pH Coupled Citric Acid Feeding Strategy to Promote Spore Production of Bacillus licheniformis
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摘要: 在30 L罐水平研究了耦合pH补加柠檬酸对地衣芽孢杆菌生长、代谢以及芽孢形成的影响，通过qPCR检测了细胞对数期能量代谢、氧化应激效应、氨基酸转运相关基因表达水平差异。结果表明，发酵19.5~28 h耦合pH7.5补入78 μmol/L的柠檬酸，延长了细胞生长和芽孢生成周期，峰值生物量（36 h）达到4.2×1010 CFU/mL，较对照（未补柠檬酸）提高42.9%；芽孢数（36 h）达到4.1×1010 CFU/mL，较对照（24 h峰值1.3×1010 CFU/mL）提高215.4%。qPCR测定发现icd、zwf和cydA表达量分别是对照的2.6、4.1和1.9倍，而brnQ、vpr、yvbW、katA、yqjM、ahpF、sodA和abrB分别较对照下调88%、18%、65%、89%、10%、90%、41%和60%。说明柠檬酸的补加增强了TCA循环、HMP途径以及电子传递效率，同时减弱了氧化胁迫效应、提高了Spo0A的磷酸化水平，促进了芽孢形成效率。研究结果为芽孢杆菌工业化高效发酵生产提供了理论支撑。Abstract: The effects of citric acid addition coupled with pH on cell growth, metabolism, and spore yield of B. licheniformis were studied in a 30 L bioreactor, and the gene expression differences related to energy metabolism, oxidative stress effect, and amino acid transport at the log-phase were examined by qPCR. Results showed that: Citric acid supplement coupled with pH7.5 during 19.5~28 h was conducted, reaching a final content of 78 μmol/L in the medium. The feeding strategy prolonged the periods of cell growth and spore formation, and the peak cells (36 h) reached 4.2×1010 CFU/mL that was 42.9% higher than the control (without citric acid supplement). Meanwhile, spore yield (36 h) reached 4.1×1010 CFU/mL, increased by 215.4% compared with the control (24 h, 1.3×1010 CFU/mL). The qPCR assays showed that the expression levels of icd, zwf and cydA was 2.6, 4.1 and 1.9 times higher than that of the control, respectively. Meanwhile, brnQ, vpr, yvbW, katA, yqjM, ahpF, sodA and abrB were decreased by 88%, 18%, 65%, 89%, 10%, 90%, 41% and 60% compared with the control, respectively. The data suggested that citric acid supplementation enhanced the efficiencies of TCA cycle, HMP pathway and electron transport, weakened the oxidative stress effects on cells, and improved the phosphorylation level of Spo0A, thus promoting the sporulation efficiency. The results would provide theoretical supports for the industrial production of Bacillus fermentation efficiently.
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Keywords:
