肝脏是机体铅代谢的重要场所，铅在体内随血液流动进入肝脏并在肝脏中蓄积，易造成肝脏损伤^[1]。1965年，Wills发现长期过量与铅接触会导致各脏器发生氧化应激^[2]。铅通过直接诱导机体产生大量活性氧和抑制抗氧化防御系统引发氧化应激，对DNA、蛋白质等生物大分子产生影响，从而干扰多种生化过程^[3]。核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是机体对抗外源性刺激的防御机制之一，Nrf2信号通路的激活有利于减轻肝脏铅损伤^[4]。因此，Nrf2作为改善小鼠肝脏铅损伤的研究靶点具有重大意义。

螯合剂通常用于治疗铅中毒，但它们被证实具有多种副作用^[5-6]。近年来，研究发现多糖具有改善器官铅损伤作用，如改善铅中毒大鼠学习记忆力^[7]、抑制炎症反应^[8]、保护肝脏和生殖系统等^[9]。罗耳阿太菌多糖（Athelia rolfsii polysaccharides, AEPS）是由罗耳阿太菌（Athelia rolfsii）以玉米淀粉和玉米黄浆为碳源和氮源发酵分泌的一种胞外多糖^[10]，具有良好的吸湿、保湿^[11]、抗氧化^[12]和螯合金属离子的性质^[13]。前期研究发现，灌胃AEPS减少了小鼠体内铅的积累，病理切片也证明AEPS减轻了小鼠大脑、肝脏、肾脏和睾丸的损伤^[14]。然而，AEPS能否通过调节Nrf2信号通路改善小鼠肝脏铅损伤的研究尚未见报道。本研究旨在探究AEPS保护铅暴露小鼠肝脏的作用机制，并通过腹腔注射Nrf2信号通路的抑制剂揭示上述作用机制与Nrf2信号通路的联系，为开发安全的能改善器官铅损伤的功能性食品添加剂提供一定的理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

罗耳阿太菌（Athelia rolfsii）　吉林农业大学发酵工程实验室；昆明种小鼠（生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001，SPF级，雄性，4周龄）　辽宁长生生物技术股份有限公司；EDTA二钠钙和全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）　美国Sigma公司；Nrf2抗体、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease 3，Cspase-3）抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗体、B淋巴细胞瘤-2（B lymphocyte tumor-2，Bcl-2）抗体　武汉爱博泰克（ABclonal）生物科技有限公司；多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）抗体　英国Abcam公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-s-transferase，GST）检测试剂盒　南京建成生物工程研究所；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、内参、BCA蛋白浓度测定试剂盒和细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒　碧云天生物技术研究所；PVDF膜　北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；醋酸铅　广东省精细化学品工程技术研究开发中心。

Z36HK型低温高速离心机　德国Hermle公司；AA-6200型火焰原子吸收分光光度计　日本津岛公司；EG1140型石蜡包埋机、RM2255型石蜡切片机　德国Leica公司；Olympus BX51型光学显微镜　日本Olympus公司；NIS-ELEMNT BR型图像分析系统　日本尼康公司；Infinite M200Pro型酶标仪　瑞士康泰集团有限公司；Mini-ProteanTetra型电泳槽　美国伯乐公司；DYCZ-40D型转膜仪　北京六一仪器厂。

1.2   实验方法

1.2.1   罗耳阿太菌多糖的制备

参照文献[11]培养罗耳阿太菌。发酵液依次用1 mol/L NaOH溶液调至pH7.0，80 ℃加热30 min，4 ℃，10000 g离心30 min。上清液经微孔滤膜除菌丝，用10 mg/mL木瓜蛋白酶脱蛋白，再用无水乙醇沉淀（上清液:乙醇，1:1.7，V/V），透析和冷冻干燥（−50 ℃）后得罗耳阿太菌多糖^[15]。罗耳阿太菌多糖的纯度为78.91%。罗耳阿太菌多糖由木糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸、塔罗糖和肌糖组成。

