Analysis of Sensory Quality, Physicochemical Characteristics and Microbial Diversity of Kombucha Beverages
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摘要: 为研究我国康普茶风味、发酵性能及微生物组成，本文收集了不同地区的12个康普茶样品，以其为发酵剂制备康普茶饮品，从感官品质、理化性质及微生物多样性等方面进行分析。结果表明，12个康普茶饮品风味具有一定差异，样品liq2酸甜比例适中，气味酸香无杂味，liq4口感寡淡且有腐臭的不良气味，liq10口感酸苦，其余各样品虽口感偏酸或偏甜，但无明显异味。在发酵过程中，大部分样品发酵液呈现pH和可溶性固形物下降、总酸上升、总酚含量波动的趋势，有机酸以葡萄糖酸、乙酸和乳酸为主，其中，liq2有机酸种类最为丰富，且苹果酸含量较高，发酵3和7 d的各康普茶饮品对DPPH自由基的清除率均在75%以上。微生物多样性分析结果表明，各样品中细菌主要包括驹形氏杆菌（Komagataeibacter）、葡糖杆菌（Gluconobacter）和醋酸杆菌（Acetobacter），真菌则以德克酵母（Dekkera）、Starmerella和接合酵母（Zygosaccharomyces）为主，除此以外部分样品中还含有假单胞菌（Pseudomonas）、不动杆菌（Acinetobacter）、镰刀菌（Fusarium）等有害微生物。本研究结果表明各康普茶样品发酵活力不同，有机酸组成与含量对风味具有一定影响，均具有良好的抗氧化能力，部分样品在微生物组成方面存在一定安全性问题，可为开发具有地域特色的康普茶产品提供理论依据。Abstract: In order to investigate the flavor, fermentation performance and microbial composition of kombucha in China, 12 simples were gathered from different regions to produce kombucha beverages. The physicochemical, sensory properties and microbial diversity of the beverages were evaluated in detail. Results indicated that the sensory properties of the beverages were different from each other. The simple liq2 had moderate sour and sweet taste and fragrant acid flavor, and the tastes of simple liq4 and liq10 were sour and bitter with putrefactive odor by contrast. Although the remaining simples tasted too sweet or too sour, no distinct bad odors were noticed. While the pH values and soluble solids content decreased, the total acidity value increased. Total phenolic content of the beverages fluctuated during fermentation process. The organic acids were mainly composed of gluconic acid, acetic acid and lactic acid, meanwhile the simple liq2 had the most abundant species of organic acids and high content of malic acid. Kombucha beverages fermented for 3 and 7 days exhibited good DPPH free radical scavenging activities with scavenging rates over 75%. The results of microbial diversity analysis showed that the dominant bacterial genus in each sample included Komagataeibacter, Gluconobacter and Acetobacter, while the dominant fungal genus were Dekkera, Starmerella and Zygosaccharomyces. There were also some harmful microorganisms such as Pseudomonas, Acinetobacter and Fusarium existed in some simples. The results indicated that the fermentation performance of the collected kombucha samples were different from each other while all the beverages exhibited good antioxidant activity. The flavour of the beverage was affected by the composition and content of organic acids. Also it should be noticed that there were some safety problems about the microbiological compositions of part of the simples. This study provided the basis for further investigation of the properties of kombucha in China and development of kombucha products with regional characteristics.
