干酪乳杆菌发酵芡实上清液的活性成分及抗氧化活性分析

闫雍雍; 卞倩; 焦心语; 李松林

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022020173

干酪乳杆菌发酵芡实上清液的活性成分及抗氧化活性分析

淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003

基金项目: 淮安市自然科学研究计划（HAB201945）；淮阴工学院研究生科技创新计划项目（HGYK202005，HGYK202102）；淮阴工学院大学生创新创业训练计划项目（202111049423，202111049118）。

详细信息

作者简介:
闫雍雍（1999−），女，本科，研究方向：食品生物技术，E-mail：1773202934@qq.com

通讯作者:
李松林（1982−），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：lisonglin@hyit.edu.cn

中图分类号: TS201.3
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出版历程
- 收稿日期: 2022-02-20
- 网络出版日期: 2022-10-20
- 刊出日期: 2022-12-14

Analysis of Active Components and Antioxidant Activity of Lactobacillus casei Fermented Euryales ferox Supernatant

Faculty of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, China

摘要

摘要: 以芡实为原料，研究干酪乳杆菌发酵过程中上清液中活性成分及抗氧化活性的变化。通过干酪乳杆菌发酵芡实，对其发酵过程中上清液的pH、可滴定酸、多肽产率、多肽分子量分布、游离氨基酸组成、总酚、总黄酮及抗氧化活性的变化进行了研究，并分析各组分与抗氧化活性的相关性。结果表明，在发酵过程中pH呈降低趋势，而可滴定酸含量逐渐升高，在发酵48 h后分别达到3.97±0.02和2.53±0.04 mL/g；多肽产率呈上升趋势，在发酵结束时达到19.09%±0.42%，其中500～180和<180 Da的低分子量多肽比例显著增加（P<0.05）；游离氨基酸总量在发酵过程中增加了5.62倍；总酚和总黄酮的含量持续显著增加（P<0.05），在发酵结束时分别达到18.00±0.20和10.99±0.14 μg/g；发酵芡实上清液的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和亚铁离子螯合能力在发酵结束时均显著提高（P<0.05），可滴定酸、多肽产率、总游离氨基酸含量、总黄酮和总酚含量与抗氧化活性具有极显著（P<0.01）正相关关系。综上，干酪乳杆菌发酵可以促进芡实抗氧化活性物质的释放，提高其发酵上清液的抗氧化活性，可以为芡实产品的开发提供参考。
- 干酪乳杆菌 /
- 发酵上清液 /
- 芡实 /
- 多酚 /
- 多肽 /
- 氨基酸 /
- 相关性 /
- 抗氧化活性
Abstract: The changes of active components and antioxidant activity of the supernatant during Lactobacillus casei fermentation were studied using Euryales ferox as raw material. The pH, titratable acid, peptide yield, molecular weight distribution of peptides, free amino acid composition, total phenols, total flavonoids, and antioxidant activity changes of supernatant during the fermentation of Euryales ferox by L. casei were investigated, and the correlation between each component and antioxidant activity were analyzed. The results showed that during the fermentation process, the pH tended to decrease, while the titratable acid content gradually increased, reaching 3.97±0.02 and 2.53±0.04 mL/g after 48 h of fermentation, respectively. The peptide yield showed an increasing trend, reaching 19.09%±0.42% at the end of fermentation, with a significant increase in the proportion of low molecular weight peptides of 500～180 and <180 Da (P<0.05). The total amount of free amino acids increased 5.62 times during the fermentation. The content of total phenols and total flavonoids continued to increase significantly (P<0.05), reaching 18.00±0.20 and 10.99±0.14 μg/g at the end of fermentation, respectively. DPPH radical scavenging ability, hydroxyl radical scavenging ability and ferrous ion chelating ability of fermented Euryales ferox supernatant were significantly (P<0.05) increased at the end of fermentation. And the titratable acid, peptide yield, total free amino acid content, total flavonoid, and total phenolic contents had highly significant (P<0.01) positive correlations. In conclusion, the L. casei fermentation could promote the release of antioxidant active substances from Euryales ferox and significantly improve the antioxidant activity of its fermentation supernatant, which could provide a reference for the development of Euryales ferox products.
- Lactobacillus casei /
- fermentation supernatant /
- Euryales ferox /
- polyphenol /
- polypeptide /
- amino acid /
- correlation /
- antioxidant activity