1.2.2   动物模型与分组

试验程序由吉林农业大学实验动物中心批准，所有动物手术都获得了当地伦理批准（批准号：2021 04 13 001）。试验开始前，72只昆明种小鼠适应试验环境7 d（环境温度22±1 ℃，环境湿度60%~65%），自然采光，动物自由饮食和饮水。所有小鼠随机等分为9组：空白对照组（NC）、模型组（MC）、阳性对照组（PC）、AEPS低剂量组（LD）、AEPS中剂量组（MD）和AEPS高剂量组（HD）、ATRA单独组（ATRA+NC）（该组用于验证ATRA的注射剂量能否抑制小鼠肝脏组织Nrf2信号通路）、ATRA干预组（ATRA+MC）（该组用于验证铅暴露小鼠肝脏组织Nrf2信号通路能否被ATRA抑制）、ATRA+AEPS高剂量组（ATRA+HD）（该组用于验证AEPS是否通过Nrf2信号通路发挥保护铅暴露小鼠肝脏组织）。

试验小鼠连续30 d自由饮用1 g/L醋酸铅水溶液建立铅中毒小鼠模型。NC组和ATRA+NC组小鼠自由饮用12.5 μL/L醋酸水溶液，持续30 d，其余组小鼠自由饮用1 g/L的醋酸铅水溶液，并补充醋酸溶液保持醋酸浓度为12.5 μL/L，以避免铅盐和氢氧化铅发生沉淀反应。ATRA+NC组、ATRA+MC组、ATRA+HD组小鼠腹腔注射10 mg/kg bw ATRA（ATRA先用DMSO溶解，再用玉米油稀释，ATRA终浓度为0.1 mg/mL，DMSO终浓度为1%），其余组小鼠腹腔注射含1% DMSO的玉米油。30 min后，ATRA+HD组和HD组小鼠灌胃400 mg/kg bw AEPS，MD组和LD组分别灌胃200和100 mg/kg bw AEPS，PC组小鼠灌胃200 mg/kg bw EDTA钙二钠，NC、MC、ATRA+NC和ATRA+MC组小鼠灌胃生理盐水，持续30 d。30 d后，小鼠禁食12 h，称重，麻醉，腹主动脉取血，血液在室温中静止放置30 min，4 ℃，2700 g离心15 min，吸取上清液测定AST、ALT和LDH活性。然后迅速收集肝脏组织分为两个子样本，一部分用于组织病理学观察，另一部分保存在-80 ℃中用于Western blot分析、铅水平和理化指标的测定。

1.2.3   肝脏中铅含量测定

肝脏的铅含量通过石墨炉吸收分光光度法测定^[14]。将保存的肝脏标本置于110 ℃的硝化釜中，加入3 mL氢氟酸和20 mL混合酸（硝酸:高氯酸，6:1，V/V），在硝化反应釜中硝化3 h。硝化至近干，用25 mL 0.1%的稀硝酸溶液溶解样品，最后，用火焰原子吸收分光光度计测定样品溶液的吸光度。肝脏铅含量按如下公式计算：

式中：C表示小鼠肝脏中铅的浓度，mg/kg；C_n表示测试溶液中铅的浓度，ng/mL；C₀表示空白对照溶液中铅的浓度，ng/mL；V表示25，mL；f表示样品稀释倍数；m表示被检测样品的质量，g。

1.2.4   肝脏GSH、GST、SOD、CAT和MDA的测定

取上述保存于−80 ℃的肝脏组织至离心管中，加入生理盐水（组织:生理盐水, 1:9, W/V），充分匀浆，4 ℃，3400 g离心10 min，收集上清液，BCA法测定上清液中的蛋白浓度。严格遵守试剂盒说明书测定GST、CAT、SOD活性和GSH、MDA含量。