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Keywords:
- kombucha /
- sensory quality /
- physicochemical properties /
- microbial diversity
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康普茶最早起源于我国，又被称为红茶菌、海宝茶，是一种具有独特清爽、酸甜口感的发酵饮料，通常由多种微生物混合发酵糖茶水制成，所用茶的种类主要包括绿茶和红茶等，除此以外，还可以向糖茶水中添加果蔬汁、植物浸提液和牛奶，或者直接利用上述物质为原材料进行发酵制备[1]。康普茶由发酵茶汤和菌膜组成，康普茶饮料的制作通常以先前发酵好的康普茶（包括茶汤和菌膜两部分）为发酵剂，向其中添加新的糖茶水或者其他基料，发酵时间从5~21 d不等，饮用前利用过滤或离心的方式去除菌膜。康普茶中的微生物主要包括酵母菌和细菌两大类，其种类和结构组成在一定程度上受发酵原料、地域等因素影响。目前，从康普茶中已经分离的酵母主要有类酵母属、裂殖酵母属、酒香酵母属、假丝酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属和圆酵母属等，细菌大部分为醋酸菌，主要包括醋酸杆菌、巴氏醋杆菌、产氮醋杆菌、葡糖醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌和驹形杆菌等，除此以外有些康普茶中还含有少量的乳酸菌，主要以乳杆菌为主[2-5]。发酵过程中上述混合微生物可对糖茶水等原料中的碳水化合物及其他组分进行代谢转化，产生独特风味，发酵后的产品化学组成复杂，含有机酸、维生素、活性酶、多酚和微量营养素等多种物质[6-9]。康普茶具有多种生物活性，例如能够抑制念珠菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌等微生物的生长，降低多发性硬化症中IFN-γ和IL-17水平及脊髓组织NO浓度[10]，抑制α-淀粉酶和脂肪酶的活性、降低糖尿病大鼠血糖水平，增强胞内脂质代谢、减轻炎症和组织纤维化缓解非酒精性脂肪肝损伤[11]，以及调节肠道菌群及其代谢物等[12]。
20世纪以来，康普茶在欧美的许多国家和地区流行，市场发展成熟，康普茶相关产品种类和品牌较为丰富，除最基础的以红茶、绿茶等为基料生产的康普茶外，还有以水果、草药、香料、蔬菜、藻类等为原料的许多品种，仅北美地区在康普茶酿造国际协会注册的公司品牌就有162家，在基础研究方面关于康普茶的体内体外活性、组分的纯化与结构分析、发酵动力学、微生物的分离纯化鉴定、制作原料的拓展等方面均开展了一定研究[13]。相比较而言，我国目前市场上售卖的康普茶品种较为单一，生产方面仍停留在小作坊阶段，产品安全性和稳定性较差，且缺乏正规、有影响力的品牌，而在基础研究方面，已有一些关于康普茶中微生物的分离筛选、活性评价等相关工作，但多以研究者所在地的某一种康普茶为研究对象，对于我国不同地区康普茶的微生物组成、发酵性能、生理活性等缺乏统一的研究和比较。
针对上述问题，本研究收集了来自我国不同地区的12个康普茶样品，利用其发酵液和菌膜进行康普茶饮料发酵制备，评价其感官、发酵性能及活性，利用扩增子测序技术对其微生物多样性进行分析，为研究我国地域性康普茶性质、开发具有我国特色的康普茶产品提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
绿茶 张一元茶叶有限责任公司；白砂糖 北京糖业烟酒集团有限公司；磷酸二氢钾、没食子酸、葡萄糖酸、乙酸、乳酸、抗坏血酸、柠檬酸、苹果酸、丙酸、乙腈 上海麦克林生化科技有限公司；DNA抽提试剂盒 美国Omega Bio-Tek公司；福林酚试剂（Folin-phenol）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、琼脂糖 上海生工生物科技有限公司；康普茶样品具体信息见表1。
表 1 康普茶样品基本信息Table 1. Basic information of kombucha samples样品编号 产地 样品编号 产地 liq1 山东济南 liq10 安徽亳州 liq2 陕西宝鸡 liq11 安徽亳州 liq3 广西南宁 liq13 新疆乌鲁木齐 liq4 山东济宁 liq14 陕西西安 liq5 广东湛江 liq15 广东湛江 liq9 辽宁沈阳 liq16 山东德州 PHS-25型台式pH计 青岛聚创环保集团有限公司；TGL-16G/B/C台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-1800PC紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；Epoch全波长酶标仪 美国BioTek公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器和B.02.01工作站） 美国安捷伦公司；0~80%Brix(糖)糖度计 上海力辰科技有限公司；ZSD-1090生化培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；ABI GeneAmp® 9700型PCR仪 美国ABI公司；JY600C三恒电泳仪 无锡久平仪器有限公司；MBE-200A凝胶成像仪 苏州宇恒生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 康普茶饮料制备