HTML全文

芡实为睡莲科植物芡的干燥成熟果仁，主要分布于亚热带和温带地区，是药食同源植物，在中国东部被广泛栽培^[1-2]。芡实中蛋白质含量可达9.72%，含有丰富的醇溶蛋白、清蛋白、谷蛋白和球蛋白等蛋白质^[3]，其氨基酸种类齐全，配比合理，可作为人体优质蛋白的理想来源^[4]。此外，芡实中还含有丰富的酚类、黄酮类及环肽类、脑苷脂类化合物，脂肪、矿物质及维生素，具有延缓衰老、抗氧化、抗心肌缺血、降血糖、抗癌等药理作用^[5-6]。

近年来，关于利用发酵技术对芡实进行开发和综合利用的研究越来越受到关注。张然等^[7]采用保加利亚乳杆菌和乳酸链球菌制作芡实发酵奶，制备成的芡实发酵乳饮料中乳酸菌含量丰富，乳酸菌数≥10⁶ cfu/mL。刘静等^[8]以芡实和黄豆为原料，经保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵制备的复合饮料对DPPH·的清除率为95.87%，对ABTS⁺·的清除率为46.64%。张汆等^[9]采用高活性酿酒曲和增香酿酒曲制备的芡实酒，富含各种必需氨基酸，具备较强的体外抗氧化活性。

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）是一种兼性异型发酵乳酸菌，除了在乳制品的应用中较为广泛之外，其用于植物源基质的发酵近年来也越来越受到学者的关注^[10]。王鑫媛等^[11]采用干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳产品，获得的发酵燕麦乳含有燕麦多酚、燕麦β-葡聚糖以及抗性淀粉等多种营养成分。史燕等^[12]以燕麦全粉为基质进行干酪乳杆菌固态发酵，可以增加小分子质量多肽。胡姝敏等^[13]发现干酪乳杆菌KLDS1.0319发酵显著（P<0.05）提高了干酪的DPPH自由基清除能力及羟基自由基清除能力。然而，利用干酪乳杆菌发酵芡实，研究其发酵过程中的营养组分及抗氧化能力变化，国内外尚未见报道。

本实验中采用干酪乳杆菌发酵芡实，研究芡实pH、可滴定酸、多肽产率、多肽分子量分布、游离氨基酸组成、总酚、总黄酮及抗氧化活性在发酵过程中的动态变化，以期为芡实发酵产品的开发和利用提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

芡实　淮安市西顺河镇芡实种植基地；干酪乳杆菌Lactobacillus casei CICC 20995　中国工业微生物菌种保藏管理中心；四肽标准品Gly-Gly-Tyr-Arg　西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；标准品（细胞色素C、杆菌肽、G-G-Y-R、G-G-G）、双缩脲、菲洛嗪、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）　上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、三氯乙酸、福林酚试剂、2,2-联苯基-1-苦肼基、丁基羟基茴香醚（Butyl Hydroxylanisole，BHA）、氯化亚铁和水杨酸等　均为分析纯级，上海国药集团化学试剂有限公司。

Agilent 1100高效液相色谱仪　安捷伦科技公司；紫外可见分光光度计752N　上海菁华科技仪器有限公司；Scientz-10N冷冻干燥机　宁波新芝生物科技股份有限公司；Heraeus Multifuge X1R冷冻离心机　赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芡实发酵工艺

芡实→筛选、清洗→打浆→过滤→灭菌→冷却→接种→发酵

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 菌种活化

采用MRS培养基活化L. casei CICC 20995，传代3次充分活化后，于4 ℃保存备用。

1.2.2.2 芡实浆制备

挑选籽粒饱满的去壳芡实100 g，反复清洗2~3遍，沥水后，以5:1（mL/g）的液固比加入去离子水500 mL，浸泡过夜后进行打浆，浆液经过180目网筛过滤。滤液经灭菌后（121 ℃，15 min），冷却至室温，于4 ℃保存备用。

1.2.2.3 接种和发酵

在上述芡实浆中加入干酪乳杆菌，接种量为9.0 lg cfu/mL；随后在38 ℃进行发酵，分别在0、12、24、36、48 h进行取样，样品于10000 r/min离心10 min后，取上清液样冷冻干燥，−20 ℃贮存待测。

1.2.3 pH和总酸的测定

参考GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》测定样品的pH；参考GB 12456-2021《食品中总酸的测定》测定样品的可滴定酸含量。