1.2.5   血清中ALT、AST和LDH活性的测定

严格遵守试剂盒说明书进行测定。

1.2.6   病理切片分析

肝脏组织样品依次用4%多聚甲醛固定，用100%、95%、90%和80%的乙醇将样品脱水，用石蜡包埋，切成5 μm厚的标准切片，用苏木伊红染色切片，使用光学显微镜观察切片，最后用图像分析系统对切片进行分析。

1.2.7   Western blot检测

参考文献[16]进行Western blot实验并做适当修改。取出保存在−80 ℃的小鼠肝脏组织加入裂解液（裂解液:PMSF，1:99，V/V），充分匀浆，冰上裂解30 min，4 ℃，12000 g离心10 min，上清液做为肝脏组织的总蛋白保留。提取肝脏核蛋白严格遵守试剂盒说明书进行。蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转印至PVDF膜上。膜用脱脂奶粉封闭1 h后，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜。膜用TBST清洗，用二抗溶液室温孵育1 h。用ECL法在化学发光成像系统中曝光显影蛋白条带，用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3   数据处理

GraphPad Prism软件用于分析试验数据和作图。所有试验数据以平均数±标准差（$\overline {\text{x}}$±SD）的形式显示。两组数据采用t检验（Student's t-test）方法进行分析。两组以上数据采用单因素方差分析（ANOVA）方法进行分析，并使用Tukey-Kramer进行多重比较检验。P<0.05表示差异具有显著性。

2.   结果与分析

2.1   AEPS对铅暴露小鼠肝脏铅含量的影响

如图1所示，MC组小鼠肝脏铅含量显著高于NC组（P<0.05），表明铅暴露模型建立成功。与MC组相比，PC组和AEPS剂量组小鼠肝脏铅水平显著降低（P<0.05），表明AEPS和EDTA二钠钙可抑制铅在肝脏中积累。相同剂量下，AEPS抑制铅积累作用优于EDTA二钠钙。ATRA是Nrf2信号通路的抑制剂，通过抑制Nrf2向细胞核转移影响Nrf2信号通路发挥抗氧化和解毒的作用^[17]。由于NC组和ATRA+NC组小鼠均未饮用醋酸铅溶液，因此两组肝脏铅含量低且没有显著差异性（P>0.05）。ATRA+MC组铅含量显著高于MC组（P<0.05），ATRA+HD组铅含量也显著高于HD组（P<0.05），可能的原因是ATRA抑制了小鼠肝细胞中将铅离子转运出细胞的蛋白的表达，如MRP2。

图  1  AEPS对铅暴露小鼠肝脏铅含量的影响

注：图中数据以$\overline {\text{x}}$±SD形式显示，n=8，不同小写字母表示两组间差异具有显著性（P<0.05）；图3~图5同。

Figure  1.  Effects of AEPS on lead levels in liver of lead-exposed mice

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2.2   AEPS对铅暴露小鼠肝脏中GSH和GST的影响

由表1可知，铅降低肝脏GSH含量和GST活性。与MC组相比，PC组和AEPS剂量组小鼠肝脏GSH含量和GST活性被显著提高（P<0.05）。在相同剂量下，AEPS提高GST活性的能力优于EDTA二钠钙。与NC组相比，ATRA+NC组小鼠肝脏GSH含量没有显著差异（P>0.05），GST活性显著下降（P<0.05）。ATRA+MC组小鼠肝脏GSH含量和GST活性均显著低于MC组（P<0.05）。ATRA+HD组小鼠肝脏GSH含量和GST活性也显著低于HD组（P<0.05）。结果表明，AEPS可能通过影响Nrf2信号通路提高铅暴露小鼠肝脏GSH含量和GST活性。

表  1  AEPS对铅暴露小鼠肝脏GSH含量和GST活性的影响

Table  1.  Effects of AEPS on GSH levels and GST activity in the liver of lead-exposed mice