蒸馏水煮沸，分别按照10和100 g/L加入绿茶和白砂糖，搅拌均匀，浸泡10 min，用四层纱布过滤并分装至烧杯中，每个烧杯中加入300 mL的糖茶水，待冷却至室温后，接入10%（v/v）的各康普茶样品的液体部分和5%（w/v）的菌膜部分，置于28 ℃静置培养，分别于1、3、5、7 d时取样备用。
1.2.2 康普茶饮料感官评价
根据谭培科等[14]的方法加以修改并对发酵7 d的康普茶饮料进行感官评价。感官评价小组（包括2名男性，8名女性，来自北京联合大学生物化学工程学院）分别从色泽、气味、滋味、整体喜好度四个方面进行评价（表2）。按照色泽20%、气味20%、滋味20%、整体喜好度40%计算各样品的综合得分，并按照分数80～100、70～79、60～69分为好、中、差三组。
表 2 康普茶饮料感官评价标准Table 2. Sensory evaluation criteria of kombucha beverages项目 评分标准 评分 色泽 发酵液呈淡黄色，颜色均匀一致 80~100 发酵液颜色偏深或偏浅，颜色均匀一致 50~79 发酵液颜色过深或过浅，发暗无光 0~49 气味 有甜香味及酸香味，气味协调柔和 80~100 酸味较刺鼻或较弱，但气味整体较协调柔和 50~79 甜香味弱，酸味刺鼻或有异味，气味不协调柔和 0~49 滋味 酸甜适中，口味纯，口感细腻润滑 80~100 酸甜比例差，略带杂味，口感较细腻润滑 50~79 偏酸或偏甜，杂味明显，口感粗糙 0~49 整体喜好度 发酵液呈淡黄色，颜色均匀一致；气味协调柔和；
酸甜适中，口感细腻润滑80~100 发酵液颜色偏深或偏浅，气味较协调柔和酸甜
比例差，略带杂味，口感较细腻润滑50~79 发酵液颜色过深或过浅，气味不协调柔和杂味明显，
口感粗糙0~49 1.2.3 发酵性能及理化性质测定
1.2.3.1 pH的测定
采用pH计对康普茶发酵液进行测定。
1.2.3.2 可溶性固形物含量的测定
样品于8000 r/min离心10 min，用糖度计测定发酵液中可溶性固形物的含量。
1.2.3.3 总酸的测定
参照KAEWKOD等[6]的方法进行总酸的测定，单位为g/100 mL（以乙酸计）。
1.2.3.4 有机酸的测定
采用高效液相色谱对康普茶中的有机酸进行检测。样品于室温12000 r/min离心10 min，取上清，用流动相进行10倍稀释，经0.22 µm滤膜过滤处理后备用。色谱柱：月旭Ultimate®OAA色谱柱（4.6 mm×250 mm）；流动相：KH2PO4水溶液（0.01 mol/L，pH2.6），流速0.5 mL/min；柱温：30 ℃，进样量10 μL；检测波长：210 nm。
1.2.3.5 总酚含量的测定
参照WU等[15]方法对样品总酚含量进行检测，样品于8000 r/min离心10 min，稀释至合适浓度备用。取稀释样品1 mL于具塞试管中，加入Folin-Phenol试剂（10倍稀释）0.5 mL，混匀后在室温静置5 min，依次加入10%的Na2CO3溶液1.5 mL、去离子水2 mL，混匀，于40 ℃保温10 min、25 ℃下显色1 h，测定760 nm下的吸光度值，记录。样品中总酚含量以没食子酸计，根据标准曲线y=7.0061x−0.0164；R2=0.9981计算。
1.2.3.6 DPPH自由基清除率的测定
参照丁艳如[16]的方法对样品DPPH自由基清除能力进行测定，样品于8000 r/min离心10 min，稀释10倍备用，在该稀释倍数下康普茶本身几乎无色。取稀释样品2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL于具塞试管中，混匀，于黑暗中反应30 min，空白对照为10倍稀释样品与溶剂混合，以维生素C为阳性对照，测517 nm下的吸光度。DPPH自由基清除率如下计算。
DPPH自由基清除率(%)=(1−A2−A1A0)×100 式中：A2为样品与DPPH反应后在517 nm处的吸光度；A1为样品与溶剂混合后在517 nm处的吸光度；A0为溶剂与DPPH反应后在517 nm处的吸光度。
1.2.3.7 微生物多样性分析
根据DNA提取试剂盒说明书进行总DNA提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物对V3~V4可变区进行PCR扩增，扩增程序：98 ℃预变性1 min，98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）引物对真菌ITS2区进行PCR扩增，扩增程序为98 ℃预变性1 min、98 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板。使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化，2%琼脂糖电泳检测。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。
1.3 数据处理
所有实验均做3次平行，数据以平均值±标准差（
