Extraction Process Optimization，Purification and Characterization Analysis of Glycoprotein from the Mucus of Chinese Giant Salamander
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摘要: 本文以丽水人工养殖大鲵的黏液为原料，优化大鲵黏液粗糖蛋白提取工艺并进行纯化表征。基于单因素实验，以料液比、温度、提取液浓度以及提取时间为考察因素，粗糖蛋白得率为指标，采用响应面法优化提取工艺，得到最佳提取条件为：料液比1:30.5 g/mL、提取温度51 ℃、提取液浓度0.32 mol/L、提取时间5.2 h，大鲵黏液粗糖蛋白得率最高为5.22%±0.71%。纯化得到大鲵黏液糖蛋白（MGP），经表征分析，测定其达到电泳纯，分子量约为29 kDa；MGP中必需氨基酸及药用氨基酸含量分别为37.21 g/100 g和33.39 g/100 g；MGP具有典型的糖蛋白结构的紫外全波长吸收图像；含有O型糖肽键，吡喃糖环结构和β-糖苷键，β-折叠结构占蛋白质二级结构的87%，为后续深入探究大鲵黏液糖蛋白生物活性提供一定基础。
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关键词:
- 大鲵黏液糖蛋白(MGP) /
- 提取工艺 /
- 得率 /
- 氨基酸组成 /
- 结构分析
Abstract: The extraction process of crude glycoprotein from Chinese giant salamander (MGP) mucus cultured in Lishui was optimized. The crude glycoprotein was further purified, of which characterization was analysed. Based on single factor experiment, the extraction process was optimized by response surface methodology with solid-liquid ratio, temperature, extraction concentration, extraction time as factors, and glycoprotein yield as index. The results showed that the optimal extraction conditions were solid-liquid ratio of 1:30.5 g/mL, extraction temperature of 51 ℃, extraction concentration of 0.32 mol/L, extraction time of 5.2 h, the highest yield of MGP was 5.22%±0.71%, which was basically consistent with the expected results. The electrophoresis pure of purified glycoprotein was determined. The lyophilized MGP was white, loose powder, of which molecular weight was about 29 kDa. The contents of essential amino acids and medicinal amino acids in MGP were 37.21 g/100 g and 33.39 g/100 g, respectively. MGP had a typical glycoprotein structure of UV full wavelength absorption image, containing o-glycopeptide bond, pyranose ring structure and β-glycosidic bond. The secondary structure of MGP was mainly composed of 87% β-folded, which provided a theoretical basis for further research on the biological activity of glycoprotein from the mucus of Chinese giant salamander. -
大鲵（Andrias davidianus）俗称娃娃鱼，是世界上现存最大的两栖动物，有着“活化石”的美誉[1]。主要分布于我国湖南，贵州，陕西等地，为大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科。其肉质细腻鲜美，具有较高的食用价值和营养价值[2]。大鲵躯干修长，侧面多褶皱，肌肉发达，皮肤成灰色或灰褐色，其表皮分布有丰富的腺体结构，在受到外界刺激时，能够分泌出带有特殊气味的白色黏液[3]，在加工过程中常被丢弃。多项研究表明，一些天然资源如草药[4-5]、植物蛋白[6]、细菌分泌物[7]等具有一定的抗菌和抗氧化活性。Seham等[8]通过硫酸铵沉淀法提取非洲鲶鱼的黏液糖蛋白（CFG），具有良好的抑菌作用。王慧阳等[9]研究发现蜗牛黏液，具有一定抗氧化能力，并且能够增强巨噬细胞吞噬能力，促进免疫细胞因子释放。大鲵黏液中富含黏液糖蛋白，具有一定的生物活性[10]，因此对大鲵黏液的深化利用研究有助于提高大鲵加工副产物的利用价值和经济效益。
糖蛋白是指具有多分支的寡糖链（一般为15~20个单糖单元）与多肽链以共价键相连而成的复合物，其含量以蛋白为主[11]，糖蛋白在动物、植物和微生物中广泛存在，是生命活动中一种重要大分子[12]，有着抗氧化、抗菌、降血糖等生物活性功能[13-14]。徐伟良[15]通过提取纯化大鲵黏液糖蛋白，证明其对于人肺癌细胞A549具有明显的抑制作用。张金豫等[16]通过水提醇沉法得到的大鲵黏液糖蛋白对·OH、DPPH·和O2-·都有一定的清除能力。但是对于大鲵黏液粗糖蛋白的提取工艺的优化、纯化表征鲜有报道。本文通过单因素实验，响应面法优化大鲵黏液粗糖蛋白的提取工艺，并对其进行纯化表征，以期为后续的大鲵黏液糖蛋白研究提供一定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大鲵黏液：中国浙江丽水养殖场提供大鲵活体，实验室进行黏液收集并制备成冻干粉末供后续使用；DEAE-52纤维素 GE Healthcare公司；Sephadex-G100 北京索莱宝有限公司；MW:3500透析袋、Tris-HCl（pH7.4） 上海源叶生物科技有限公司；浓硫酸、无水乙醇、浓盐酸、氯仿、正丁醇、氯化钠 上海麦克林生化科技有限公司；上述试剂均为国产分析纯。
DK-S28型精宏水浴锅 上海坤权生物科技有限公司；H-1850R型台式高速冷冻离心机 上海向帆仪器有限公司；SHIMADZU AUY220型电子分析天平 上海科晓科学仪器有限公司；Hitachi LA-8080氨基酸自动分析仪 日本日立公司；UV-1800PC分光光度计 上海精科仪器厂；傅里叶红外光谱仪 美国尼高力公司。
