNCs有较好的抗菌效果，加之PEG溶于水且在生物环境呈惰性[18]，且PEG 200与核仁内环境相似[15]，因此本实验选择以上述序列为模板，PEG 200体外模拟分子拥挤，来合成DNA-AgNCs。首先通过吸光度对正常和拥挤条件下合成的DNA-AgNCs进行表征。如图1所示，正常条件合成的Ag和拥挤环境的Ag+PEG的吸收峰均在430 nm左右，但后者峰值较低，这与Huang等[18]结果一致，表明两种DNA-AgNCs成功合成。由图2可知，制备的两种DNA-AgNCs大小均一且有良好的分散性，Ag直径在2 nm左右（图2A），Ag+PEG约为3 nm（图2B），汪尔康[27]、Xu等[28]报道，含有多个C的DNA模板序列合成的DNA-AgNCs粒径均在2 nm左右，这有利于其进入细胞内部，更好的发挥抗菌作用。
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图 2 正常DNA-AgNCs（A）和分子拥挤DNA-AgNCs（B）的电镜图像Figure 2. Electron microscope images of normal DNA-AgNCs(A) and molecular crowding DNA-AgNCs(B)2.2 DNA-AgNCs的抗真菌能力
2.2.1 DNA-AgNCs抑制四种孢子萌发的能力
为探究分子拥挤对DNA-AgNCs抗真菌能力的影响，首先通过显微镜观察计算孢子萌发抑制率。如表2所示，扩展青霉对DNA-AgNCs最敏感，Ag能抑制其68.940%的孢子萌发，而Ag+PEG能达到83.351%。对两种镰刀菌的抑制效果较差，Ag+PEG的抑制率仅有59.814%和52.803%。黄曲霉对两种DNA-AgNCs的敏感性居中，抑制率分别为61.024%和76.527%。因此，DNA-AgNCs对四种孢子都有不同程度的抑制作用，且Ag+PEG的抑制能力明显优于Ag（P<0.05）。AgNCs由于能使菌丝变形断裂，增加外膜损伤，促进K+释放，还能使活性氧、脂质过氧化、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性升高，因此有显著的抗真菌活性[10]。Xie等[29]报道，经PEG修饰的AgNCs能够聚集在细菌表面，进而使细胞扭曲胞膜破裂导致胞质外漏。此外，Hao等[19]实验表明，PEG有微弱的抗菌效果，能形成水和层抑制细菌蛋白黏附，因此Ag+PEG的抑制率高于Ag的可能原因是AgNCs与PEG协同作用提高了其抗真菌能力。
表 2 两种DNA-AgNCs对四种真菌孢子萌发抑制率Table 2. Inhibition rates of two DNA-AgNCs on four kinds of fungal spores2.2.2 DNA-AgNCs对四种真菌的MIC
DNA-AgNCs与四种孢子悬液在96孔板培养3 d后，以完全抑制真菌生长的最低浓度（即第一个澄清孔浓度）为MIC。两种DNA-AgNCs对扩展青霉的MIC最小（图3A），分别为1.00和0.50 μmol/L，仅在纯孢子液中看到轻微菌丝生成（图4A）。黄曲霉在低浓度的孔壁上能看到明显的白色菌丝（图4B），MIC分别为1.25和1.00 μmol/L（图3B）。Ag和Ag+PEG对禾谷镰刀菌的MIC差距较大（图3C），分别为2.50和1.50 μmol/L，在纯孢子液中可见明显菌丝（图4C），后续孔中溶液也较浑浊。串珠镰刀菌虽没有明显的菌丝（图4D），但大多数孔已浑浊，直到2.50和2.25 μmol/L可见澄清（图3D）。Malkapur等[10]制备的AgNCs对寄生曲霉和黄曲霉的MIC分别为4.5和3.5 µg/mL，Chen等[30]所制AgNCs 6.4 µg/mL即对耐药性铜绿假单胞菌有较好的杀灭效果，因此AgNCs具有微量高效的抗菌效果。
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图 3 四种真菌与两种DNA-AgNCs培养3 d的OD值注：不同大写字母表示组内差异显著（P<0.05）；不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）；图9同。Figure 3. OD values of four fungi and two DNA-AgNCs cultured for 3 d![]()