组别	GSH（μmol/L）	GST（U/mg prot）
NC	65.32±3.43d	23.90±1.48e
MC	47.80±3.99b	15.10±1.16b
PC	60.82±3.14cd	17.34±1.28c
LD	56.20±4.82c	17.40±1.51c
MD	61.86±3.81cd	20.02±1.61d
HD	73.79±4.09e	19.60±1.26d
ATRA+NC	65.15±4.27d	21.39±1.41d
ATRA+MC	38.92±4.61a	12.57±0.81a
ATRA+HD	60.82±3.33cd	17.16±1.19bc
注：表中数据以$\overline {\text{x}}$±SD形式显示，n=8，同一列不同小写字母表示两组间差异具有显著性（P<0.05）；表2~表3同。

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2.3   AEPS对铅暴露小鼠肝脏中抗氧化能力的影响

表2为AEPS对各组小鼠肝脏组织抗氧化能力的影响。相比NC组，MC组小鼠肝脏CAT和SOD活性显著降低（P<0.05），MDA水平显著上升（P<0.05），表明铅引起小鼠肝脏抗氧化能力的减弱。相比MC组，PC组和AEPS剂量组小鼠肝脏CAT和SOD活性显著升高（P<0.05），MDA水平显著降低（P<0.05），表明AEPS和EDTA二钠钙都能提高铅暴露小鼠肝脏组织的抗氧化能力，且在相同剂量下，AEPS在升高CAT活性的表现优于EDTA二钠钙。CAT、SOD活性和MDA水平在NC组和ATRA+NC组没有显著性差异（P>0.05）。相比MC组，ATRA+MC组小鼠肝脏CAT、SOD活性显著降低（P<0.05），MDA水平显著升高（P<0.05）。相比HD组，ATRA+HD组小鼠肝脏CAT、SOD活性显著降低（P<0.05），MDA水平显著升高（P<0.05）。结果表明，AEPS的增强铅暴露小鼠肝脏抗氧化活性作用可被ATRA抑制。

表  2  AEPS对铅暴露小鼠肝脏抗氧化能力的影响

Table  2.  Effects of AEPS on the antioxidant activity of the liver in lead-exposed mice

组别	CAT（U/mg prot）	SOD（U/mg prot）	MDA（nmol/mg prot）
NC	9.55±0.74e	90.09±5.50e	5.85±0.58a
MC	5.35±0.78b	58.85±5.40b	10.01±0.52d
PC	7.05±0.63c	77.99±4.00d	7.27±0.57bc
LD	6.58±0.74c	69.44±5.11c	7.95±0.55c
MD	8.16±0.63d	79.60±5.67d	6.97±0.51b
HD	9.44±0.76e	87.44±5.84e	6.00±0.49a
ATRA+NC	9.01±0.66de	86.45±4.22e	6.02±0.49a
ATRA+MC	4.08±0.40a	46.29±4.81a	10.98±0.77e
ATRA+HD	7.56±0.61cd	75.81±4.87cd	7.27±0.62b

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表  3  AEPS对血清中AST、ALT和LDH活性的影响

Table  3.  Effects of AEPS on AST, ALT and LDH activity in the serum

组别	AST（U/L）	ALT（U/L）	LDH（U/L）
NC	39.81±3.67a	41.53±4.42a	1609.78±142.46a
MC	78.22±5.75e	68.08±6.67d	2553.17±141.19d
PC	55.32±3.83c	52.60±5.42bc	2027.12±113.10b
LD	63.07±4.83d	56.83±4.50c	2318.78±132.24c
MD	50.23±5.51bc	52.42±5.96bc	1946.02±140.71b
HD	47.87±5.03b	44.09±5.19ab	1703.24±151.38a
ATRA+NC	41.83±3.85a	44.69±5.71a	1624.11±113.32a
ATRA+MC	86.99±4.46f	77.96±9.15e	2802.00±122.89e
ATRA+HD	56.07±3.70cd	56.10±5.23c	1982.69±111.48b

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2.4   AEPS对血清中AST、ALT和LDH的影响