1.2 实验方法
1.2.1 碱法提取大鲵黏液粗糖蛋白的工艺流程
称取一定量大鲵黏液冻干粉，以一定料液比加入一定浓度的NaOH溶液，在一定温度和时间下水浴加热提取，离心分离收集上清液，调节pH至7.0左右，加入预冷无水乙醇（4 ℃）至终浓度为80%，置于4 ℃冰箱中醇沉8 h，离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2～3次，冻干成粉末[17]。将粉末复溶于去离子水中加入Sevag试剂（正丁醇:氯仿=1:4，v/v），于冰水浴上搅拌15 min（250 r/min），去除游离蛋白。提取液3000 r/min离心10 min，取最上层液体，以上所有步骤重复3次。将提取液转移入透析袋（MW:3500）透析48 h去除游离蛋白。48 h后，将透析液转移到培养皿中冻干得大鲵黏液粗糖蛋白，并收集称重，按式（1）计算得率：
W=M1/M2×100 (1) 式中：W——粗糖蛋白得率（%）；M1——冻干后粗糖蛋白质量（g）；M2——大鲵黏液冻干粉质量（g）。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 提取时间对得率的影响
称取5 g大鲵黏液冻干粉，以0.3 mol/L的NaOH溶液，在料液比为1:30 g/mL，温度为50 ℃水浴中分别提取2、3、4、5、6 h，按上述工艺提取，去除游离蛋白，冻干，按式（1）计算得率。
1.2.2.2 提取温度对得率的影响
称取5 g大鲵黏液冻干粉，以0.3 mol/L的NaOH溶液，在料液比为1:30 g/mL，分别在温度30、40、50、60、70 ℃水浴中分别提取5 h，按上述工艺提取，去除游离蛋白，冻干，按式（1）计算得率。
1.2.2.3 提取液浓度对得率的影响
称取5 g大鲵黏液冻干粉，分别以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaOH溶液，在料液比为1:30 g/mL，温度50 ℃水浴中提取5 h；按上述工艺提取，去除游离蛋白，冻干，按式（1）计算得率。
1.2.2.4 料液比对得率的影响
称取5 g大鲵黏液冻干粉，以0.3 mol/L的NaOH溶液，分别采用1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL的料液比，温度50 ℃水浴中提取5 h；按上述工艺提取，去除游离蛋白，冻干，按式（1）计算得率。
1.2.3 响应面试验
采用响应面试验设计，应用Design Expert12软件，以碱提醇沉实验单因素数据为基础，以料液比（A）、温度（B）、提取时间（C）、提取液浓度（D）为主要影响因素，以大鲵黏液粗糖蛋白得率为指标，进行响应面分析，优化碱法提取大鲵黏液糖蛋白工艺。因素水平设计见表1。
表 1 Box-Behnken试验设计因素水平Table 1. Factors and levels of Box-Behnken design水平 因素 A
料液比（g/mL）B
温度（℃）C
提取时间（h）D
提取液浓度（mol/L）−1 1:25 40 4 0.2 0 1:30 50 5 0.3 1 1:35 60 6 0.4 1.2.4 大鲵黏液粗糖蛋白纯化
阴离子交换层析法和凝胶层析法是纯化糖蛋白的常用方法。将粗大鲵黏液粗糖蛋白溶解在Tris-HCl（pH7.4）中（调整样液浓度为2～3 mg/mL），然后经0.22 μm孔径的滤膜过滤。DEAE-52柱（1.6 cm×40 cm）经预处理后，用20 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）平衡柱体，然后将大鲵黏液粗糖蛋白溶液装填至DEAE-52柱上，用含有0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.4）的梯度NaCl洗脱液（0、0.15、0.25、0.35和0.45 mol/L）进行洗脱。洗脱速率设置为1 mL/min，每5 min收集一次洗脱液。用紫外检测器在280 nm处测定每支管的蛋白质含量，而用苯酚-硫酸法在490 nm处得到多糖峰。绘制两种测定的紫外吸收光谱，并确定、收集、透析和冻干重叠峰。将收集到的冻干粉用去离子水溶解，采用SephadexG-100进一步纯化[18]。最后得到的洗脱液采用上述方法进行检测。收集重叠峰、冻干，得到纯化后的大鲵黏液糖蛋白（MGP）应用于后续理化表征实验，以下简称MGP。
1.2.5 大鲵黏液糖蛋白（MGP）表征实验
1.2.5.1 SDS-PAGE电泳鉴定
SDS-PAGE广泛用于蛋白质的测定，参照李敏等[19]的实验方法进行适当调整，本实验采用5%浓缩胶和12%分离胶，将MGP样品进行前处理后，10 μL上样。电泳在恒压120 Ｖ下进行。当指示剂在大约1~2 cm处到达凝胶底部时，停止电泳，采用考马斯亮蓝染色液染色，脱色后观察电泳条带。
1.2.5.2 氨基酸分析
根据刘俊奇[20]的实验方法并略作修改，采用Hitachi LA-8080氨基酸自动分析仪测定糖蛋白的氨基酸组成。将总共15 mg的MGP粉末置于水解管中，然后加入6 mol/L HCl和3滴重蒸苯酚。然后将水解管在110 ℃烘箱中水解22 h。水解完毕待冷却至室温后，将样品真空干燥，将残余物重新溶解在超纯水中并按上述方法真空干燥。最后，加入柠檬酸缓冲液（pH2.2）进行溶解，通过0.22 μm过滤器过滤，并通过氨基酸分析仪进行分析。
1.2.5.3 紫外全波长扫描以及糖肽键检测分析
参考Li等[14]对灰星鲨水解产物糖蛋白的紫外全波长扫描以及糖肽键检测方法。MGP的紫外全波长吸收光谱图，采用UV-1800PC分光光度计测定。将大鲵黏液糖蛋白溶解在去离子水中。调整浓度为1 mg/mL并使用200～400 nm的波长范围进行扫描；配置MGP溶液（2 mg/mL）加入等体积的0.4 mol/L NaOH，在25 ℃反应2 h，然后用UV-1800PC分光光度计在200～300 nm处进行分析，与去离子水混合的样品作为对照。
1.2.5.4 FTIR光谱分析
采用Nicolet1 iS10 FT-IR光谱仪对MGP进行傅里叶变换红外光谱分析。直接将1 mg MGP粉末直接压入FTIR光谱仪进行4000～550 cm−1范围内的红外光谱分析。
1.3 数据处理
每个实验重复3次取平均值，结果以平均值±标准差表示。采用Design Expert12进行响应面设计分析，使用Origin 2017软件进行作图，采用SPSS17.0统计学软件进行分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 提取时间对大鲵黏液粗糖蛋白得率的影响
从图1可知，大鲵黏液粗糖蛋白得率在5 h达到最大值，为5.01%。薛张芝等[21]对墨鱼缠卵腺进行糖蛋白提取，其在4 h得到最高的得率。大鲵黏液及一些动物源糖蛋白如墨鱼缠卵腺等，其组分复杂，在溶液中难分散，释放需要更长时间的浸提从而达到更高的提取效率，这与薛张芝实验结果相似。在5 h之前，大鲵黏液糖蛋白得率随着提取时间的增加而增加，在5 h之后，大鲵黏液糖蛋白得率有显著（P<0.05）下降。较短的提取时间，使得糖蛋白提取释放不完全，导致得率较低；而长时间的提取过后，蛋白质之间产生相互作用，使得糖蛋白产生凝结、聚集、沉淀，导致糖蛋白的结构产生破坏[22]，从而导致得率的下降。因此，本实验条件下选择5 h作为最佳提取时间。