1.2.4 多肽产率的测定

依据尹乐斌等^[14]的方法并稍作改动。将1 g冷冻干燥样品溶解于10 mL去离子水中，随后与100 mg/mL的三氯乙酸溶液按1:1的体积比混合均匀并静置20 min，在5000 r/min条件下离心20 min，取上清液与双缩脲试剂按照1:3的比例混合均匀，室温下静置40 min，在540 nm测定吸光度值，对照Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液曲线，计算多肽浓度，多肽产率计算公式如下：

$\rm 多肽产率(\text{%})\text={ \frac{A_1-A_0}{A_0}}\times \text{100}$

式中：A₁表示发酵后多肽含量（g/100 g）；A₀表示发酵前多肽含量（g/100 g）。

1.2.5 多肽分子量分布的测定

依据Li等^[15]的方法并稍作改动进行多肽分子量分布的测定。选用TSK-GEL G2000 SWXL凝胶柱（7.5 mm×30 cm），色谱条件：流动相（乙腈:水:三氟乙酸=45:55:0.1，v/v），柱温为28 ℃，流速为0.5 mL/min，在220 nm处进行检测。

1.2.6 游离氨基酸含量的测定

参考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》测定样品的游离氨基酸含量。

1.2.7 总酚的测定

取冷冻干燥样品2 g，加入40 mL的无水乙醇，振荡提取2 h，5000 r/min离心5 min后，收集上清液。离心残渣在相同条件下重复提取一次。合并两次提取液，采用旋转蒸发仪进行干燥，用无水乙醇定容于10 mL容量瓶中，备用待测。采用福林酚法进行总酚的测定^[16]。将200 μL待测提取液样品加入1.5 mL福林酚试剂中，加入1.5 mL 1.7 mol/L Na₂CO₃并混匀，在室温下避光反应2 h，于725 nm处测定吸光度。以没食子酸标准品制作标准曲线，根据标准曲线方程y=3.7637x+0.0332 （R²=0.9998），计算样品总酚含量。

1.2.8 总黄酮的测定

参考王清爽等^[16]的方法并稍作改动进行总酚的测定。在25 mL容量瓶中分别加入采用1.2.7中方法制备的待测提取液2.5 mL和无水乙醇7.5 mL，随后加入1 mL 6% NaNO₂，混匀后放置10 min，再加入5% Al（NO₃）₃溶液1 mL ，混匀后放置10 min，最后加入5% NaOH溶液10 mL，加水定容后放置10 min，于510 nm波长处测定吸光度。利用芦丁标准溶液制作标准曲线，根据标准曲线方程y=11.167x−0.0016 （R²=0.9994），计算样品总黄酮含量。

1.2.9 抗氧化活性的测定

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力

参照Du等^[17]方法并稍作改动进行测定。取4 mL采用1.2.7中方法制备的待测提取液，加入到6 mL 400 μmol/L DPPH溶液液中，混匀后避光反应25 min，以 95%乙醇溶液做对照，于517 nm处测定吸光度。以1.5 mg/mL BHA作为阳性对照组。DPPH自由基清除率计算公式如下：

$\rm \text{DPPH}自由基清除率({\text{%}})={ \frac{A_0-A_1}{A_0}}\times \text{100}$

式中：A₁表示样品的吸光度值；A₀表示空白对照的吸光度值。

1.2.9.2 羟基自由基清除率

参照Wang等^[18]方法并稍作改动进行测定。在10 mL比色管中加入1 mL采用1.2.7中方法制备的待测提取液与3 mL 1 mmol/L硫酸亚铁溶和3 mL 3 mmol/L H₂O₂溶液，混合均匀后用1 mmol/L水杨酸溶液定容至刻度线，在37 ℃反应15 min后，于510 nm波长下测定吸光度。以1.5 mg/mL BHA作为阳性对照组。羟基自由基清除率计算公式如下：

$\rm 羟基自由基清除率(\text{%})={ \frac{A_0-A_1}{A_0}}\times \text{100}$

式中：A₁表示样品的吸光度值；A₀表示空白对照的吸光度值。

1.2.9.3 亚铁螯合能力

参照Li等^[15]方法并稍作修改。将1 mL采用1.2.7中方法制备的待测提取液与0.1 mL 1 mmol/L FeCl₂溶液混合后在10000 r/min离心10 min，取上清液并定容至1.9 mL，加入0.1 mL 10 mmol/L的菲洛嗪，混匀并在室温下反应10 min。在562 nm波长下测定吸光度。以1 mmol/L EDTA作为阳性对照组。亚铁螯合能力计算公式如下：