- Bacillus licheniformis /
- citric acid /
- biomass /
- spores /
- qPCR
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地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，其生长代谢过程中能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶[1-2]、生物活性物质、促生长因子[3]等。由于其丰富的产酶能力和食品安全性，地衣芽孢杆菌长期应用于食品工业和微生态[4]等领域。如：地衣芽孢杆菌强化大曲酒醅发酵能效抑制异味酚类物质合成、提高芳香类和吡嗪类物质含量[5]。地衣芽孢杆菌还被应用于治疗肠易激综合征[6]。
豆粕是地衣芽孢杆菌高密度发酵（细胞数1.0×1010~2.0×1010 CFU/mL，芽胞率90%左右）常用氮源[7-9]，但一味提高豆粕浓度并不能提高芽胞产量[10]。因为芽孢形成还与Spo0A含量及其磷酸化水平[11]以及调控蛋白AbrB有关，余志强[12]和Takeko[13]分别构建了B. subtilis的spo0A缺失突变株均不产芽孢。而焦晓阳[14]过表达B.subtilis的abrB则芽孢率降低了73.1%。因而，芽孢的形成是Spo0A-AbrB调控系统对培养环境响应平衡的结果。另外，蛋白是芽孢重要组分[15-17]，因而氨基酸透过酶[18]和能量供应[19]是芽孢形成的重要条件。第三，芽孢杆菌发酵过程产生的活性氧（H2O2等）对细胞产生氧化胁迫[20-21]，引起能量供应效率下降，细胞以NADPH作为最终电子受体[22]进行氧化应激反应[23]。但是，发酵中后期芽孢杆菌氧化应激与芽孢形成（如：能量、氨基酸转运等）的代谢体系是否匹配尚未明确。
高芽孢率是地衣芽孢杆菌应用于食品发酵工业和微生态领域的基础条件，培养基[7-10]和发酵参数优化在一定程度上能提高生长和芽孢率，如：枯草芽孢杆菌发酵过程添加柠檬酸可抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性、促进6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，并促进细胞生长[24]。但是工业生产过程芽孢形成的限制因素尚不明确，特别是氧化应激与能量和氨基酸的供应效率与芽孢生成体系之间的代谢匹配性。因而，本文研究了柠檬酸对碳中心代谢、能量代谢、氧化应激以及氨基酸供应和芽孢形成过程关键基因表达的影响，为提高芽孢形成效率提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
地衣芽孢杆菌M52（Bacillus licheniformis M52） 发酵工程教育部重点实验室保藏；2×SYBR Green qPCR Mix、Trizol、First Strand cDNA Synthesis Kit Genenode公司；DL2000 DNA Marker TIANGEN公司；ddH2O（DNase/RNase Free） Genecopoeia公司；其他实验试剂 均为国产分析纯。
BIOTECH-30JS 发酵罐 上海保兴生物设备有限公司；7900HT实时荧光定量PCR仪 美国罗氏公司；Nano-100微量分光光度计 杭州奥盛仪器有限公司；EDC-810PCR仪 东胜创新生物科技有限公司；JY300水平电泳仪器、JY02S紫外分析仪 北京君意东方电泳设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基配制
试管、茄子瓶斜面和平板计数培养基（g/L）：酵母浸膏20，NaCl 5，琼脂粉20，调pH7.5，123 ℃，灭菌30 min。
30 L发酵罐培养基（g/L）：玉米淀粉35，豆粕40，蛋白胨8，葡萄糖5，酵母浸粉3，轻质碳酸钙3，七水硫酸镁0.5，氯化钠2，三水磷酸氢二钾2，一水合硫酸锰0.3。
1.2.2 地衣芽孢杆菌培养方法
从本实验保存的地衣芽孢杆菌甘油管转接到试管斜面中，37 ℃培养36 h。将活化后的菌种转接至新鲜茄子瓶斜面（60 mL培养基/250 mL茄子瓶），37 ℃培养24 h，再向茄子瓶中加入50 mL无菌水，制备菌悬液80 ℃水浴10 min后接种。
发酵液体积按罐容积的60%（18 L）计，121℃，蒸汽灭菌30 min。发酵条件：35 ℃，转速500 r/min，通风量1.0 m3/h，发酵罐压维持在0.04～0.05 MPa，发酵周期36 h。
取样：发酵24 h开始，每3 h取样，分别测定活菌数和芽孢数。取27 h样进行qPCR测定。
1.2.3 柠檬酸补料实验
柠檬酸溶液（质量浓度50%）121 ℃灭菌后备用。发酵pH回升至7.5时，罐上设置反向耦合（pH大于7.5自动补料启动）流加柠檬酸，至28 h停止，罐内柠檬酸终浓度78 μmol/L。对照为不进行柠檬酸补料的发酵培养。
1.2.4 细胞数和芽孢数的测定