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图 1 不同提取时间对得率的影响Figure 1. Effect of different extraction time on yield of crude glycoprotein from A. davidianus mucus2.1.2 提取温度对大鲵黏液粗糖蛋白得率的影响
从图2可知，大鲵黏液糖蛋白的得率在60 ℃达到最大值，为5.10%。在60 ℃之前，大鲵黏液糖蛋白得率随着提取温度的增加而增加，在60 ℃之后，大鲵黏液糖蛋白得率有显著（P<0.05）下降。一定的温度条件下有助于糖蛋白的溶出，李卫林等[23]提取甘薯糖蛋白同样在60 ℃得到最大得率，而继续升温导致糖蛋白变性，成为絮状沉淀析出，最终导致得率的降低。考虑到温度对蛋白质活性的影响，以及在50 ℃和60 ℃提取率差异不显著（P>0.05），故本实验条件下，选择50 ℃作为最佳提取温度。
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图 2 不同提取温度对得率的影响Figure 2. Effects of temperature on yield of crude glycoprotein from A. davidianus mucus2.1.3 提取液浓度对大鲵黏液粗糖蛋白得率的影响
从图3可知，大鲵黏液糖蛋白的得率在NaOH浓度为0.3 mol/L达到最大值，为5.14%。在0.3 mol/L之前，大鲵黏液糖蛋白得率随提取液浓度的增加而增加，在0.3 mol/L之后，大鲵黏液糖蛋白得率随着提取液浓度增加而下降（P<0.05）。碱提取法有较高的提取效率，而过高的浓度会使糖蛋白变性，导致得率下降，陈淑敏等[24]对曼氏无针乌贼缠卵腺糖蛋白提取，NaOH浓度的增加导致糖蛋白得率呈现先上升后下降的趋势，在0.4 mol/L时提取率达到最高，图形与本文基本一致。根据不同物料糖蛋白特性不同，结合单因素实验结果，本文选择0.3 mol/L提取液浓度作为最佳提取液浓度。
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图 3 不同提取液浓度对得率的影响Figure 3. Effects of concentration of NaOH on yield of crude glycoprotein from A. davidianus mucus2.1.4 料液比对大鲵黏液粗糖蛋白得率的影响
从图4可知，大鲵黏液糖蛋白得率在料液比为1:30时达到最大值，为5.09%。当较低料液比时，溶液量较少，提取液较快达到过饱和状态，糖蛋白溶出效率较低，使得整个提取过程不充分进行，而过大的料液比，整个实验过程能耗增加，伴随一定程度的损失，使得提取效率下降[25]。故本实验选择1:30为最佳提取料液比。
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图 4 不同料液比对得率的影响Figure 4. Effects of solid-liquid ratio on yield of crude glycoprotein from A.davidianus mucus2.2 大鲵黏液粗糖蛋白的提取优化实验
2.2.1 响应面试验结果
将大鲵黏液粗糖蛋白得率（Y）作为响应值，料液比（A）、温度（B）、提取时间（C）、提取液浓度（D）四个因素为自变量，实验结果见表2。
表 2 响应面试验设计与结果Table 2. Design and results of response surface test试验号 A
料液比（g/mL）B
温度（℃）C
提取时间（h）D
提取液浓度（mol/L）得率（%） 1 1:30 40 4 0.3 4.71±0.49 2 1:30 40 6 0.3 4.89±0.26 3 1:30 60 4 0.3 4.91±0.52 4 1:30 60 6 0.3 4.87±0.19 5 1:25 50 5 0.2 4.75±0.59 6 1:25 50 5 0.4 4.78±0.72 7 1:35 50 5 0.2 4.77±0.10 8 1:35 50 5 0.4 4.92±0.53 9 1:25 50 4 0.3 4.77±0.32 10 1:25 50 6 0.3 4.93±0.41 11 1:35 50 4 0.3 4.82±0.61 12 1:35 50 6 0.3 4.91±0.13 13 1:30 40 5 0.2 4.79±0.21 14 1:30 60 5 0.2 4.77±0.31 15 1:30 40 5 0.4 4.79±0.37 16 1:30 60 5 0.4 4.94±0.61 17 1:30 50 4 0.2 4.79±0.13 18 1:30 50 6 0.2 4.76±0.55 19 1:30 50 4 0.4 4.75±0.49 20 1:30 50 6 0.4 4.98±0.19 21 1:25 40 5 0.3 4.64±0.49 22 1:25 60 5 0.3 4.88±0.16 23 1:35 40 5 0.3 4.84±0.12 24 1:35 60 5 0.3 4.92±0.10 25 1:30 50 5 0.3 5.13±0.82 26 1:30 50 5 0.3 5.11±0.71 27 1:30 50 5 0.3 5.12±0.61 28 1:30 50 5 0.3 5.17±0.77 29 1:30 50 5 0.3 5.17±0.44 对表3中的数据进行拟合得到回归方程为Y=5.14+0.0358A+0.0525B+0.0492C+0.0442D−0.0400AB−0.0175AC+0.0300AD−0.0500BC+0.0425BD+0.0650CD−0.1571A2−0.1546B2−0.1371C2−0.1746D2。通过对表3进行回归模拟方差分析可知，模型P值为<0.0001，该模型具有极显著性（P<0.01），实验误差较小，说明该数学模型能够很好的解释糖蛋白得率的变化。而失拟项（P>0.05）不显著，说明该数学模型与真是响应面的拟合度较高。R2=0.9704，表示回归方程中所有自变量的变化可以解释97.04%因变量的变化，表明回归方程可以很好地描述考察因子与响应值之间的关系[26]。A、B、C、D四因素对糖蛋白的得率影响也极为显著（P<0.01），影响程度为B>C>D>A，即温度>提取时间>提取液浓度>料液比。