$\rm 亚铁螯合能力({\text{%}})={ \frac{A_0-A_1}{A_0}}\times \text{100}$

式中：A₁表示样品的吸光度值；A₀表示空白对照的吸光度值。

1.3 数据处理

实验结果为3次重复实验测定结果的平均值±标准差，采用OriginPro 2021软件进行显著性差异分析和相关性分析。

2. 结果与分析

2.1 发酵过程中芡实发酵上清液pH和可滴定酸的变化

芡实接种干酪乳杆菌进行发酵后，样品的pH和可滴定酸含量的变化如图1所示。在发酵起始时，样品的pH和可滴定酸含量分别为6.30和0.38 mL/g。在发酵过程中，pH逐渐降低，可滴定酸含量逐渐升高，在发酵48 h后分别达到3.97±0.02和（2.53±0.04）mL/g。乳酸是大多数益生菌代谢的主要最终产物，此外干酪乳杆菌也可能产生醋酸等有机酸^[19-20]。干酪乳杆菌在发酵过程中消耗了芡实中的糖类成分产生了有机酸而导致pH的降低。发酵芡实中有机酸含量的增加可以促使其形成特有的乳酸味，给产品带来特殊的香气和味道。

图 1 发酵过程中芡实上清液pH和可滴定酸含量的变化

注：同一指标不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图2～图5同。

Figure 1. Changes in pH and titratable acid content of Euryale ferox supernatant during fermentation

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2.2 发酵过程中芡实发酵上清液多肽产率的变化

如图2所示，在发酵过程中芡实多肽产率持续增加。在0～36 h上升速率较快，随后上升速率减缓，在发酵结束时达到19.09%±0.42%。多肽产率的提高可能是由于L. casei CICC 20995分泌的胞外酶对蛋白质进行了水解，从而增加了发酵液中的多肽含量。尹乐斌等^[21]在利用乳酸菌发酵豆清液时，在发酵后期同样发现多肽产率增加的趋势逐步降低。这可能是由于在发酵后期干酪乳杆菌自身以多肽为营养物质进行生长利用。此外一些多肽会被乳酸菌分泌的胞外酶进一步水解生成氨基酸，最终导致多肽产率增加减缓。

图 2 发酵过程中芡实上清液多肽产率的变化

Figure 2. Changes in peptide yields of Euryale ferox supernatant during fermentation

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2.3 发酵过程中芡实上清液多肽分子量分布的变化

如图3所示，经过48 h的发酵，分子质量位于>10000、10000～5000、5000～3000和3000～1000 Da的多肽比例均显著降低（P<0.05）；而分子质量位于500～180和<180 Da的多肽比例则显著增加（P<0.05），其中<180 Da的多肽比例从49.99%±0.65%增加到57.32%±0.76%。低分子量多肽比例的增加源于中、高分子量多肽组分的降解，这说明L. casei CICC 20995在发酵过程中可以分泌水解酶将蛋白质大分子降解为小分子量多肽。分子量是反映蛋白质水解情况的一个重要参数，它与蛋白质水解物的生物活性进一步相关。Liu等^[22]用枯草芽孢杆菌发酵脱脂小麦胚芽，发现多肽分子质量位于>5000、5000～3000和3000～2000 Da的比例随着发酵逐渐减少，而位于500～180和<180 Da的低分子量多肽比例逐渐增加。他们认为发酵后蛋白质水解物分子量的分布差异，反映了肽链长度和末端氨基暴露的不同，这可能会影响水解物的抗氧化活性。

图 3 发酵过程中芡实上清液多肽分子量分布的变化

Figure 3. Changes in molecular weight distribution of peptides of Euryale ferox supernatant during fermentation