图 4 四种真菌与两种DNA-AgNCs培养3 d的图片Figure 4. Images of four fungi and two DNA-AgNCs cultured for 3 d2.3 复合薄膜的性能分析
2.3.1 SEM图像
对三种复合薄膜的外观和表面结构进行观察，虽然外观没有较大差异（图5插图），但在电镜下的形态差异较大。如图5A所示，无DNA-AgCs的S+C薄膜表面较平整，几乎看不到颗粒凸起，添加有DNA-AgNCs的S+C+Ag薄膜表面较粗糙（图5B），能看到较多的颗粒均匀分散在表面，而添加分子拥挤的S+C+Ag+PEG薄膜表面虽也有颗粒在膜表面均匀分布，但较S+C+Ag薄膜平整（图5C）。由于PEG有良好的相容性和网络结构[31]，可以使DNA-AgNCs更充分地分散在淀粉和壳聚糖的混合溶液中，因此S+C+Ag+PEG薄膜较S+C+Ag薄膜平整，颗粒状结构不明显。
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图 5 三种复合薄膜的SEM图像（插图为薄膜照片）Figure 5. SEM images of three kinds of composite films （inset is film photo）2.3.2 力学性能
薄膜的延展性通过力学性能体现，采用质构仪对复合薄膜的力学性能进行测定。如表3所示，Ag的加入将拉伸强度由4.729 MPa提高到5.968 MPa，断裂伸长率也从51.399%增加至60.368%。Ag+PEG的改善效果更显著（P<0.05），拉伸强度和断裂伸长率分别增加至7.300 MPa和77.287%。由于DNA-AgNCs浓度低，均匀分散在淀粉和壳聚糖基质中，氢键的作用影响分子排列和运动，使复合薄膜结构更加紧致[32]。Kiuchi等[31]研究表明，由于PEG具有良好的相容性和网状结构，也能降低薄膜脆性，使分子间有更大的旋转运动。
表 3 复合薄膜的力学性能和水接触角Table 3. Mechanical properties and water contact angle of composite film组别 拉伸强度（MPa） 断裂伸长率（%） 水接触角（°） S+C 4.729±0.399c 51.399±5.137c 59.700±6.484c S+C+Ag 5.968±0.097b 60.368±5.297b 69.785±9.225b S+C+Ag+PEG 7.300±0.845a 77.287±2.878a 66.717±5.095a 2.3.3 接触角
接触角是表征薄膜疏水性的常用方法，90°是薄膜疏水性的临界值[33]。由表3可知。加入Ag后，淀粉-壳聚糖薄膜的接触角由59.700°增加至69.785°，这可能归因于DNA-AgNCs与淀粉和壳聚糖的-OH相互作用形成氢键，使薄膜的疏水性增加[34]。而加入Ag+PEG后接触角有所下降，为66.717°，这与SEM结果趋势一致。Li等[35]报道，表面粗糙度的增加通常可以提高材料表面疏水性，AgNCs与颗粒团聚体之间的空隙可以截留空气，使其表面由固体和空气组成，从而提高了纳米复合薄膜的表面疏水性。由于加入Ag后复合薄膜表面变得更加粗糙，因此S+C+Ag水接触角最大，而S+C+Ag+PEG的表面较S+C+Ag光滑，因此水接触角居中，S+C表面最平整水接触角也最小。此外，薄膜在包装食品时大多处于一个潮湿的环境，Tai等[33]指出提高疏水性能够有效隔绝内外水分流动，减少细菌附着，起到良好的屏障作用，对薄膜的抗菌应用十分有利。
2.3.4 抗真菌能力
为评估复合薄膜的抗真菌能力，将三种薄膜分别与四种真菌培养，抑菌效果由抑菌圈直径决定。如表4所示，在没有DNA-AgNCs加入时，S+C薄膜没有抗菌效果，加入DNA-AgNCs后两种薄膜有明显的抑菌圈，其中扩展青霉的抑菌圈最大，分别为18.249和23.969 mm，而串珠镰刀菌只有11.736和13.349 mm，且S+C+Ag+PEG的抑菌圈直径显著大于S+C+Ag（P<0.05），这与2.2中DNA-AgNCs的抗真菌能力相对应，表明S+C+Ag+PEG复合薄膜有更显著的抗菌效果。
表 4 三种复合薄膜的抑菌圈直径Table 4. Diameter of bacteriostatic zone of three kinds of composite films组别 扩展青霉 黄曲霉 禾谷镰刀菌 串珠镰刀菌 S+C / / / / S+C+Ag 18.249±0.141b 15.826±0.178b 13.162±0.296b 11.736±0.245b S+C+Ag+PEG 23.969±0.265a 19.176±0.382a 16.822±0.453a 13.349±0.474a 注：/表示没有抑菌圈。 2.4 复合薄膜对柑橘青霉病抑制作用