表 3 回归模型方差分析Table 3. Variance analysis of regression model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 0.5559 14 0.0397 32.83 <0.0001 ** A 0.0154 1 0.0154 12.74 0.0031 ** B 0.0331 1 0.0331 27.35 0.0001 ** C 0.0290 1 0.0290 23.98 0.0002 ** D 0.0234 1 0.0234 19.35 0.0006 ** AB 0.0064 1 0.0064 5.29 0.0373 * AC 0.0012 1 0.0012 1.01 0.3313 不显著 AD 0.0036 1 0.0036 2.98 0.1065 不显著 BC 0.0121 1 0.0121 10.00 0.0069 ** BD 0.0072 1 0.0072 5.97 0.0284 * CD 0.0169 1 0.0169 13.97 0.0022 ** A² 0.1601 1 0.1601 132.33 <0.000 1 ** B² 0.1550 1 0.1550 128.15 <0.000 1 ** C² 0.1219 1 0.1219 100.78 <0.000 1 ** D² 0.1977 1 0.1977 163.46 <0.000 1 ** 残差 0.0169 14 0.0012 失拟项 0.0137 10 0.0014 1.72 0.3176 不显著 纯误差 0.0032 4 0.0008 总误差 0.5729 28 回归系数R² 0.9704 注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。 2.2.2 响应面分析
从图5-a、图5-c、图5-e、图5-g、图5-i和图5-k可知，响应面坡度较陡，且呈现处开口向下的凸形曲面，即存在最大得率。从等高线可知，在等高线呈椭圆形时，说明两个因素之间有交互作用；等高线呈圆形时，则说明两个因素的交互作用不明显，其中图5-b、图5-h、图5-j和图5-l整个图像呈现椭圆形，说明温度和料液比、提取时间和温度、温度和提取液浓度、提取时间和提取液浓度的交互作用较为显著，与回归方程结果相吻合[27]。
2.2.3 最优试验方案验证
当在温度为51.492 ℃，料液比为1:30.513 g/mL，提取时间为5.188 h，提取液浓度为0.319 mol/L时，得到最大得率为5.155%，根据实际实验操作情况，取温度为51 ℃，料液比为1:30.5 g/mL，提取时间5.2 h，提取液浓度0.32 mol/L为提取条件，进行验证实验。通过三次平行验证实验得知，大鲵黏液粗糖蛋白得率最高为5.22%±0.71%，证明响应面模型优化有具有可行性，能够较好地模拟大鲵黏液糖蛋白提取过程以及预测得率。
2.3 大鲵黏液粗糖蛋白纯化
大鲵黏液粗糖蛋白通过采用两种不同的色谱柱进一步纯化。为了获取单一组分的糖蛋白，常用柱层析的方式对样品进行分级，最常用的方法是阴离子交换柱层析以及凝胶柱层析[28]。层析装置一般连接有核酸蛋白检测仪，监控OD280 nm处吸光度情况。后续采用苯酚-硫酸法或是蒽酮-硫酸法绘制糖蛋白中糖部分的吸收曲线，根据重叠峰收集糖蛋白样品[29]。
如图6（a）所示，紫外检测器在280 nm处监测到三个主要洗脱峰，分别命名为MGP1、MGP2和MGP3，其中MGP1和MGP2的吸光度值较高，MGP3的吸光度值较低，相比徐伟良[15]采用单一浓度的洗脱方式只得到单一洗脱峰相比，梯度洗脱方式有着更广的分离范围，得到三种不同的洗脱峰。在后续苯酚-硫酸法测定后，苯酚-硫酸法测定的490 nm处只有两个重叠峰，而MGP1的双峰有较好的重叠。因此，本研究选择MGP1作为后续实验的对象，收集进行透析、冻干。将MGP1溶解于去离子水中，在Sephadex G-100柱上，只得到一个组分（图6（b）），命名为MGP。该洗脱液组分也被收集、透析和冻干作进一步测定。
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图 6 MGP色谱分离图注：（a） MGP（0.15、0.25、0.35、0.45 mol/L NaCl）DEAE-52阴离子交换柱层析的洗脱图；（b） MGP Sephadex G-100洗脱图。Figure 6. Chromatographic isolation of MGP2.4 SDS-PAGE电泳结果
由图7可见，其中M代表蛋白Marker，A代表纯化后的大鲵黏液糖蛋白MGP。经离子交换层析，凝胶柱层析后，粗糖蛋白得到了分离纯化，在SDS-PAGE上呈现单一条带，证明纯化后的糖蛋白为单一组分，达到电泳纯，可进行后续结构分析实验。根据蛋白Marker可知，MGP分子量约为29 kDa。
2.5 MGP氨基酸组成分析
MGP的氨基酸组成见表4。对18种氨基酸进行了测试，除色氨酸由于酸水解以及胱氨酸低于检出限未列于表中。其中，总氨基酸含量81.53 g/100 g，人体必需氨基酸含量为37.21 g/100 g，药用氨基酸含量33.39 g/100 g。MGP主要含有的三种药用氨基酸中，Asp可用于治疗心脏病、肝病、高血压、预防和恢复疲劳。Lys具有促进人体生长发育、增强机体免疫力、抗病毒、抗脂质氧化、缓解焦虑等积极作用。Ile能增加生长激素水平，进而帮助燃烧体内脂肪[30]。这些结果表明，MGP其含有的必需氨基酸及药用氨基酸占比较高，有着用于生物医学以及食品工程方面的潜力。
表 4 MGP氨基酸组成分析Table 4. Amino acid composition of MGP氨基酸种类 MGP（g/100 g） 必需氨基酸 苯丙氨酸Phe* 5.04±0.08 缬氨酸Val 5.30±0.02 蛋氨酸Met* 0.50±0.04 苏氨酸Thr 7.43±0.03 异亮氨酸Ile* 5.93±0.03 亮氨酸Leu 5.81±0.03 赖氨酸Lys* 7.20±0.03 小计 37.21 非必需氨基酸 天冬氨酸Asp* 7.83±0.04 丙氨酸Ala 3.49±0.01 谷氨酸Glu 9.27±0.05 甘氨酸Gly* 4.01±0.07 丝氨酸Ser 4.85±0. 02 脯氨酸Pro 5.50±0.07 组氨酸His 1.30±0.05 酪氨酸Tyr 5.19±0.04 精氨酸Arg* 2.88±0.04 小计 44.32 总氨基酸 81.53 药用氨基酸 33.39 注：*标记为药用氨基酸。 2.6 紫外全波长扫描以及糖肽键检测分析
MGP的紫外光谱如图8（a）所示，在215 nm处有较强的吸收，表明该多肽的存在。280 nm的弱吸收表明MGP含有蛋白质，这与苦荞[31]糖蛋白的紫外全波长吸收图谱基本一致，说明具有典型的糖蛋白特征。
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图 8 MGP紫外全波长扫描图（a）和MGP β-消除反应实验（b）Figure 8. UV spectra of MGP (a) and UV spectrum profiles of β-elimination before and after alkali treatment (b)经过碱处理和未经过碱处理的MGP的紫外扫描光谱如图8（b）所示。N型糖肽键在碱性环境中非常稳定，而O型糖肽键则相反。与对照样品相比，在240 nm处的吸光度值明显升高，说明发生了β-消除反应，确定了MGP中O型糖肽键的存在[32]。
2.7 大鲵黏液糖蛋白红外表征