表3表示的是AEPS对小鼠血清AST、ALT和LDH活性的影响。相比NC组，MC组小鼠血清AST、ALT和LDH活性显著升高（P<0.05），提示铅影响了小鼠肝功能。与MC组对比，PC组和AEPS剂量组小鼠血清AST、ALT和LDH活性显著降低（P<0.05），表明AEPS和EDTA二钠钙能恢复铅暴露小鼠肝功能，相同剂量的AEPS和EDTA二钠钙具有相同的效果。NC组与ATRA+NC组小鼠AST、ALT和LDH活性没有显著差异（P>0.05）。ATRA+MC组AST、ALT和LDH活性显著高于MC组（P<0.05）。ATRA+HD组AST、ALT和LDH活性显著高于HD组（P<0.05）。结果说明，AEPS恢复铅暴露小鼠肝功能作用可能与Nrf2信号通路有关。

2.5   肝脏切片评估

小鼠肝脏组织HE染色切片结果如图2所示，NC组小鼠肝脏未观察到异常，肝细胞呈索状排列，肝窦分布清晰，肝细胞核清晰。ATRA+NC组小鼠肝细胞胞浆中出现轻微疏松，未见明显细胞变性。MC组小鼠肝脏中央静脉扩张，充血，细胞胞浆疏松变性，肝索排列紊乱，肝窦间隙分布不清，细胞核仁不清晰。ATRA+MC组小鼠肝索排列紊乱，肝细胞可见大面积严重的疏松变性，细胞核仁不清晰，胞浆红染呈嗜酸性。PC组小鼠肝细胞排列规律，肝细胞胞浆疏松变性程度得到改善，部分胞浆红染呈嗜酸性，因此EDTA二钠钙有效缓解了肝损伤。AEPS剂量依赖性减轻小鼠肝脏损伤。LD组小鼠核内染色质分布紊乱，少量核仁模糊不清，肝细胞胞浆疏松程度得到改善。MD组小鼠中央静脉轻微扩张轻度充血，肝细胞排列规律，核仁清晰，部分细胞胞浆疏松变性。HD组小鼠中央静脉无明显的扩张。与HD组相比较，ATRA+HD组小鼠肝细胞肿胀，肝窦间隙缩小，少量核内染色质分布紊乱，局部肝细胞胞浆疏松，表明ATRA抑制了AEPS对铅暴露小鼠肝脏病理损伤的改善作用。

图  2  小鼠肝脏组织HE染色切片（400×）

Figure  2.  HE staining of the mice liver tissues （400×）

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2.6   AEPS对铅暴露小鼠肝脏中Nrf2的影响

结果如图3所示，与NC组比较，MC组小鼠肝细胞核Nrf2水平显著升高（P<0.05），表明铅促进了Nrf2核移位，进而启动了机体自身抵御毒物的防御机制。与MC组比较，PC组和AEPS剂量组肝细胞核Nrf2水平显著增加（P<0.05），说明EDTA二钠钙和AEPS具有促进Nrf2核移位的作用。ATRA单独处理没有影响小鼠肝细胞核Nrf2水平。与MC组相比，ATRA+MC组肝细胞核Nrf2水平显著下降（P<0.05），表明ATRA抑制了铅诱导的Nrf2核移位，并且由AEPS引起的Nrf2核移位作用也被ATRA抑制。上述结果表明，AEPS可能通过促进Nrf2的核移位激活了Nrf2信号通路，而ATRA抑制了AEPS的Nrf2激活作用。

图  3  AEPS对铅暴露小鼠肝细胞核Nrf2蛋白水平的影响

Figure  3.  Effects of AEPS on Nrf2 protein levels in liver cell nucleus of lead-exposed mice

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图  4  AEPS对铅暴露小鼠肝脏细胞凋亡的影响

Figure  4.  Effects of AEPS on apoptosis of the liver of lead-exposed mice

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图  5  AEPS对铅暴露小鼠肝脏MRP2蛋白表达的影响