¯X ±SD）表示；采用Excel 2010进行数据处理，使用Origin 2019绘图；利用Qiime 2 Diversity软件进行Alpha多样性分析。2. 结果与分析
2.1 康普茶饮料感官评价结果
选择发酵7 d的康普茶分别从色泽、气味、滋味、整体喜好度四个维度进行感官评价和分组（表3）。对好、中、差三组进行分析发现，分组为好的样品liq2滋味评分较高，色泽和气味评分接近，品评者认为liq2样品酸甜比例相对适中，气味酸香且无杂味；分组为中的样品在色泽上与分组为好的样品基本无差别，但气味和滋味评分较低，在气味上，品评者认为该组的样品气味有些偏酸或无明显酸味，例如：样品liq1、liq5、liq9、liq11、liq14、liq15、liq16气味偏酸有些刺鼻，liq3、liq13酸香气较弱，而滋味方面，品评者一致感觉liq1、liq11、liq15口感偏酸，liq5、liq9、liq14口感极酸，liq3号口感太甜；分组为差的样品在色泽、气味和滋味方面评分都较低，liq4口感寡淡，并且有一股腐臭的不良气味，liq10口感酸苦，发酵液颜色浑浊（图1）。
表 3 康普茶饮料感官评价结果Table 3. Sensory evaluation of kombucha beverages样品 得分 分组 样品 得分 分组 liq1 76.6 中 liq10 62.9 差 liq2 84.5 好 liq11 73.4 中 liq3 70.0 中 liq13 77.4 中 liq4 63.3 差 liq14 71.5 中 liq5 72.0 中 liq15 76.1 中 liq9 71.2 中 liq16 76.7 中 2.2 康普茶饮料发酵制备过程中pH变化
康普茶发酵过程中会将糖茶水中的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，进而代谢产生大量的乙酸、葡萄糖酸等，增加环境酸度，降低pH[6]。在未接种之前，糖茶水的pH为7.17，接种后liq10的pH降低至4.2，其余糖茶水的pH降低至3.0左右，这可能是因为接种的康普茶原液酸度较高；随后liq11、liq15的pH逐渐降低，除liq11、liq15外其他样品的pH先升高，再逐渐降低，不同的变化趋势可能是由于不同康普茶样品的微生物组成不同。如图2所示，大部分样品在发酵的0~5 d pH逐渐降低，6~7 d pH逐渐趋于稳定，最终发酵液的pH在2.5~3.4之间，而样品liq4、liq13在发酵期间pH无明显变化，在整个发酵过程中，liq4始终维持在3.4左右，liq13始终维持在3.0左右。以往的研究报道中，康普茶发酵后的pH也一般维持在2~3左右，例如ZOU等[17]分别以紫鹃茶、红茶和绿茶为原料在 28 ℃ 发酵 14 d 后，其 pH 分别为 2.6、2.8 和 2.6；JAKUBCZYK等[18]以绿茶、黑茶、白茶、红茶四种不同的茶叶为基底，在28 ℃培养7 d后，发酵液的pH分别为2.61、2.62、2.53、2.38，在发酵14 d后，康普茶的pH进一步降低至2.49、2.53、2.37、2.32。
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图 2 康普茶饮料发酵过程中pH的变化Figure 2. Changes of pH in the fermentation process of kombucha beverage2.3 康普茶饮料发酵制备过程中可溶性固形物变化
可溶性固形物是发酵液中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等。研究表明，可溶性固形物与蔗糖含量呈正相关[19]。在发酵过程中，可溶性固形物的含量随发酵时间的延长而下降，且微生物活性越高，可溶性固形物含量越低。在康普茶发酵过程中，酵母菌和细菌利用糖茶水中的可溶性固形物生长繁殖，产生有机酸、乙醇和CO2等物质，导致发酵液中可溶性固形物含量不断下降。如图3所示，随着发酵的进行，liq2、liq3、liq5、liq9、liq11、liq13、liq14、liq15可溶性固形物含量有所下降，其中，liq15可溶性固形物含量变化最大，下降了25.53%；liq1、liq4、liq10、liq16在整个发酵过程中其可溶性固形物含量变化不大，维持在9.2~10°brx左右。
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图 3 康普茶饮料发酵过程中可溶性固形物的变化Figure 3. Changes of soluble solids in the fermentation process of kombucha beverage2.4 康普茶饮料发酵制备过程中总酸变化