由图9所示，MGP在3185、2965、1637、1400和1040 cm−1附近出现了吸收峰。如表5所示，这些峰属于蛋白和多糖等吸收特征峰，这与刘晓飞[33]所得到的发芽糙米糖蛋白FTIR图谱类似，具有典型的糖蛋白特征。3185.88 cm−1处为-NH2/NH/-NH3的N-H键之间的伸缩振动，并且存在氢键作用[34]。3000~2800 cm−1之间为饱和烃基（如-CH2或-CH3）间C-H伸缩振动峰[35]。1637.06 cm−1与1551.18 cm−1分别属于C=O键的伸缩振动与N-H角振动，对应糖蛋白中羧基和酰胺基的振动[36]。在1400.59 cm−1处，C-H产生的变角振动吸收是蛋白质分子肽键的特征吸收峰[37]。1137.06 cm−1与1040 cm−1处产生的吸收峰是吡喃糖环中醚键和羟基的典型吸收峰[32]。889.41 cm−1处产生的吸收峰说明，MGP含有β-糖苷键[38]。
表 5 MGP红外光谱分析结果Table 5. Results of FTIR analysis of MGPMGP波数（cm−1） 振动方式官能团 3185.88 -NH伸缩振动 2965.29 CH3不对称伸缩振动 1637.06 C=O键的伸缩振动与N-H角振动 1551.18 C-H弯曲振动 1400.59 亚甲基平面内弯曲振动 1137.06 C-O-C拉伸振动 1040 C-O和C-H的拉伸振动 889.41 环状扭曲振动 红外图谱上通过分析1700~1600 cm−1处的红外吸收图谱，能够分析得出MGP中糖蛋白二级结构的特征。通过Peakfit 4.12软件，对酰胺Ⅰ带图谱进行分析，通过去卷积处理，二阶导数多次拟合，使得拟合结果R2大于0.986，通过计算，得到MGP二级结构含量列于表6。酰胺Ⅰ带在1600～1640 cm−1内为β-折叠，1640～1650 cm−1内为无规卷曲，1650～1660 cm−1内为α-螺旋，1660～1700 cm−1内为β-转角[39]。通过表6得知，MGP中主要含有的是β-折叠结构占比约为87%。
表 6 MGP在酰胺Ⅰ带的蛋白质二级结构含量Table 6. Content of secondary structure of active peptide and amide Ⅰ-band protein in MGP二级结构 酰胺Ⅰ带波数区间（cm−1） 相对含量（%） β-折叠 1600~1640 87 无规卷曲 1640~1650 8 α-螺旋 1650~1660 3 β-转角 1660~1700 2 3. 结论
本实验采用单因素实验结合响应面法优化大鲵黏液粗糖蛋白提取工艺，根据分析结果结合实际操作得出大鲵黏液粗糖蛋白最佳提取工艺为：温度51 ℃，料液比1:30.5 g/mL，提取时间5.2 h，提取液浓度0.32 mol/L。在此条件下进行验证实验。通过三次平行验证实验得知，大鲵黏液粗糖蛋白的得率最高为5.22%±0.71%。
在最优工艺条件下，对大鲵黏液粗糖蛋白进行分离纯化，得到一种大鲵黏液糖蛋白MGP，冻干后为白色粉末，经SDS-PAGE分析达到电泳纯，分子量约为29 kDa。对其进行表征，MGP中必需氨基酸及药用氨基酸含量分别为37.21 g/100 g和33.39 g/100 g；MGP有典型的糖蛋白结构的紫外全波长吸收图像；含有O型糖肽键，吡喃糖环结构和β-糖苷键，其糖蛋白二级结构主要由87% β-折叠构成，为后续深入探究大鲵黏液糖蛋白生物活性提供一定基础。
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图 1 不同提取时间对得率的影响
Figure 1. Effect of different extraction time on yield of crude glycoprotein from A. davidianus mucus
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图 2 不同提取温度对得率的影响
Figure 2. Effects of temperature on yield of crude glycoprotein from A. davidianus mucus
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图 3 不同提取液浓度对得率的影响
Figure 3. Effects of concentration of NaOH on yield of crude glycoprotein from A. davidianus mucus
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图 4 不同料液比对得率的影响
Figure 4. Effects of solid-liquid ratio on yield of crude glycoprotein from A.davidianus mucus
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图 6 MGP色谱分离图
注：（a） MGP（0.15、0.25、0.35、0.45 mol/L NaCl）DEAE-52阴离子交换柱层析的洗脱图；（b） MGP Sephadex G-100洗脱图。
Figure 6. Chromatographic isolation of MGP
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图 8 MGP紫外全波长扫描图（a）和MGP β-消除反应实验（b）
Figure 8. UV spectra of MGP (a) and UV spectrum profiles of β-elimination before and after alkali treatment (b)
表 1 Box-Behnken试验设计因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design
水平 因素 A
料液比（g/mL）B
温度（℃）C
提取时间（h）D
提取液浓度（mol/L）−1 1:25 40 4 0.2 0 1:30 50 5 0.3 1 1:35 60 6 0.4 
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表 2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface test
试验号 A
料液比（g/mL）B
温度（℃）C
提取时间（h）D
提取液浓度（mol/L）得率（%） 1 1:30 40 4 0.3 4.71±0.49 2 1:30 40 6 0.3 4.89±0.26 3 1:30 60 4 0.3 4.91±0.52 4 1:30 60 6 0.3 4.87±0.19 5 1:25 50 5 0.2 4.75±0.59 6 1:25 50 5 0.4 4.78±0.72 7 1:35 50 5 0.2 4.77±0.10 8 1:35 50 5 0.4 4.92±0.53 9 1:25 50 4 0.3 4.77±0.32 10 1:25 50 6 0.3 4.93±0.41 11 1:35 50 4 0.3 4.82±0.61 12 1:35 50 6 0.3 4.91±0.13 13 1:30 40 5 0.2 4.79±0.21 14 1:30 60 5 0.2 4.77±0.31 15 1:30 40 5 0.4 4.79±0.37 16 1:30 60 5 0.4 4.94±0.61 17 1:30 50 4 0.2 4.79±0.13 18 1:30 50 6 0.2 4.76±0.55 19 1:30 50 4 0.4 4.75±0.49 20 1:30 50 6 0.4 4.98±0.19 21 1:25 40 5 0.3 4.64±0.49 22 1:25 60 5 0.3 4.88±0.16 23 1:35 40 5 0.3 4.84±0.12 24 1:35 60 5 0.3 4.92±0.10 25 1:30 50 5 0.3 5.13±0.82 26 1:30 50 5 0.3 5.11±0.71 27 1:30 50 5 0.3 5.12±0.61 28 1:30 50 5 0.3 5.17±0.77 29 1:30 50 5 0.3 5.17±0.44