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2.4 发酵过程中芡实上清液游离氨基酸含量的变化

发酵过程中游离氨基酸的含量如表1所示。必需氨基酸含量在发酵后均显著增加（P<0.05），其中Leu和Phe在发酵后分别增加了24.88和30.58倍，总必需氨基酸含量在发酵结束后增加了10.32倍。大多数非必需氨基酸在发酵后有明显变化，在发酵48 h后Glu从（20.16±1.36） mg/100 g增加到（171.67±7.43） mg/100 g，表现出最高的增加量；其次是Arg从（28.63±0.98） mg/100 g增加到（154.11±3.47） mg/100 g，而Gly含量在发酵过程中没有显著变化（P>0.05）。发酵芡实中的游离氨基酸总含量经过发酵增加了5.62倍，这表明芡实蛋白的水解程度随着发酵时间的增加而逐渐增强。这一趋势与Shi等^[23]的研究一致，他们发现在使用Lactobacillus casei N1115 对牛奶进行发酵时，其游离氨基酸在发酵过程中逐渐增加。Bu等^[24]认为在乳酸菌发酵过程中会释放一些蛋白酶，蛋白的水解程度随着发酵时间的增加而逐渐增强。因此发酵芡实游离氨基酸的变化可能是由于在发酵过程中蛋白质被L. casei CICC 20995分泌的内切蛋白酶降解为肽，然后被外切蛋白酶进一步降解为游离氨基酸。

表 1 发酵过程中芡实上清液游离氨基酸含量的变化

Table 1. Changes in free amino acid content of Euryale ferox supernatant during fermentation

类别	氨基酸	游离氨基酸（mg/100 g 蛋白质）
类别	氨基酸	0 h	12 h	24 h	36 h	48 h
必需氨基酸	亮氨酸Leu	5.63±0.18^a	40.39±4.59^b	76.5±0.73^c	100.77±2.47^d	145.68±6.10^e
	赖氨酸Lys	5.15±0.13^a	13.64±1.26^b	25.68±0.69^c	30.60±0.72^d	38.32±1.16^e
	缬氨酸Val	2.05±0.07^a	9.28±0.83^b	13.97±1.68^c	20.21±0.98^d	24.63±1.06^e
	苯丙氨酸Phe	6.04±0.14^a	64.31±4.52^b	132.81±5.18^c	160.70±3.69^d	190.72±7.08^e
	异亮氨酸Ile	2.49±0.12^a	6.88±0.33^b	11.12±0.82^c	14.50±0.82^d	15.98±0.54^e
	苏氨酸Thr	0.82±0.03^a	2.68±0.09^b	5.71±0.27^c	7.22±0.20^d	8.15±0.24^e
	蛋氨酸Met	5.42±0.29^a	13.43±0.88^b	23.72±0.86^c	27.60±0.65^d	36.55±1.25^e
	组氨酸His	15.29±0.67^a	17.18±0.44^b	18.34±0.54^c	20.05±0.5^d	25.29±1.43^e
	总必需氨基酸	42.89±1.18^a	167.80±9.19^b	307.85±6.57^c	381.66±8.15^d	485.32±5.24^e
非必需氨基酸	谷氨酸Glu	20.16±1.36^a	72.49±3.20^b	96.61±2.80^c	136.57±4.90^d	171.67±7.43^e
	天冬氨酸Asp	13.39±1.10^a	35.23±1.35^b	40.42±0.76^c	45.23±0.97^d	58.20±1.95^e
	精氨酸Arg	28.63±0.98^a	57.93±1.66^b	87.39±2.07^c	121.03±5.07^d	154.11±3.47^e
	脯氨酸Pro	4.46±0.20^a	8.59±0.37^b	14.65±0.73^c	22.44±0.79^d	26.97±1.48^e
	丙氨酸Ala	8.08±0.34^a	12.31±0.85^b	18.66±1.06^c	25.13±0.88^d	28.38±1.10^e
	丝氨酸Ser	4.09±0.14^a	8.88±039^b	13.83±0.51^c	26.35±0.57^d	29.58±1.09^e
	酪氨酸Tyr	3.02±0.12^a	17.62±0.68^b	33.73±1.07^c	49.13±1.14^d	62.74±3.13^e
	甘氨酸Gly	34.04±2.67^a	33.58±1.15^a	33.78±1.11^a	34.75±1.20^a	34.58±1.14^a
	总非必需氨基酸	115.87±6.44^a	246.63±5.12^b	339.06±2.70^c	460.63±6.40^d	566.24±11.84^e
	总氨基酸	158.76±7.61^a	414.44±13.88^b	646.91±5.70^c	842.29±13.96^d	1051.55±16.30^e
注：同行不同小写字母代表存在显著差异（P<0.05）。