2.4.1 复合薄膜对柑橘失重率和病斑直径的影响
果蔬在采摘后由于蒸腾和呼吸作用消耗自身的水分和养分，重量会持续下降。由图6可知，柑橘在接种青霉之后重量不断下降，在2 d仅对照组失重率超过5%，其他三组均在4%左右。随着时间的增加，对照组失重率几乎呈倍数增长，14 d时高达32.5%，且与S+C组无显著性差异（P>0.05）。而S+C+Ag+PEG组失重率仅为23.8%，与对照组第10 d的水平相当，且与其他三组有显著性差异（P<0.05），这表明S+C+Ag+PEG复合涂膜能够延缓柑橘重量损失。
柑橘在贮藏期间常由于磕碰造成表皮受损增加微生物侵染的几率，因此通过刺伤接种孢子液来模拟此情况。如图7所示，第2 d四组均没有明显的病斑，4 d时对照组可见0.6 cm病斑直径，S+C和S+C+Ag仅0.4 cm，S+C+Ag病斑依旧不明显。在14 d时，对照组病斑直径达3.3 cm，而S+C+Ag+PEG病斑仅2.3 cm，与10 d时对照组直径相似。结合图8可以看出，S+C+Ag+PEG处理组在第10 d可见明显菌斑，其余三组在第6 d即可见菌斑生成。三组涂膜处理的病斑直径均小于对照组，且S+C+Ag+PEG处理组效果最显著（P<0.05），这与前面Ag+PEG的强抗菌能力相对应，表明S+C+Ag+PEG复合涂膜能够显著抑制病斑扩散（P<0.05）。
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图 8 不同处理下柑橘14 d内外观变化Figure 8. Appearance changes of citrus under different treatments in 14 d2.4.2 复合薄膜对柑橘感官品质的影响
柑橘在贮藏期间质量逐渐下降，视觉评价是品质评估最直观的方式。如图9所示，起初四组无显著性差异（P>0.05），评分均在90分以上，颜色鲜亮，果皮柔韧有弹性。第6 d开始，对照组已降至60分，结合图8可看出，开始出现明显病斑，外皮光泽度下降，S+C和S+C+Ag仅在接种除有较少菌丝，三个涂膜处理组评分均在70分以上。在第10 d时，对照组降至33分，病斑内陷并伴有绿色孢子产生，外皮坚硬粗糙失去光泽；S+C组患病处有轻微内陷和少量菌丝，果皮失去弹性硬度增加；S+C+Ag和S+C+Ag+PEG仅有病斑直径的增加，外皮的弹性和亮度还维持在较高的水平。直至第14 d，对照组仅有17分，柑橘腐烂严重并产生酸腐味液体；S+C和S+C+Ag组已不足40分，外皮粗糙暗淡，患病处内陷，有异味产生；S+C+Ag+PEG组评分还在50以上，外皮脆性逐渐增加，光泽度有轻微下降，但没有明显的气味变化。综上所述，柑橘在贮藏14 d内感官品质不断下降，其中对照组下降最快，S+C+Ag+PEG品质最好，显著优于其他三组（P<0.05），因此S+C+Ag+PEG复合涂膜能够有效延缓柑橘感官品质的降低。
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图 9 复合涂膜对柑橘外观品质的影响Figure 9. Effects of compound coating on appearance quality of citrus3. 结论
本研究在分子拥挤条件下合成的DNA-AgNCs有广谱抗真菌效果，其中对扩展青霉效果最明显，孢子萌发抑制率达83.351%，MIC仅为0.5 μmol/L，对其他真菌的抑制率也均在50%以上，MIC不超过2.5 μmol/L。将DNA-AgNCs加入淀粉-壳聚糖溶液中制备复合薄膜，能有效改善薄膜的韧性，赋予薄膜良好的屏障作用和抗菌效果。作为涂膜使用在青霉侵染的柑橘中，S+C+Ag+PEG涂膜能有效延缓柑橘重量损失，14 d内失重率仅有23.8%，还能有效抑制病斑蔓延，在接种孢子液14 d后病斑只有2.3 cm，对青霉病有较好的防治效果，且能将柑橘品质维持在较高的水平。本研究为DNA-AgNCs的应用提供新方向，更好地满足食品包装的多样化应用需求。
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图 2 正常DNA-AgNCs（A）和分子拥挤DNA-AgNCs（B）的电镜图像
Figure 2. Electron microscope images of normal DNA-AgNCs(A) and molecular crowding DNA-AgNCs(B)