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表 3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 0.5559 14 0.0397 32.83 <0.0001 ** A 0.0154 1 0.0154 12.74 0.0031 ** B 0.0331 1 0.0331 27.35 0.0001 ** C 0.0290 1 0.0290 23.98 0.0002 ** D 0.0234 1 0.0234 19.35 0.0006 ** AB 0.0064 1 0.0064 5.29 0.0373 * AC 0.0012 1 0.0012 1.01 0.3313 不显著 AD 0.0036 1 0.0036 2.98 0.1065 不显著 BC 0.0121 1 0.0121 10.00 0.0069 ** BD 0.0072 1 0.0072 5.97 0.0284 * CD 0.0169 1 0.0169 13.97 0.0022 ** A² 0.1601 1 0.1601 132.33 <0.000 1 ** B² 0.1550 1 0.1550 128.15 <0.000 1 ** C² 0.1219 1 0.1219 100.78 <0.000 1 ** D² 0.1977 1 0.1977 163.46 <0.000 1 ** 残差 0.0169 14 0.0012 失拟项 0.0137 10 0.0014 1.72 0.3176 不显著 纯误差 0.0032 4 0.0008 总误差 0.5729 28 回归系数R² 0.9704 注：*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
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表 4 MGP氨基酸组成分析
Table 4 Amino acid composition of MGP
氨基酸种类 MGP（g/100 g） 必需氨基酸 苯丙氨酸Phe* 5.04±0.08 缬氨酸Val 5.30±0.02 蛋氨酸Met* 0.50±0.04 苏氨酸Thr 7.43±0.03 异亮氨酸Ile* 5.93±0.03 亮氨酸Leu 5.81±0.03 赖氨酸Lys* 7.20±0.03 小计 37.21 非必需氨基酸 天冬氨酸Asp* 7.83±0.04 丙氨酸Ala 3.49±0.01 谷氨酸Glu 9.27±0.05 甘氨酸Gly* 4.01±0.07 丝氨酸Ser 4.85±0. 02 脯氨酸Pro 5.50±0.07 组氨酸His 1.30±0.05 酪氨酸Tyr 5.19±0.04 精氨酸Arg* 2.88±0.04 小计 44.32 总氨基酸 81.53 药用氨基酸 33.39 注：*标记为药用氨基酸。
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表 5 MGP红外光谱分析结果
Table 5 Results of FTIR analysis of MGP
MGP波数（cm−1） 振动方式官能团 3185.88 -NH伸缩振动 2965.29 CH3不对称伸缩振动 1637.06 C=O键的伸缩振动与N-H角振动 1551.18 C-H弯曲振动 1400.59 亚甲基平面内弯曲振动 1137.06 C-O-C拉伸振动 1040 C-O和C-H的拉伸振动 889.41 环状扭曲振动
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表 6 MGP在酰胺Ⅰ带的蛋白质二级结构含量
Table 6 Content of secondary structure of active peptide and amide Ⅰ-band protein in MGP
二级结构 酰胺Ⅰ带波数区间（cm−1） 相对含量（%） β-折叠 1600~1640 87 无规卷曲 1640~1650 8 α-螺旋 1650~1660 3 β-转角 1660~1700 2
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[1] WANG X M, ZHANG K J, WANG Z H, et al. The decline of the Chinese giant salamander Andrias davidianus and implications for its conservation[J]. Oryx,2004,38(2):197−202. doi: 10.1017/S0030605304000341
[2] 王文博, 刘品, 窦玲玲, 等. 中国大鲵研究概况[J]. 水生生物学报,2021,45(2):464−472. [WANG W B, LIU P, FAN L L, et al. A survey of Chinese giant salamander (Andrias davidianus)[J]. Acta Hydrobiologica Sinica,2021,45(2):464−472. doi: 10.7541/2021.2020.184 [3] 于海慧, 李伟, 佟长青. 大鲵体表黏液透明质酸提取及其抗氧化活性的研究[J]. 农产品加工,2018(10):18−21. [YU H H, LI W, TONG C Q. Purification and antioxidant of HA of skin mucus from Andrias davidianus[J]. Farm Products Processing,2018(10):18−21. doi: 10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2018.05.035 [4] ALIZADEH L, ABDOLMALEKI K, NAYEBZADEH K, et al. Effects of tocopherol, rosemary essential oil and Ferulago angulata extract on oxidative stability of mayonnaise during its shelf life: A comparative study[J]. Food Chemistry,2019,285:46−52.