总酸包含游离酸、结合酸和有机酸，是发酵过程中主要的代谢产物，可作为食品的防腐剂，延长食品的保藏时间。如图4所示，在发酵过程中发酵液的酸度整体呈现逐渐上升的趋势，在发酵结束后，liq2、liq11、liq15、liq16的酸度相对较高，分别达到2.680、3.152、2.960和2.100 g/100 mL，liq3、liq4、liq5、liq9、liq10、liq13、liq14样品酸度变化较小，在发酵结束后其酸度处于0.416~0.980 g/100 mL之间。康普茶的酸度受发酵时间、所用发酵剂和发酵原料影响，一般来说当添加水果原料时总酸高于单一茶基，例如：KAEWKOD等[6]以1%绿茶、乌龙茶、红茶和10%蔗糖为原料，在室温下发酵15 d后，各茶基康普茶的总酸度在1.100～1.700 g/100 mL之间；宋清鹏等[20]以龙眼果肉和糖茶水为发酵原料，在发酵6 d后发酵液的总酸含量达到2.600 g/100 mL；王柳玲等[21]以荔枝果汁为发酵原料制备康普茶，32 ℃发酵6 d后，发酵液的总酸含量可达2.480 g/100 mL。上述liq2、liq11、liq15和liq16等样品在绿茶基中总酸即可达2.100 g/100 mL以上，说明其发酵微生物具有较强的产酸能力。
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图 4 康普茶饮料发酵过程中总酸的变化Figure 4. Changes of total acid during fermentation process of kombucha beverage2.5 康普茶饮料有机酸组成与含量
有机酸与风味关联性较大，感官评价采用的是发酵7 d的样品，因此为与感官评价一致，对发酵7 d各样品中的有机酸进行检测和分析。结果表明，不同发酵液中有机酸的含量与种类均有较大差别，从种类上看，各样品中均含有葡萄糖酸、乙酸、乳酸和抗坏血酸，部分样品中还含有柠檬酸、苹果酸和丙酸；从含量上，各样品中以葡萄糖酸、乙酸和乳酸含量较高，抗坏血酸含量基本一致（表4）。
表 4 发酵7 d各样品中的有机酸含量Table 4. The content of organic acids in each sample after 7 days of fermentation分组 样品 有机酸（g/L） 葡萄糖酸 乙酸 乳酸 抗坏血酸 柠檬酸 苹果酸 丙酸 好 liq2 28.59±0.88 8.26±0.49 1.8±0.09 0.05±0.01 0.24±0.03 0.74±0.08 0.29±0.07 中 liq1 13.85±0.49 4.45±0.11 1.00±0.15 0.05±0.00 ND ND ND liq3 8.30±0.63 2.56±0.36 1.71±0.21 0.06±0.00 ND ND ND liq5 16.72±0.93 1.60±0.06 2.31±0.11 0.06±0.00 ND 0.40±0.03 0.93±0.08 liq9 11.01±1.23 1.96±0.25 2.44±0.42 0.05±0.00 0.34±0.05 ND 0.25±0.08 liq11 15.45±1.70 14.29±1.96 1.76±0.36 0.07±0.01 0.23±0.06 ND ND liq13 10.58±0.11 1.40±0.02 1.72±0.03 0.05±0.00 ND ND ND liq14 10.97±0.41 0.18±0.00 3.12±0.31 0.06±0.01 0.56±0.04 ND 0.23±0.02 liq15 27.17±0.73 10.39±0.09 1.70±0.43 0.06±0.01 0.28±0.01 ND ND liq16 6.07±0.75 4.83±0.51 2.65±0.09 0.07±0.00 0.98±0.09 ND 0.24±0.03 差 liq4 5.77±0.99 2.71±0.06 0.82±0.03 0.06±0.01 ND ND ND liq10 5.25±0.31 1.10±0.03 1.88±0.09 0.05±0.00 ND ND ND 注：ND表示该物质未检测到。 感官评价在好组的样品liq2有机酸种类最为丰富，特别是与其他样品相比，苹果酸含量较高，苹果酸的口感接近天然苹果，酸味柔和，是一种具有天然香味的安全性食品酸味剂，同时也是人体代谢过程中产生的重要有机酸，能直接参与线粒体能量代谢，具有增强机体耐力，缓解疲劳等生理功能[22]。感官评价在中组的各样品与liq2相比，有机酸的种类及总有机酸含量均有所减少，样品liq5虽含有一定的苹果酸，但发酵过程中产生了过量的丙酸，丙酸具有酸臭味，当吸入时会使喉咙产生不适感的刺激性酸[23]，当摄入过量时还会出现恶心、呕吐和腹痛等症状[24]。分组为差的各样品在种类上与其他两组相比只含有葡萄糖酸、乙酸、乳酸和抗坏血酸，并且各组分含量显著下降，可能因此造成风味较为寡淡。
2.6 康普茶饮料发酵制备过程中总酚变化
酚类化合物具有清除自由基和活性氧（如单线态氧、超氧自由基和羟基自由基）的能力，多酚含量越高，抗氧化活性越强，此外酚类化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等都有明显的抑制作用[25]。由图5可得，各样品总酚含量呈波动状态，在发酵的前3 d，总酚含量呈下降趋势，3 d后又逐渐上升，在发酵第7 d各样品发酵液（除liq4样品外）中总酚含量均高于未接种之前发酵液的总酚含量，liq13样品总酚含量最高，为2.03 mg/mL。
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图 5 康普茶饮料发酵过程中总酚的变化Figure 5. Changes of total phenols in the fermentation process of kombucha beverage2.7 康普茶饮料DPPH自由基清除率