细胞数：发酵液中细胞数（CFU/mL）采用稀释涂布平板法[25]测定。
芽孢数：将经过适当稀释后的菌液80 ℃水浴15 min，后进行平板涂布对芽孢进行计数。
产芽孢率计算公式：产芽孢率（%）=（芽孢数/活菌数）×100
1.2.5 实时荧光定量PCR（qPCR）
1.2.5.1 提取RNA
在Trizol试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞，每1.0×107细菌加1 mL的Trizol。研磨混匀后样本在室温（15～30 ℃）下放置5 min使核蛋白体完全解离，4 ℃，12000 r/min离心10 min，取上清。每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿。盖紧样品管盖，振荡混匀15 s并将其在4 ℃下静置2～3 min，4 ℃、12000 r/min离心10～15 min。取上清后，加同体积氯仿盖紧样品管盖，振荡混匀15 s并将其在室温下静置2～3 min。4 ℃、12000 r/min离心10～15 min，吸上层清液，至新1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，4 ℃放置10 min。剩余步骤参照说明书。
1.2.5.2 逆转录成cDNA
逆转录反应体系1。反应条件：42 ℃ 2 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，反应试剂：Total RNA/mRNA（≤2 µg），4 µL的4×gDNA Eraser Mix，加ddH2O（RNase free）至16 µL。
逆转录反应体系2。反应条件：42 ℃ 20 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，反应试剂：16 µL（体系1）加4 µL的5×TRUE RT Master Mix。逆转录完成的cDNA用于荧光定量PCR。
1.2.5.3 实时荧光定量 PCR 检测
反应体系如表1所示。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 cycles。绘制溶解曲线，最终数据以2-Δ（ΔCt）进行分析。
表 1 实时荧光定量 PCR 反应体系Table 1. Real-time fluorescence quantitative PCR reaction systemcDNA 2 µL Forward Primer（10 μmol/L） 0.4 µL Reverse Primer（10 μmol/L） 0.4 µL 2×SYBR Green qPCR Mix 10 µL ddH2O Up to 20 µL 1.2.5.4 引物设计
根据地衣芽孢杆菌生长代谢、氨基酸转运以及芽孢形成相关基因序列信息，以icd、zwf、cydA、relA、brnQ、vpr、yvbW、katA、yqjM、ahpF、sodA以及abrB的基因组序列为模板，以rpSE-F、rpSE-R为内参基因，按照qPCR的要求设计特异性引物，引物序列如表2所示。
表 2 扩增引物列表Table 2. List of amplified primers序号 引物名称 引物序列 产物长度（bp） 1 perR-F TATAAAGCTCTGGAAGGGAA 151 2 perR-R CGTGATAATGCTCGGATG 3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30brnQ-F
brnQ-R
yqjM-F
yqjM-R
zwf-F
zwf-R
sodA-F
sodA-R
relA-F
relA-R
icd-F
icd-R
citZ-F
citZ-R
yvbW-F
yvbW-R
vpr-F
vpr-R
katA-F
katA-R
cydA-F
cydA-R
ahpF-F
ahpF-R
abrB-F
abrB-R
rpSE-F
rpSE-RTGATGCCCTTGTCGCTTTTG
TTCGCTAAAACCTCGGCTCC
TTTTTATCACCGCTTTCCAACAA
ATCCATTTGGCGAAACCGAC
GGATGTTTTACTTGGCGATGGC
CGCTCTGTCTTCCACACCCAA
TCACCATACGAAGCACCATAACAC
TTGGTTTGGCGTGCTTGTGA
TGATGTGGTGGAAGATACGAGC
GGATGTCCTGAGCCATAGCCAC
CAACAAAACAGGCGAATGGCT
ACAGGACGCAGGCATGTAAACA
TTCGGACAGCCGTTTCTTTACTC
CAAACGCTTCCACTTCAACAGG
AACCCTGAGAAGGTCGTGCC
AGGACTCTCCGACACACCGTTG
GTCAGCACCATTCCGACCCAT
TGCGTATTGTGAGGGAGAGGCT
CGGATGCCGTATGGGATTTT