[5] ANTIGONI O, EVANTHIA C, DIMITRIOS T, et al. Six common herbs with distinctive bioactive, antioxidant components. A review of their separation techniques[J]. Molecules,2021,26(10):2920. doi: 10.3390/molecules26102920
[6] RANI P, YU X, LIU H, et al. Material, antibacterial and anticancer properties of natural polyphenols incorporated soy protein isolate: A review[J]. European Polymer Journal,2021:152.
[7] HEREDIA-CASTRO P Y, REYES-DIAZ R, ANGEL R M, et al. Novel bacteriocins produced by Lactobacillus fermentum strains with bacteriostatic effects in milk against selected indicator microorganisms[J]. Journal of Dairy Science,2021,104(4):4033−4043. doi: 10.3168/jds.2020-19531
[8] ABDEL-SHAFI S, OSMAN A, AL-MOHAMMADI A R, et al. Biochemical, biological characteristics and antibacterial activity of glycoprotein extracted from the epidermal mucus of African catfish (Clarias gariepinus)[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,138:773−780.
[9] 王慧阳, 秦靖, 庄丹, 等. 蜗牛黏液多糖的提取、表征及抗氧化性和免疫活性[J]. 生物加工过程,2020,18(3):324−331. [WANG H Y, QIN J, ZHUANG D, et al. Isolation, characterization, antioxidant and immunomodulating activity of polysaccharides from Achatina fulica mucus[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering,2020,18(3):324−331. doi: 10.3969/j.issn.1672-3678.2020.03.009 [10] 杨慧, 陈德经, 陈海涛, 等. 大鲵肌肉分离蛋白特性[J]. 肉类研究,2020,34(7):28−32. [YANG H, CHEN D J, CHEN H T, et al. Characteristics of proteins isolated form giant salamander muscle[J]. Meat Research,2020,34(7):28−32. doi: 10.7506/rlyj1001-8123-20200515-121 [11] GUO B L, BI S, ZHANG B Y, et al. Synthesis of nanoparticles with a combination of metal chelation and molecular imprinting for efficient and selective extraction of glycoprotein[J]. Microchemical Journal,2021:167.
[12] 温雪, 郑海娇, 张扬, 等. 基于整体柱的糖基化蛋白质分离富集方法的研究进展[J]. 分析化学,2020,48(1):13−21. [WEN X, ZHENG H J, ZHANG Y, et al. Progress in monolithic column-based separation and enrichment of glycoproteins[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry,2020,48(1):13−21. doi: 10.1016/S1872-2040(19)61207-7 [13] LIN Y Y, PI J J, JIN P Y, et al. Enzyme and microwave co-assisted extraction, structural characterization and antioxidant activity of polysaccharides from purple-heart radish[J]. Food Chemistry,2022,372:131274−131274. doi: 10.1016/j.foodchem.2021.131274
[14] LI Z R, WANG B, CHI C F, et al. Purification and characterization of an antioxidant glycoprotein from the hydrolysate of Mustelus griseus[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,52:267−274. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2012.10.025
[15] 徐伟良. 大鲵皮肤粘液糖蛋白的提取纯化及抗肺癌活性研究[D]. 汉中: 陕西理工学院, 2015. XU W L. Anti-cancer activity of the purified extract glycoprotein with salamander skin mucus[D]. Hanzhong: Shanxi University of Technology, 2015.
[16] 张金豫, 刘豪, 孙会轻, 等. 大鲵黏液糖蛋白的提取纯化及其抗氧化性[J]. 中国食品学报,2018,18(9):175−181. [ZHANG J Y, LIU H, SUN H Q, et al. Extraction and purification of mucous glycoprotein from giant salamander and its antioxidant activity[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2018,18(9):175−181. [17] OSMAN A, ABDEL-SHAFI S, AL-MOHAMMADI A R, et al. Catfish glycoprotein, a highly powerful safe preservative of minced beef stored at 4 degrees for 15 days[J]. Foods,2020,9(8):1115. doi: 10.3390/foods9081115
[18] AHMADI E, REZADOOST H, ALILOU M, et al. Purification, structural characterization and antioxidant activity of a new arabinogalactan from Dorema ammoniacum gum[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2022,194:1019−1028. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2021.11.163
[19] 李敏, 薛慧清, 康宝玲, 等. 黄芪糖蛋白提取方法的比较及抗氧化性研究[J]. 山西中医学院学报,2018,19(6):31−35. [LI M, XUE H Q, KANG B L, et al. Study on extraction methods and antioxidant activity of Astragalus glycoprotein[J]. Journal of Shanxi University of Chinese Medicine,2018,19(6):31−35. [20] 刘俊奇. 藤茶的质量标准研究[D]. 武汉: 武汉轻工大学, 2020. LIU J Q. Study on guality standard of vine tea[D]. Wuhan: Wuhan Polytechnic University, 2015.
[21] 薛张芝, 张洪超, 丁源, 等. 墨鱼缠卵腺糖蛋白提取工艺优化及纯化[J]. 食品工业科技,2019,40(6):167−172, 178. [XUE Z Z, ZHANG H C, DING Y, et al. Optimization of extraction process and purification of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish[J]. Science and Technology of Food Industry,2019,40(6):167−172, 178. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2019.06.028 [22] WU J, CHEN B, FANG J, et al. Spectroscopic analysis of structural transformation in biodiesel oxidation[J]. China Petroleum Processing & Petrochemical Technology,2013,15(3):28−32.