对各样品不同发酵时间的DPPH自由基清除率进行检测，评估其抗氧化性能。由图6可得，发酵3和7 d时，各样品对DPPH自由基的清除率均在75%以上，远高于0.1 g/L维生素C溶液的自由基清除率。发酵第3 d时，liq2的DPPH自由基清除率最大，可达87.9%，在发酵的第7 d，liq3的DPPH自由基清除率最大，为92.8%。在发酵时间的影响方面，样品liq3、liq4、liq5、liq13、liq14、liq15和liq16在发酵7 d时DPPH自由基清除率高于发酵3 d样品，而样品liq1、liq2、liq9、liq10和liq11发酵7 d时的清除率与发酵3 d时相比有所下降或变化不大，表明在发酵制备过程中需控制好发酵时间，以便在合适时间内得到具有最佳抗氧化能力的康普茶饮料。
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图 6 康普茶饮料（A）和维生素C（B）的DPPH自由基清除率Figure 6. DPPH free radical scavenging rates of kombucha beverage (A) and vitamin C (B)2.8 康普茶饮料微生物多样性分析
2.8.1 细菌多样性分析
由图7可得，在门水平上，12个康普茶饮料中细菌主要由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，变形菌门占据主导地位，相对丰度在95.79%以上。在属水平上，各样品中主要以驹形氏杆菌属（Komagataeibacter）、醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡糖杆菌属（Gluconobacter）为主。其中liq1、liq2、liq3、liq5、liq9、liq10、liq11、liq13的优势属为驹形氏杆菌属，liq9样品的相对丰度最高，占比99.90%；liq4样品的优势属为醋酸杆菌属，其相对丰度为70.8%；liq14样品中则以驹形氏杆菌属和葡糖杆菌属为主，其中驹形氏杆菌属相对丰度为50.65%，葡糖杆菌属相对丰度为49.14%；liq15、liq16样品中葡糖杆菌占据主要地位。此外，假黄单胞球菌（Pseudoxanthomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、罗尔斯通式菌属（Ralstonia）、Georgenia、代尔夫特菌属（Delftia）、Paraburkholderia、噬冷菌属（Algoriphagus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、Cohnella、假单胞菌属（Pseudomonas）、德沃斯氏菌属（Devosia）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、Chujaibacter等在部分样品中也有所出现，上述菌属不在食品可添加微生物范围，并且像假单胞菌属、不动杆菌属等微生物中许多菌株可使动物或人类致病，是常见的条件致病菌[26-27]。
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图 7 康普茶饮料中细菌在门水平（A）和属水平（B）上的相对丰度Figure 7. Relative abundance of bacteria in kombucha beverage at phylum (A) and genus (B) levels2.8.2 真菌多样性分析
由图8可知，在门水平上，不同样品的优势菌门均为子囊菌门（Ascomycota），占比都在59%以上，其中liq15样品子囊菌门相对丰度最高（99.70%），liq9样品相对丰度最低（59.85%）。在属水平上，主要以德克酵母属（Dekkera）、Starmerella和接合酵母属（Zygosaccharomyces）为主。各样品中菌属的相对丰度差别较大，其中liq1、liq2、liq3、liq13、liq14主要以德克酵母属为主，liq4、liq10和liq16丰度最高的菌没有获得属分类；liq5、liq11和liq15的优势菌属为Starmerella，其中liq5的相对丰度最高，为90.91%；liq9的优势菌属为接合酵母属，相对丰度为51.98%。此外镰刀菌属（Fusarium）、枝孢属（Cladosporium）、木霉属（Trichoderma）、Sagenomella等菌属在部分样品中有所出现。镰刀菌属是一种重要的植物病原菌，可引起小麦、玉米、甘蔗、牧草等粮食和经济作物的多组织的腐烂，被镰刀菌侵染的谷物或者动物源食品和制品还会产生呕吐毒素等真菌毒素，该毒素具有细胞毒性、神经毒性和免疫毒性等多种毒性，食用后会导致人体多种急性或慢性中毒，严重时会损害造血系统甚至死亡，增加人体患胃癌、食管癌等恶性肿瘤的几率，可严重危害人和动物健康[28]。
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图 8 康普茶饮料中真菌在门水平（A）和属水平（B）上的相对丰度Figure 8. Relative abundance of fungi in kombucha beverage at phylum (A) and genus (B) levels3. 讨论与结论