Figure  5.  Effect of AEPS on MRP2 protein expression of the liver of lead-exposed mice

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2.7   AEPS对铅暴露小鼠肝脏中细胞凋亡的影响

采用Western blot方法测定铅暴露小鼠肝脏组织中激活型Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平。如图4所示，铅处理显著提高激活型Caspase-3和Bax表达水平（P<0.05），显著降低了Bcl-2表达水平（P<0.05），表明铅诱导小鼠肝细胞凋亡。PC和AEPS剂量组显著降低激活型Caspase-3和Bax水平（P<0.05），显著提高Bcl-2水平（P<0.05），并且在相同剂量下，AEPS的抗凋亡能力强于EDTA二钠钙。与NC组相比，ATRA+NC组小鼠肝组织中激活型Caspase-3和Bax水平未发生显著变化（P>0.05），但Bcl-2水平显著降低（P<0.05）。ATRA+MC组激活型Caspase-3和Bax水平显著高于MC组（P<0.05），Bcl-2显著低于MC组（P<0.05），表明ATRA加重了铅引发的肝细胞凋亡。与HD组相比，ATRA+HD组激活型Caspase-3和Bax水平显著升高（P<0.05），Bcl-2水平显著降低（P<0.05），表明ATRA能抑制AEPS在小鼠肝脏组织中发挥的抗凋亡作用。

2.8   AEPS对铅暴露小鼠肝脏中MRP2的影响

MRP2在细胞中具有运输重金属的作用。如图5所示，与NC组比较，铅显著促进了小鼠肝脏MRP2的表达（P<0.05），提高了肝细胞对铅的耐受性。EDTA二钠钙对MRP2表达没有产生影响。与MC组相比，AEPS剂量组小鼠肝脏MRP2水平显著提高（P<0.05）。ATRA+NC组与NC组MRP2水平没有显著差异（P>0.05）。ATRA+MC组MRP2水平显著低于MC组（P<0.05）。与HD组比，ATRA+HD组MRP2水平显著降低（P<0.05），表明腹腔注射ATRA后，AEPS不能促进小鼠肝脏MRP2的表达。因此，AEPS可能通过Nrf2信号通路影响铅暴露小鼠肝脏MRP2表达。

3.   讨论

铅是一种弱氧化剂，能诱发肝脏氧化应激。MDA是脂质过氧化产物，当肝脏发生氧化应激时伴随脂质过氧化的发生，因此MDA能反映肝脏受氧化应激侵害的严重程度，MDA含量越高，表示肝脏受到越严重的氧化损伤^[18-19]。CAT和SOD活性直接反映体内减少自由基和抵御氧化应激的能力^[20]。铅抑制CAT和SOD等抗氧化酶的活性，进而抑制抗氧化系统，同时促进MDA的产生，最终诱发氧化应激^[21]。试验结果表明，铅暴露后小鼠肝脏MDA水平显著升高（P<0.05），SOD和CAT活性被抑制。试验结果也表明AEPS能显著提高小鼠肝脏CAT和SOD活性，降低MDA含量，提高了铅暴露小鼠肝脏抗氧化活性并抑制脂质过氧化。与EDTA二钠钙相比较，AEPS提高CAT活性的效果更好。

细胞凋亡过程是由Caspase家族和Bcl-2家族等其他家族蛋白参与的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡的异常会引发多种疾病。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中具有相反作用的两种蛋白，Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax促进细胞凋亡^[22]。Bcl-2的减少和Bax的增加导致线粒体膜通透性增加，使线粒体中的细胞色素C、Smac等凋亡相关因子进入细胞质，活化细胞质中的凋亡启动因子（如Caspase-2、Caspase-9和Caspase-10）并激活凋亡执行因子（如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7），最终发生细胞凋亡。其中激活型Caspase-3的激活代表着凋亡已经进入了不可逆转的阶段^[23]。本试验结果说明灌胃AEPS减少铅暴露小鼠肝细胞中促凋亡蛋白Bax蛋白表达水平，增加抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平，进而减小线粒体膜通透性，抑制凋亡相关因子与激活型Caspase-3的结合，降低激活型Caspase-3蛋白的表达，最终抑制肝细胞凋亡。