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2.5 发酵过程中芡实发酵上清液总酚和总黄酮含量的变化

如图4所示，发酵前芡实的总酚含量为（9.71±0.31） μg/g，48 h发酵后的总酚含量显著升高（P<0.05），达到（18.00±0.20） μg/g，增加了85.38%。这可能是由于乳酸菌在发酵过程中分泌的蛋白水解酶类改变了多酚与蛋白相互作用的模式，干酪乳杆菌酶系统催化结合状态的多酚-蛋白质化合物进入自由状态，促进了其中游离形式多酚的释放。王清爽等^[16]研究发现干酪乳杆菌发酵脱脂薏米的过程中，内源酶系的作用能够使薏米中的酚类物质从结合状态释放出来，总酚含量在发酵后显著提高（P<0.05）。与发酵0 h的芡实样品相比，在48 h的发酵过程中，总黄酮的含量持续显著增加（P < 0.05），从（4.30±0.27） μg/g提高到（10.99±0.14） μg/g。与总酚含量的增幅相比，发酵后总黄酮含量的增幅更加显著（P<0.05）。Landete等^[25]认为可能是在发酵过程中，复杂的多酚通过酶解作用，被分解为结构更简单的黄酮醇类化合物等。

图 4 发酵过程中芡实上清液总酚和总黄酮含量的变化

Figure 4. Changes in total phenol and total flavonoid contents of Euryale ferox supernatant during fermentation

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2.6 发酵过程中芡实发酵上清液抗氧化活性的变化

作为一种稳定的自由基，DPPH已被广泛用作研究抗氧化剂清除活性的指标。DPPH自由基清除实验结果如图5A所示。芡实在发酵期间的DPPH自由基清除能力呈上升趋势，从发酵0 h的10.73%±0.45%达到了48 h的50.37%±0.84%，而阳性对照BHA的清除率为96.34%±0.34%。与本研究相似，刘静等^[8]以芡实和黄豆为原料制备复合饮料，经乳酸菌发酵，饮料对DPPH自由基的清除率达到95.87%。发酵芡实的羟基自由基清除实验表明，在发酵期间，羟基自由基清除率显著提高（P<0.05），在第48 h达到43.56%±1.14%，阳性对照BHA的清除率为58.60%±0.31%。Rajapakse等^[26]认为Gly、Lys和Pro在自由基清除能力方面发挥了重要作用。Feng等^[27]研究发现酸性氨基酸（Asp和Glu）能够通过提供质子来淬灭未配对的电子和自由基。此外，Udenigwe等^[28]认为由于其咪唑环的分解，His表现出强大的自由基清除活性。本研究中发酵芡实清除自由基能力的提高，可能与Pro、Asp、Glu和His含量在发酵过程中显著（P<0.05）增加有关。侯凯荣等^[29]同样发现干酪乳杆菌发酵可以显著（P<0.05）提高豆乳的羟基自由基清除能力。方晟等^[30]研究发现在金佛手酵素发酵过程中羟基自由基清除率与乳酸和乙酸含量呈极显著正相关（P<0.01），DPPH自由基清除率与琥珀酸呈极显著正相关（P<0.01）。因此本研究中发酵芡实上清液抗氧化活性的提高与干酪乳杆菌发酵过程中所产生的乳酸有关。

图 5 发酵过程中芡实上清液DPPH自由基清除率（A）、羟基自由基清除率（B）和亚铁离子螯合率（C）的变化

Figure 5. Changes in DPPH radical scavenging rate (A), hydroxyl radical scavenging rate (B) and ferrous ion chelation rate (C) of Euryale ferox supernatant during fermentation

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经过干酪乳杆菌发酵48 h后，发酵芡实的亚铁离子螯合率提高了3.95倍。螯合剂的抗氧化性能通常取决于官能团的协同作用，如-OH、-SH、-COOH、-PO₃H₂、C=O、-NR₂、-S-和-O-^[31]。芡实的酚类含量与其抗氧化活性有关，发酵芡实的螯合能力很可能是由酚类化合物-OH和-COOH等官能团的协同作用形成的。此外，低分子量多肽比例的增加也在一定程度上促进了抗氧化活性的提高。Rajapakse等^[26]认为低分子量多肽具备更高的抗氧化活性是由于它们通过抑制自由基介导的亚油酸过氧化而具有断链能力，低分子量的多肽作为生物活性肽更有效力。