本研究对收集的12个康普茶样品进行发酵品评，发现制备的各饮料感官差别较大，有些样品酸甜适口无杂味，有些口感过酸或过甜，有些则具有明显的苦涩甚至腐败气味，对发酵过程中pH、可溶性固形物、总酸等参数的监测也表明不同样品中微生物群的代谢、产酸等能力各不相同，部分样品中微生物群活力较弱，接种后可溶性固形物、总酸等几乎无变化，这可能是由于样品在收集前已进行了多次传代，造成菌株退化，活力下降。对于利用可溶性固形物、产酸能力相近的样品，在其有机酸组成方面也有所不同，例如：liq11和liq15与liq2相比总酸含量接近，但感官评价认为liq2气味酸香酸甜适中，liq11和liq15则气味有些刺鼻口感偏酸，可能与liq11和liq15中乙酸含量较高有关，liq2与liq11和liq15相比乙酸含量下降，同时还含有一定量的苹果酸，苹果酸酸味柔和绵长，能够中和乙酸产生的刺激，改善食品风味和品质。
微生物的种类和组成对康普茶的风味和活性具有重要影响，微生物多样性分析可以从整体角度对各样品的微生物群落结构特点进行描述。结果表明，本研究收集的各样品发酵制备的饮料中细菌主要为驹形氏杆菌、葡糖杆菌和醋酸杆菌，真菌则以德克酵母、接合酵母和Starmerella为主。HARRISON等[29]对北美地区的103个康普茶饮品进行高通量测序，发现酒香酵母和驹形氏杆菌在这些样品中最为普遍，丰度最高，ARIKAN等[3]采用宏基因组测序和扩增子测序相结合的方法对从土耳其当地家庭中收集的两个康普茶饮品进行了分析，发现优势真菌和细菌分别为接合酵母及驹形氏杆菌，与本文中样品的优势菌属有所不同，说明地域对康普茶微生物组成具有一定影响。除优势菌属外，通过多样性分析发现发酵的饮料中还含有许多在食品中不能使用的、甚至对人体有毒有害的微生物，这可能是由于收集的康普茶样品在其以往不规范的传代、培养过程中发生了污染，表明了建立标准规范康普茶生产工艺及菌剂传代培养的急迫性和重要性。
多酚是以茶叶为原料制备的康普茶中一类重要的活性成分，因此对各样品发酵过程中的总酚含量进行了分析，结果表明各样品中的总酚含量呈现波动趋势，这可能是由于发酵初期微生物对茶汤中的多酚类化合物进行了水解利用，而随着发酵的进行，微生物产生的某些酶可对大分子多酚进行水解、修饰及改造，例如：一些细菌和酵母可产生单宁酶，能够水解表没食子儿茶素、没食子酸酯和表儿茶素，分别释放出没食子酸酯表没食子儿茶素、没食子酸和葡萄糖等，其他一些微生物产生的胞外酶，如植酸酶和β-半乳糖苷酶等，也可水解多酚释放出结构简单的酚类化合物，ZHOU等[30]在以红茶和绿茶为原料进行发酵时发现没食子酸的含量随发酵时间的延长而逐渐增加，推测这可能是由于微生物产生的单宁酶所造成，蒋立文等[31]从康普茶中分离获得了的裂殖酵母和产膜醋酸菌，对两株菌进行单独发酵，评价其对儿茶素的代谢情况，结果表明两株微生物均可提高表没食子儿茶素以及没食子儿茶素的含量。
综上，本文从感官、理化性能评价以及微生物多样性的角度，对我国地域的康普茶性质及其安全性进行了一定的研究，为开发具有我国特色的康普茶产品提供理论依据，同时研究结果也说明传统的康普茶传代制备方法在产品安全性、保持菌种活力等方面存在一定的问题，表明了建立标准规范康普茶生产工艺及菌剂开发的急迫性和重要性。
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图 2 康普茶饮料发酵过程中pH的变化
Figure 2. Changes of pH in the fermentation process of kombucha beverage
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图 3 康普茶饮料发酵过程中可溶性固形物的变化
Figure 3. Changes of soluble solids in the fermentation process of kombucha beverage
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图 4 康普茶饮料发酵过程中总酸的变化
Figure 4. Changes of total acid during fermentation process of kombucha beverage
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图 5 康普茶饮料发酵过程中总酚的变化
Figure 5. Changes of total phenols in the fermentation process of kombucha beverage
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图 6 康普茶饮料（A）和维生素C（B）的DPPH自由基清除率
Figure 6. DPPH free radical scavenging rates of kombucha beverage (A) and vitamin C (B)
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图 7 康普茶饮料中细菌在门水平（A）和属水平（B）上的相对丰度