TTTCAATCGCCTCATACAAGTCCT
GGTGTTCGGTATTTTGACAACGG
CCCGCACAAACAAGTAGACAAGAA
GGTGTCGCATACTGCCCTCA
ACCGATTTGGACGAAGACGC
AGTTACAGGTGAAGTTTCTGATGACA
TTATTTTTGAGATTGAAGTTGTGCTTG
TGGTCGTCGTTTCCGCTTCG
TCGCTTCTGGTACTTCTTGTGCTT216
194
338
370
176
162
240
132
212
276
134
327
1211.3 数据处理
本文所有试验数据为3个平行试验的平均值，用平均值±标准差（SD）表示。采用Origin 9.0进行作图以及数据分析。
2. 结果与分析
2.1 地衣芽孢杆菌在30 L罐发酵生长和芽孢形成特征
地衣芽孢杆菌在30 L罐发酵生长和芽孢形成的特征如图1所示：细胞24~36 h处于对数生长期，细胞数由24 h的1.8×1010 CFU/mL对数生长至30 h的峰值（3.0×1010 CFU/mL），后自溶至33 h的2.4×1010 CFU/mL，并维持稳定。同时，芽孢数由24 h的1.3×1010 CFU/mL快速下降至27 h的8.9×109 CFU/mL后稳定维持到8.6×109 CFU/mL（33 h），后缓慢下降至36 h的6.6×109 CFU/mL。24 h获得最大芽孢率72.2%，后降至30 h芽孢率27.7%。30 h峰值细胞数是付维来等[26]报道的（30 h，1.2×1010 CFU/mL）2.5倍，反映了本发酵条件完全满足高密度发酵的要求。
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图 1 地衣芽胞杆菌M52在基础培养基的生长情况Figure 1. Growth of Bacillus licheniformis M52 in the basal medium芽孢杆菌高糖浓度生长会发生溢流代谢，合成如乙酸等溢流分子[27]，使发酵前期pH下降。发酵中后期葡萄糖耗尽后，细胞吸收溢流代谢产物[28]及氨基酸进行二次利用，因而pH开始回升。本批次发酵19.5 h时pH已经回升至7.5（如图1所示），说明培养基中糖已基本耗尽[29]。
以上数据说明实验条件下细胞生长可以达到较高细胞数，但发酵中后期细胞生长或芽孢仍存在不利因素。如：对数生长中后期细胞氧化应激效率、碳源不足等。芽孢杆菌中NADPH主要由磷酸戊糖途径（HMP）和三羧酸循环（如异柠檬酸脱氢酶ICD催化）生成，而NADPH是氧化应激反应中最终的电子受体。因而，后期碳不足引起的NADPH供应下降不利于菌体应对氧化胁迫[26]。柠檬酸作为ICD底物，经代谢可产生NADPH，可能在一定程度上缓解氧化胁迫。因此，在30 L罐水平后续研究了发酵19.5 h耦合pH流加柠檬酸对M52生长以及芽孢生成的影响。
2.2 pH耦合补加柠檬酸对地衣芽孢杆菌生长和芽孢数的影响
发酵19.5 h耦合pH流加柠檬酸溶液对M52生长以及芽孢生成的影响如图2所示：19.5～28 h耦合pH7.5补入柠檬酸，24~36 h细胞处于对数生长期，24 h的细胞数2.3×1010 CFU/mL（较不流加柠檬酸的对照发酵提高了27.8%），30 h细胞数3.1×1010 CFU/mL，与对照（30 h峰值3.0×1010 CFU/mL）接近。但是，与对照生长30 h后剧烈自溶不同的是：流加柠檬酸支撑了细胞生长至36 h的4.2×1010 CFU/mL，较对照峰值提高40.0%。同时，24 h芽孢数2.1×1010 CFU/mL，较对照（24 h芽孢数1.3×1010 CFU/mL）提高了61.5%；30 h芽孢数为2.8×1010 CFU/mL，较对照（30 h，8.3×109 CFU/mL）提高了250.0%；36 h的芽孢数是4.1×1010 CFU/mL，比对照（24 h芽孢数1.3×1010 CFU/mL、芽孢率72.2%）分别提高了215.4%和25.4%，生长期较对照明显延长。结果表明在对数生长期耦合pH7.5补加柠檬酸可能促进了TCA循环，降低了菌体受到的氧化胁迫，进而有效促进了生物量和芽孢地持续增长。
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图 2 补加柠檬酸对地衣芽胞杆菌M52生长的影响Figure 2. Effects of citric acid supplementation on the growth of Bacillus licheniformis M522.3 柠檬酸对地衣芽孢杆菌能量代谢途径关键基因表达的影响
刘钊远[30]过表达icd（编码异柠檬酸脱氢酶），显著提升地衣芽胞杆菌ATP和NADPH的供应。蔡冬波[31]构建地衣芽孢杆菌WX/pHY-zwf使胞内NADPH较对照提高了2.4倍，也增强了TCA循环icd等基因的表达。因而，考虑到NADPH在氧化应激中的作用[32]以及胞子衣蛋白质合成、氨基酸转运对能量的需求[20]，需要考察柠檬酸流加对icd、zwf、cydA、citZ等能量代谢相关基因表达的影响，如图3所示。