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图 3 四种真菌与两种DNA-AgNCs培养3 d的OD值
注：不同大写字母表示组内差异显著（P<0.05）；不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）；图9同。
Figure 3. OD values of four fungi and two DNA-AgNCs cultured for 3 d
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图 4 四种真菌与两种DNA-AgNCs培养3 d的图片
Figure 4. Images of four fungi and two DNA-AgNCs cultured for 3 d
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图 5 三种复合薄膜的SEM图像（插图为薄膜照片）
Figure 5. SEM images of three kinds of composite films （inset is film photo）
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图 8 不同处理下柑橘14 d内外观变化
Figure 8. Appearance changes of citrus under different treatments in 14 d
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图 9 复合涂膜对柑橘外观品质的影响
Figure 9. Effects of compound coating on appearance quality of citrus
表 1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
指标 评分标准 分值（分） 硬度（20分） 软硬适中，有一定弹性 15~20 质地较硬，手感粗糙 8~14 质地较软，受力易变形 0~7 外观（40分） 颜色鲜艳，有光泽 27~40 颜色较暗，果皮紧致 14~26 颜色暗淡，皱缩严重 0~13 腐烂程度（40分） 无腐烂，无异味 27~40 轻微腐烂，无明显异味 14~26 严重腐烂，异味严重，有液体流出 0~13 
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表 2 两种DNA-AgNCs对四种真菌孢子萌发抑制率
Table 2 Inhibition rates of two DNA-AgNCs on four kinds of fungal spores
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表 3 复合薄膜的力学性能和水接触角
Table 3 Mechanical properties and water contact angle of composite film
组别 拉伸强度（MPa） 断裂伸长率（%） 水接触角（°） S+C 4.729±0.399c 51.399±5.137c 59.700±6.484c S+C+Ag 5.968±0.097b 60.368±5.297b 69.785±9.225b S+C+Ag+PEG 7.300±0.845a 77.287±2.878a 66.717±5.095a
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表 4 三种复合薄膜的抑菌圈直径
Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of three kinds of composite films
组别 扩展青霉 黄曲霉 禾谷镰刀菌 串珠镰刀菌 S+C / / / / S+C+Ag 18.249±0.141b 15.826±0.178b 13.162±0.296b 11.736±0.245b S+C+Ag+PEG 23.969±0.265a 19.176±0.382a 16.822±0.453a 13.349±0.474a 注：/表示没有抑菌圈。
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