Figure 7. Relative abundance of bacteria in kombucha beverage at phylum (A) and genus (B) levels
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图 8 康普茶饮料中真菌在门水平（A）和属水平（B）上的相对丰度
Figure 8. Relative abundance of fungi in kombucha beverage at phylum (A) and genus (B) levels
表 1 康普茶样品基本信息
Table 1 Basic information of kombucha samples
样品编号 产地 样品编号 产地 liq1 山东济南 liq10 安徽亳州 liq2 陕西宝鸡 liq11 安徽亳州 liq3 广西南宁 liq13 新疆乌鲁木齐 liq4 山东济宁 liq14 陕西西安 liq5 广东湛江 liq15 广东湛江 liq9 辽宁沈阳 liq16 山东德州 
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表 2 康普茶饮料感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of kombucha beverages
项目 评分标准 评分 色泽 发酵液呈淡黄色，颜色均匀一致 80~100 发酵液颜色偏深或偏浅，颜色均匀一致 50~79 发酵液颜色过深或过浅，发暗无光 0~49 气味 有甜香味及酸香味，气味协调柔和 80~100 酸味较刺鼻或较弱，但气味整体较协调柔和 50~79 甜香味弱，酸味刺鼻或有异味，气味不协调柔和 0~49 滋味 酸甜适中，口味纯，口感细腻润滑 80~100 酸甜比例差，略带杂味，口感较细腻润滑 50~79 偏酸或偏甜，杂味明显，口感粗糙 0~49 整体喜好度 发酵液呈淡黄色，颜色均匀一致；气味协调柔和；
酸甜适中，口感细腻润滑80~100 发酵液颜色偏深或偏浅，气味较协调柔和酸甜
比例差，略带杂味，口感较细腻润滑50~79 发酵液颜色过深或过浅，气味不协调柔和杂味明显，
口感粗糙0~49
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表 3 康普茶饮料感官评价结果
Table 3 Sensory evaluation of kombucha beverages
样品 得分 分组 样品 得分 分组 liq1 76.6 中 liq10 62.9 差 liq2 84.5 好 liq11 73.4 中 liq3 70.0 中 liq13 77.4 中 liq4 63.3 差 liq14 71.5 中 liq5 72.0 中 liq15 76.1 中 liq9 71.2 中 liq16 76.7 中
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表 4 发酵7 d各样品中的有机酸含量
Table 4 The content of organic acids in each sample after 7 days of fermentation
分组 样品 有机酸（g/L） 葡萄糖酸 乙酸 乳酸 抗坏血酸 柠檬酸 苹果酸 丙酸 好 liq2 28.59±0.88 8.26±0.49 1.8±0.09 0.05±0.01 0.24±0.03 0.74±0.08 0.29±0.07 中 liq1 13.85±0.49 4.45±0.11 1.00±0.15 0.05±0.00 ND ND ND liq3 8.30±0.63 2.56±0.36 1.71±0.21 0.06±0.00 ND ND ND liq5 16.72±0.93 1.60±0.06 2.31±0.11 0.06±0.00 ND 0.40±0.03 0.93±0.08 liq9 11.01±1.23 1.96±0.25 2.44±0.42 0.05±0.00 0.34±0.05 ND 0.25±0.08 liq11 15.45±1.70 14.29±1.96 1.76±0.36 0.07±0.01 0.23±0.06 ND ND liq13 10.58±0.11 1.40±0.02 1.72±0.03 0.05±0.00 ND ND ND liq14 10.97±0.41 0.18±0.00 3.12±0.31 0.06±0.01 0.56±0.04 ND 0.23±0.02 liq15 27.17±0.73 10.39±0.09 1.70±0.43 0.06±0.01 0.28±0.01 ND ND liq16 6.07±0.75 4.83±0.51 2.65±0.09 0.07±0.00 0.98±0.09 ND 0.24±0.03 差 liq4 5.77±0.99 2.71±0.06 0.82±0.03 0.06±0.01 ND ND ND liq10 5.25±0.31 1.10±0.03 1.88±0.09 0.05±0.00 ND ND ND 注：ND表示该物质未检测到。
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