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图 3 能量代谢相关基因转录组表达差异Figure 3. Differences in expression of carbon metabolism-related genes流加柠檬酸组citZ（编码柠檬酸合酶）表达量较对照下调9%，而icd的表达量是对照的2.6倍，说明柠檬酸流加能够提高TCA循环和NADPH的生成效率。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf编码）是HMP途径限速酶，催化生成5-磷酸核酮糖和NADPH，zwf表达量是对照组的4.1倍，说明补加柠檬酸能够提高菌体NADPH供应。cydA参与编码电子传递链中细胞色素a氧化酶，其表达量较对照提高了1.9倍，表明补加柠檬酸后细胞有氧呼吸能力加强，能合成更多ATP，提高细胞的能量供应水平。
2.4 柠檬酸补加对地衣芽孢杆菌氧化应激相关基因表达的影响
芽孢杆菌高密度发酵过程中会产生大量活性氧（H2O2等），它们会对胞内蛋白质、DNA等物质造成氧化损伤以及引起电子传递和ATP合成效率下降，诱导了细胞氧化应激。芽孢杆菌细胞拥有一套氧化胁迫应激体系来应对发酵过程中产生的活性氧，如：H2O2与调控蛋白PerR互作引起PerR失活[33]，使katA（编码过氧化氢酶）、ahpF（编码烷基氢过氧化物还原酶）、sodA（编码超氧化物歧化酶）、yqjM（编码黄素氧化还原酶）等基因脱阻遏而大量表达[34-36]，而且NADPH是氧化应激反应的最终电子受体[23]来消除氧化损伤。柠檬酸显著促进了细胞的生长和芽孢的形成效率（图1~图2），因而需要考察柠檬酸对氧化应激相关基因表达的影响，如图4所示。
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图 4 氧化应激相关基因以及abrB表达差异Figure 4. Oxidative stress related genes and abrB expression differences与对照相比，katA、yqjM、ahpF和sodA分别较对照下调89%、10%、90%和41%。说明柠檬酸补料发酵过程中，发酵体系的氧化胁迫效应减弱，这可能与icd和zwf比对照表达提高2.6和4.1倍有关，因为NADPH是氧化应激反应的最终电子受体，柠檬酸流加引起了icd与zwf的过量表达，NADPH的供应得到显著增强，进而有效地降低了细胞的氧化损伤、促进了细胞生长效率（图1~图2）。同时，细胞也下调自身氧化应激的应答水平。这与曾昕[22]关于NADPH供应水平升高时，氧化胁迫水平降低、抗氧化酶相关基因以及DNA修复基因均下调的报道一致。
转录调控因子AbrB直接或间接调控的基因多达上百个，包括细胞壁（细胞膜）的合成、氨基酸的合成和运输等[37-38]。如：AbrB在对数期阻遏sigH的表达，使sigH处于一个较低水平，进而影响spo0A基因的表达。当芽孢形成条件适宜时，磷酸化的Spo0A又通过阻遏abrB的表达间接促进SigH水平上升，进而增强spo0A自身表达和芽孢的形成效率。因而，芽孢形成是Spo0A-AbrB调控系统对培养环境响应平衡的结果。柠檬酸对abrB表达的影响如图4所示，abrB表达量较对照下调60%，说明补料组的Spo0A磷酸化水平较高，进而促进了芽胞生成，使得流加组芽孢数在36 h达到4.1×1010 CFU/mL，比对照峰值提高了204.5%。
2.5 氨基酸转运蛋白相关基因表达差异分析
芽孢杆菌的孢子衣是芽孢蛋白质的主要组分，其含量占芽孢总蛋白的80%，因而氨基酸的有效转运是提高芽孢形成效率的前提条件，涉及到蛋白质的分解（Vpr蛋白酶）、支链氨基酸转运蛋白BrnQ、通用氨基酸转运酶YvbW等，另外，由于氨基酸的跨膜转运为次级主动运输方式，因而其转运效率又受到能量供应的影响。柠檬酸对brnQ、vpr和yvbW基因表达的影响如图5所示。
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图 5 氨基酸转运蛋白相关基因表达差异Figure 5. Differential expression of amino acid transporter-related genes补料组brnQ（编码BCAA转运蛋白）、vpr（编码丝氨酸蛋白酶）和yvbW（编码通用氨基酸转运酶）的表达量较对照分别下调88%、18%和65%。但24～36 h补料组生物量均高于对照组，说明培养条件下，胞外氨基酸的浓度不是细胞生长的限制因素。这也与解顺昌[9]和赵国纬[10]等的报道一致，也说明了芽孢杆菌发酵中一味地提高豆粕浓度来促进细胞和芽孢增长的方法是不尽合理的。
3. 结论