[23] 李卫林, 张传海, 赵升云, 等. 紫薯糖蛋白提取工艺优化研究[J]. 食品工业,2017,38(8):103−106. [LI W L, ZHANG C H, ZHAO S Y, et al. Conditions optimization of glycoprotein extraction from purple sweet potato[J]. The Food Industry,2017,38(8):103−106. [24] 陈淑敏, 张玉琦, 龚芳芳, 等. 曼氏无针乌贼缠卵腺抗菌糖蛋白提取工艺优化[J]. 天然产物研究与开发,2019,31(10):1799−1806. [CHEN S M, ZHANG Y Q, GONG F F, et al. Optimization of the extraction technology of antibacterial glycoproteins from the nidamental gland of Sepiella maindroni[J]. Natural Product Research and Development,2019,31(10):1799−1806. doi: 10.16333/j.1001-6880.2019.10.019 [25] 秦高一鑫, 裴斐, 袁彪, 等. 豌豆蛋白和多糖同步提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J]. 中国粮油学报,2019,34(10):16−22. [QIN G Y X, PEI F, YUAN B, et al. Process optimization of simultaneous extraction of pea protein and polysaccharide and evaluation of antioxidant activity[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2019,34(10):16−22. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2019.10.004 [26] LI P, HUANG C Z, HU S X, et al. Efficient sparse representation response surface modelling and simulation method for complex products[J]. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering,2018,436(1):012005.
[27] 谭属琼, 谢勇武, 赵灿, 等. 响应面优化番茄鸡肉酱制备工艺[J]. 中国调味品,2022,47(5):119−125. [TAN S Q, XIE Y W, ZHAO C, et al. Opimization of preparation technology of tomato and chicken sauce by response surface methodology[J]. China Condiment,2022,47(5):119−125. doi: 10.3969/j.issn.1000-9973.2022.05.021 [28] QIN G Y X, XU W, LIU J P, et al. Purification, characterization and hypoglycemic activity of glycoproteins obtained from pea (Pisum sativum L.)[J]. Food Science and Human Wellness,2021,10(3):297−307. doi: 10.1016/j.fshw.2021.02.021
[29] NIE S P, XIE M Y FU Z H, et al. Study on the purification and chemical compositions of tea glycoprotein[J]. Carbohydrate Polymers,2008,71(4):626−633. doi: 10.1016/j.carbpol.2007.07.005
[30] BONGIOANNI A, SOLEDAD B M, ALEJANDRA M B, et al. Amino acids and its pharmaceutical applications: A mini review[J]. International Journal of Pharmaceutics,2022:613.
[31] ZHOU Y H, MA Y L, LI L R, et al. Purification, characterization, and functional properties of a novel glycoprotein from tartary buckwheat (Fagopyrum tartaricum) seed[J]. Food Chemistry,2020,309:125671. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125671
[32] 胡懿化, 王星滟, 张武霞, 等. 黑豆糖蛋白的结构分析及抗氧化和免疫活性[J]. 食品科学,2020,42(17):1−13. [HU Y H, WANG X Y, ZHANG W X, et al. Characterization of glycoproteins with antioxidant and immunological activities from black beans[J]. Food Science,2020,42(17):1−13. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20190730-414 [33] 刘晓飞, 侯艳, 马京求, 等. 发芽糙米糖蛋白结构表征及抗氧化性能分析[J]. 中国食品学报,2021,21(7):328−337. [LIU X F, HOU Y, MA J Q, et al. Structure characterization and antioxidant properties analysis of germinated brown rice glycoprotein[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2021,21(7):328−337. [34] ZHANG G Q, HAN L R, ZHANG G F, et al. Purification and characterization of a novel glycoprotein from Streptomyces sp. ZX01[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015,78:195−201. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2015.04.012
[35] 白雁, 鲍红娟, 陈志红, 等. 药用菊花不同提取部位的红外光谱分析[J]. 中成药,2007(3):401−406. [BAI Y, BAO H J, CHEN Z H, et al. Analysis on the different extracted parts of Flos Chrysanthemi from different regions by FT-IR[J]. Chinese Traditional Patent Medicine,2007(3):401−406. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2007.03.027 [36] 姚行行, 郭妍, 庄永亮. 云南鲷鱼骨胶原蛋白的制备及其理化性质[J]. 食品科学,2018,39(13):35−40. [YAO H H, GAO Y, ZHUANG Y L, et al. Preparation and physicochemical properties of collagen from bone of Yunnan bream[J]. Food Science,2018,39(13):35−40. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201813006 [37] YUN L Y, WANG S, WU T, et al. Structural characterization of a novel glycoprotein in wheat germ and its physicochemical properties[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2018,117:1058−1065. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.05.169
[38] 邱伟芬, 杨文建, 薛梅, 等. 条斑紫菜多糖的纯化、理化性质及其免疫活性研究[J]. 食品科学,2013,34(23):51−56. [QIU W F, YANG W J, XUE M, et al. Purification, physicochemical properties and immunomodulatory activity of polysaccharides from Porphyra yezoensis[J]. Food Science,2013,34(23):51−56. [39] 徐文彬, 高博兰, 祝全超, 等. 不同热处理棉籽中蛋白质分子结构与其营养价值、瘤胃降解特性的相关性研究[J]. 动物营养学报,2020,32(3):1272−1283. [XU W B, GAO B L, ZHU Q C, et al. Correlation between protein molecular structure and protein nutritional value or ruminal degradation characteristics in different heat-treated cottonseeds[J]. Chines Journal of Animal Nurition,2020,32(3):1272−1283. -
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1. 张皓然，张琴，文丽琼，零莉，胡俊杰，岑仕宇，王勤志，陈德慰. 利用~1H NMR测定姜中姜辣素与姜黄素. 中国调味品. 2025(01): 193-200 . 
百度学术
2. 李晓娟，钟梨，彭开锋，尹军，曾新安，刘志伟，韩忠. 脉冲电场强化生姜姜酚提取及工艺优化. 现代食品科技. 2024(09): 270-277 . 百度学术
3. 王芮，蒋起宏，周宇芳，陈慧，朱正华，刘书来，相兴伟. 贻贝多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢的影响. 食品工业科技. 2023(15): 385-391 . 本站查看
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