2.7 芡实上清液抗氧化活性与部分成分的相关性分析

芡实在发酵过程中的亚铁离子螯合能力、DPPH自由基和羟基自由基清除能力的变化趋势与其可滴定酸、总游离氨基酸、多肽产率、总黄酮和总酚变化趋势相一致。因此，本研究对抗氧化活性与这些指标之间的相关性进行了分析。由图6可知，芡实的抗氧化能力与可滴定酸、总游离氨基酸、多肽产率、总酚和总黄酮含量具有极显著（P<0.01）正相关关系，Spearman系数均大于0.94。说明芡实发酵过程中可滴定酸、总游离氨基酸、多肽产率、总酚和总黄酮含量的增加能够提升其抗氧化活性。

图 6 芡实上清液抗氧化活性与部分成分的斯皮尔曼相关性分析

Figure 6. Spearman's correlation analysis between antioxidant activity of Euryale ferox supernatant and some components

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3. 结论

以芡实为原料，研究了干酪乳杆菌发酵对上清液抗氧化活性的影响。在发酵48 h后，芡实上清液中可滴定酸含量和多肽产率分别达到（2.53±0.04） mL/g和19.09%±0.42%。分子质量位于<180 Da的多肽比例在发酵后从49.99%±0.65%增加到57.32%±0.76%。发酵后的上清液中总酚和总黄酮含量显著升高（P<0.05），分别增加了85.38%和155.58%。芡实上清液的DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率在发酵期间呈上升趋势，发酵48 h后分别达到了50.37%±0.84%和43.56%±1.14%，亚铁离子螯合率提高了3.95倍。芡实上清液的抗氧化能力与可滴定酸、总游离氨基酸、多肽产率、总酚和总黄酮含量具有极显著（P<0.01）正相关关系。干酪乳杆菌发酵对芡实上清液抗氧化活性的研究可以为发酵芡实产品的开发提供理论依据，对进一步开发芡实资源、提高经济价值具有重要的实践意义。

图 1 发酵过程中芡实上清液pH和可滴定酸含量的变化

注：同一指标不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图2～图5同。

Figure 1. Changes in pH and titratable acid content of Euryale ferox supernatant during fermentation

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图 2 发酵过程中芡实上清液多肽产率的变化

Figure 2. Changes in peptide yields of Euryale ferox supernatant during fermentation

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图 3 发酵过程中芡实上清液多肽分子量分布的变化

Figure 3. Changes in molecular weight distribution of peptides of Euryale ferox supernatant during fermentation

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图 4 发酵过程中芡实上清液总酚和总黄酮含量的变化

Figure 4. Changes in total phenol and total flavonoid contents of Euryale ferox supernatant during fermentation

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图 5 发酵过程中芡实上清液DPPH自由基清除率（A）、羟基自由基清除率（B）和亚铁离子螯合率（C）的变化

Figure 5. Changes in DPPH radical scavenging rate (A), hydroxyl radical scavenging rate (B) and ferrous ion chelation rate (C) of Euryale ferox supernatant during fermentation

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图 6 芡实上清液抗氧化活性与部分成分的斯皮尔曼相关性分析

Figure 6. Spearman's correlation analysis between antioxidant activity of Euryale ferox supernatant and some components

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表 1 发酵过程中芡实上清液游离氨基酸含量的变化

Table 1 Changes in free amino acid content of Euryale ferox supernatant during fermentation