为了提高地衣芽孢杆菌芽孢率，研究了反向耦合pH流加柠檬酸对地衣芽孢杆菌生长、代谢以及芽孢形成的影响（发酵pH回升至7.5时启动流加柠檬酸至28 h，罐内柠檬酸终浓度78 μmol/L）。结果表明：柠檬酸的流加增强了TCA循环、HMP途径以及电子传递链效率，减弱了氧化胁迫效应、abrB表达量较对照下调60%提高了Spo0A的磷酸化水平。
高豆粕、蛋白胨等氮源浓度芽孢杆菌高密度发酵一定程度上能提高生物量和芽孢数，但芽孢杆菌高芽孢率工业发酵的瓶颈并不是氮源不足，而是发酵过程产生的氧化胁迫限制了氮源（如胞外氨基酸）的利用效率，进而影响了细胞和芽孢的生成效率。
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图 1 地衣芽胞杆菌M52在基础培养基的生长情况
Figure 1. Growth of Bacillus licheniformis M52 in the basal medium
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图 2 补加柠檬酸对地衣芽胞杆菌M52生长的影响
Figure 2. Effects of citric acid supplementation on the growth of Bacillus licheniformis M52
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图 3 能量代谢相关基因转录组表达差异
Figure 3. Differences in expression of carbon metabolism-related genes
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图 4 氧化应激相关基因以及abrB表达差异
Figure 4. Oxidative stress related genes and abrB expression differences
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图 5 氨基酸转运蛋白相关基因表达差异
Figure 5. Differential expression of amino acid transporter-related genes
表 1 实时荧光定量 PCR 反应体系
Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system
cDNA 2 µL Forward Primer（10 μmol/L） 0.4 µL Reverse Primer（10 μmol/L） 0.4 µL 2×SYBR Green qPCR Mix 10 µL ddH2O Up to 20 µL 
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表 2 扩增引物列表
Table 2 List of amplified primers
序号 引物名称 引物序列 产物长度（bp） 1 perR-F TATAAAGCTCTGGAAGGGAA 151 2 perR-R CGTGATAATGCTCGGATG 3
4
5
6
7
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9
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11
12
13
14
15
16
17
18
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30brnQ-F
brnQ-R
yqjM-F
yqjM-R
zwf-F
zwf-R
sodA-F
sodA-R
relA-F
relA-R
icd-F
icd-R
citZ-F
citZ-R
yvbW-F
yvbW-R
vpr-F
vpr-R
katA-F
katA-R
cydA-F
cydA-R
ahpF-F
ahpF-R
abrB-F
abrB-R
rpSE-F
rpSE-RTGATGCCCTTGTCGCTTTTG
TTCGCTAAAACCTCGGCTCC
TTTTTATCACCGCTTTCCAACAA
ATCCATTTGGCGAAACCGAC
GGATGTTTTACTTGGCGATGGC
CGCTCTGTCTTCCACACCCAA
TCACCATACGAAGCACCATAACAC
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TGATGTGGTGGAAGATACGAGC
GGATGTCCTGAGCCATAGCCAC
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TTATTTTTGAGATTGAAGTTGTGCTTG
TGGTCGTCGTTTCCGCTTCG
TCGCTTCTGGTACTTCTTGTGCTT216
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