AST、ALT和LDH是检查肝功能的重要指标^[24]。正常情况下，血清中的AST、ALT和LDH活性较低，一旦肝脏受损，肝细胞膜通透性增加使它们释放到血液中，血清中AST、ALT和LDH活性增加。本试验中，MC组小鼠血清中AST、ALT和LDH活性明显增强，说明肝脏已经明显受损。这与肝脏组织病理学切片的观察结果一致，铅引起细胞排列紊乱、肝细胞质疏松变性等异常变化。灌胃AEPS后，血清中AST、ALT和LDH活性均显著降低（P<0.05），并且肝脏病理学切片中也显示出AEPS具有减轻肝脏损伤的作用。以上结果表明，AEPS能保护铅暴露小鼠肝脏组织。

MRP2是多药耐药相关蛋白家族发现的第二个成员，依靠ATP水解的能量跨膜输出内外源性有毒物质^[25]。MRP2在很多组织中都有分布，尤其是在肝脏组织中，参与了肝细胞有毒物质的排出。MRP2的表达水平受Nrf2信号通路的影响^[26]。GSH是含有丰富巯基的三肽，与某些药物或毒物（如重金属）等通过巯基结合，从而发挥解毒作用。大量研究表明，GSH与重金属化合物形成的共轭复合物可以被MRP2转运出细胞^[27]，实现解毒作用。此外，GST存在于哺乳动物的很多组织中，催化内源性和外源性毒物与GSH结合^[28]，在体内解毒功能上起到重要的作用。因此，GSH、GST和MRP2共同参与了细胞重金属的流出^[29]。试验结果发现，AEPS显著增加了铅暴露小鼠肝脏MRP2蛋白水平（P<0.05），并升高肝脏GSH含量和GST活性，减少铅在小鼠肝脏的累积。

Nrf2信号通路是机体应对外源性刺激的防御机制之一，能有效抵御氧化应激，保护机体免受外源性毒物的伤害^[30-31]。正常生理状态下，Nrf2在细胞浆中与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）结合，被不断泛素化降解。发生氧化应激时，Nrf2脱离Keap1，向细胞核转移。在细胞核内，Nrf2结合抗氧化反应元件（Antioxidant-Response Element, ARE），促进下游抗氧化酶基因和MRPs家族基因的转录，以此提高机体抗氧化和解毒能力，防止机体氧化损伤^[32-33]。研究发现，Nrf2信号通路的激活能缓解铅毒性引起的损伤^[34-35]。试验结果表明，AEPS促进Nrf2转移进入细胞核，激活了Nrf2信号通路，肝脏的病理损伤也得到了改善。ATRA是一种Nrf2特异性抑制剂，通过影响Nrf2向细胞核转移抑制Nrf2信号通路的激活^[17]。试验结果表明AEPS促进Nrf2核移位作用被ATRA抑制，导致AEPS不能通过Nrf2信号通路保护铅暴露小鼠肝脏组织。除此之外，AEPS的抗氧化、抗凋亡、减少肝脏铅积累和减轻肝脏铅损伤作用都受到ATRA抑制，说明AEPS对铅暴露小鼠肝脏的保护作用与Nrf2信号通路相关。

4.   结论

AEPS提高了铅暴露小鼠肝脏的抗氧化酶活性，缓解了铅诱导的肝脏损伤和肝细胞凋亡，提高了GSH含量和GST活性，增强了肝脏MRP2输出铅的能力，减少了肝脏铅积累。这些作用都与AEPS能促进Nrf2核移位有关，即AEPS对铅暴露小鼠肝脏的保护作用依赖于Nrf2信号通路。因此，AEPS可以作为一种能改善器官铅损伤并能减少器官铅积累的功能性食品添加剂。