类别	氨基酸	游离氨基酸（mg/100 g 蛋白质）
类别	氨基酸	0 h	12 h	24 h	36 h	48 h
必需氨基酸	亮氨酸Leu	5.63±0.18^a	40.39±4.59^b	76.5±0.73^c	100.77±2.47^d	145.68±6.10^e
	赖氨酸Lys	5.15±0.13^a	13.64±1.26^b	25.68±0.69^c	30.60±0.72^d	38.32±1.16^e
	缬氨酸Val	2.05±0.07^a	9.28±0.83^b	13.97±1.68^c	20.21±0.98^d	24.63±1.06^e
	苯丙氨酸Phe	6.04±0.14^a	64.31±4.52^b	132.81±5.18^c	160.70±3.69^d	190.72±7.08^e
	异亮氨酸Ile	2.49±0.12^a	6.88±0.33^b	11.12±0.82^c	14.50±0.82^d	15.98±0.54^e
	苏氨酸Thr	0.82±0.03^a	2.68±0.09^b	5.71±0.27^c	7.22±0.20^d	8.15±0.24^e
	蛋氨酸Met	5.42±0.29^a	13.43±0.88^b	23.72±0.86^c	27.60±0.65^d	36.55±1.25^e
	组氨酸His	15.29±0.67^a	17.18±0.44^b	18.34±0.54^c	20.05±0.5^d	25.29±1.43^e
	总必需氨基酸	42.89±1.18^a	167.80±9.19^b	307.85±6.57^c	381.66±8.15^d	485.32±5.24^e
非必需氨基酸	谷氨酸Glu	20.16±1.36^a	72.49±3.20^b	96.61±2.80^c	136.57±4.90^d	171.67±7.43^e
	天冬氨酸Asp	13.39±1.10^a	35.23±1.35^b	40.42±0.76^c	45.23±0.97^d	58.20±1.95^e
	精氨酸Arg	28.63±0.98^a	57.93±1.66^b	87.39±2.07^c	121.03±5.07^d	154.11±3.47^e
	脯氨酸Pro	4.46±0.20^a	8.59±0.37^b	14.65±0.73^c	22.44±0.79^d	26.97±1.48^e
	丙氨酸Ala	8.08±0.34^a	12.31±0.85^b	18.66±1.06^c	25.13±0.88^d	28.38±1.10^e
	丝氨酸Ser	4.09±0.14^a	8.88±039^b	13.83±0.51^c	26.35±0.57^d	29.58±1.09^e
	酪氨酸Tyr	3.02±0.12^a	17.62±0.68^b	33.73±1.07^c	49.13±1.14^d	62.74±3.13^e
	甘氨酸Gly	34.04±2.67^a	33.58±1.15^a	33.78±1.11^a	34.75±1.20^a	34.58±1.14^a
	总非必需氨基酸	115.87±6.44^a	246.63±5.12^b	339.06±2.70^c	460.63±6.40^d	566.24±11.84^e
	总氨基酸	158.76±7.61^a	414.44±13.88^b	646.91±5.70^c	842.29±13.96^d	1051.55±16.30^e
注：同行不同小写字母代表存在显著差异（P<0.05）。

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 芡实发酵工艺
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 菌种活化
1.2.2.2 芡实浆制备
1.2.2.3 接种和发酵
1.2.3 pH和总酸的测定
1.2.4 多肽产率的测定
1.2.5 多肽分子量分布的测定
1.2.6 游离氨基酸含量的测定
1.2.7 总酚的测定
1.2.8 总黄酮的测定
1.2.9 抗氧化活性的测定
1.2.9.1 DPPH自由基清除能力
1.2.9.2 羟基自由基清除率
1.2.9.3 亚铁螯合能力
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 发酵过程中芡实发酵上清液pH和可滴定酸的变化
2.2 发酵过程中芡实发酵上清液多肽产率的变化
2.3 发酵过程中芡实上清液多肽分子量分布的变化
2.4 发酵过程中芡实上清液游离氨基酸含量的变化
2.5 发酵过程中芡实发酵上清液总酚和总黄酮含量的变化
2.6 发酵过程中芡实发酵上清液抗氧化活性的变化
2.7 芡实上清液抗氧化活性与部分成分的相关性分析
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 芡实发酵工艺
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 菌种活化
1.2.2.2 芡实浆制备
1.2.2.3 接种和发酵
1.2.3 pH和总酸的测定
1.2.4 多肽产率的测定
1.2.5 多肽分子量分布的测定
1.2.6 游离氨基酸含量的测定
1.2.7 总酚的测定
1.2.8 总黄酮的测定
1.2.9 抗氧化活性的测定
1.2.9.1 DPPH自由基清除能力
1.2.9.2 羟基自由基清除率
1.2.9.3 亚铁螯合能力
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 发酵过程中芡实发酵上清液pH和可滴定酸的变化
2.2 发酵过程中芡实发酵上清液多肽产率的变化
2.3 发酵过程中芡实上清液多肽分子量分布的变化
2.4 发酵过程中芡实上清液游离氨基酸含量的变化
2.5 发酵过程中芡实发酵上清液总酚和总黄酮含量的变化
2.6 发酵过程中芡实发酵上清液抗氧化活性的变化
2.7 芡实上清液抗氧化活性与部分成分的相关性分析
3. 结论

参考文献(31)

施引文献

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干酪乳杆菌发酵芡实上清液的活性成分及抗氧化活性分析

作者简介: 闫雍雍（1999−），女，本科，研究方向：食品生物技术，E-mail：1773202934@qq.com

通讯作者: 李松林（1982−），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：lisonglin@hyit.edu.cn

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