假肠膜明串珠菌HDL-3胞外多糖的分离纯化及结构性质分析

赵丹; 曹慧莹; 孙梦; 于连升; 杜仁鹏

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022020092

假肠膜明串珠菌HDL-3胞外多糖的分离纯化及结构性质分析

赵丹^{1, 2,},
曹慧莹^{1, 2},
孙梦^{1, 2},
于连升^{1, 2},
杜仁鹏^{1, 2, ,}

1.
农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150500
2.
黑龙江大学生命科学学院，微生物省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨 150080

基金项目: 黑龙江省自然科学基金优秀青年基金项目（YQ2021C030）；中国博士后科学基金资助项目（2022MD713755）；黑龙江省博士后资助项目（LBH-Z21082）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（2021-KYYWF-0045）；上海交通大学微生物代谢国家重点实验室开放课题资助项目（MMLKF22-07）。

详细信息

作者简介:
赵丹（1980−），女，博士，教授，研究方向：微生物次生代谢产物与生理，E-mail：zhaodan4u@163.com

通讯作者:
杜仁鹏（1989−），男，博士，副教授，研究方向：微生物次生代谢产物与生理，E-mail：durenpeng20096292@163.com

中图分类号: Q939.97
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出版历程
- 收稿日期: 2022-02-13
- 网络出版日期: 2022-08-27
- 刊出日期: 2022-10-31

Isolation, Purification and Structural Properties Analysis of Exopolysaccharide from Leuconostoc pseudointestinalis HDL-3

ZHAO Dan^{1, 2,},
CAO Huiying^{1, 2},
SUN Meng^{1, 2},
YU Liansheng^{1, 2},
DU Renpeng^{1, 2, ,}

1.
Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Harbin 150500, China
2.
Key Laboratory of Microbiology, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China

摘要

摘要: 从东北自然酸菜发酵液中分离筛选出一株高产胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）的乳酸菌，通过16S rDNA分析将该菌株鉴定为假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）HDL-3。利用该菌株进行发酵产EPS、分离纯化EPS，并解析EPS的结构和性质。结果表明，EPS是由α-(1,6)糖苷键连接而成的线性葡聚糖，分子量为1.581×10⁶ Da。EPS呈现表面光滑、有光泽、紧凑的片状非晶体结构。溶解率和持水率分别为98.63%±1.03%和401.30%±4.92%。此外，该EPS表现出非牛顿流体的剪切稀释特征，粘度与浓度呈正相关、与温度和pH呈负相关，不仅对大豆油、葵花籽油和苯具有较强的乳化能力，还对DPPH和ABTS自由基具有良好的清除能力。
- 假肠膜明串珠菌 /
- 胞外多糖 /
- 分离纯化 /
- 结构性质
Abstract: A strain of lactic acid bacteria (LAB) with high production of exopolysaccharides (EPS) was isolated and screened from the fermentation broth of natural sauerkraut in Northeast China. The strain was identified as Leuconostoc pseudomesenteroides HDL-3 by 16S rDNA. This strain was used to produce EPS by fermentation. EPS was isolated and purified, and the structure and properties of EPS were analyzed. The results showed that the EPS was a linear glucan linked by α-(1, 6) glycosidic bonds. The molecular weight was 1.581×10⁶ Da. The EPS presents a smooth, shiny and compact sheet-like amorphous structure. The solubility, water-holding capacity were 98.63%±1.03% and 401.30%±4.92%, respectively. In addition, the EPS showed the shear dilution characteristics of non-Newtonian fluid. The viscosity was positively correlated with concentration and negatively correlated with temperature and pH. It not only had strong emulsifying ability for soybean oil, sunflower seed oil and benzene, but also had good scavenging ability for DPPH and ABTS.
- Leuconostoc pseudomesenteroides /
- exopolysaccharides /
- separation and purification /
- structure and properties

HTML全文

乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是部分乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在代谢生长过程中分泌到细胞外的多糖类化合物^[1]。能够产EPS的乳酸菌有肠膜明串株菌（Leuconostoc mesenteroides）、魏斯氏菌（Weissella）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等菌属^[2-4]。根据单糖组成不同，乳酸菌EPS可分为同型多糖和异型多糖。同型多糖仅有一种单糖组成，如葡萄糖、果糖，生物合成过程较简单；而异型多糖由2种以上的单糖组成，生物合成过程较复杂^[5-6]。

近年来，随着人们对健康的不断重视，乳酸菌作为益生菌逐渐成为关注焦点，乳酸菌EPS作为乳酸菌所产的有益代谢产物，不仅可以促进肠道多种益生菌的生长和定殖、减少便秘；还具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压等作用；作为添加剂能够增强食品的持水性、流变性和稳定性，还可以优化食品的质地和口感，在食品、医药和化工等领域得到广泛应用^[6-7]。由于不同乳酸菌EPS的结构存在较大差异，其结构的差异必然导致生物活性的不同，EPS的分子质量、单糖组成以及糖苷键类型等均影响EPS的理化性质和生物学活性，其结构解析和构效关系研究已成为当前的热点和难点^[8-10]。此外，乳酸菌EPS的产量较低，限制其大规模生产及应用^[11]。目前，通过优良高产菌株的筛选、改良菌株和优化发酵条件等方法能在一定程度上提高乳酸菌EPS的产量。因此，分离筛选获得更多的新型产EPS的乳酸菌，探究EPS的结构和性质，开发乳酸菌EPS的功能特性是目前糖生物领域研究的重点。本研究利用微生物学方法从东北自然酸菜发酵液中分离筛选产EPS的乳酸菌，并对EPS进行分离纯化，研究其结构和性质，对比分析不同乳酸菌来源的EPS在结构和性质上的差异。本研究结果不仅丰富了产EPS的乳酸菌种质资源，还为EPS的构效关系研究提供理论依据，促进乳酸菌EPS的应用范围以及糖生物学的进一步发展。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

东北酸菜　取自黑龙江省大兴安岭地区新林镇家庭自制酸菜；葡聚糖凝胶G-100　上海源叶生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒　TIANGAN股份有限公司；葡萄糖、胰蛋白胨、NaNO₃、CaCO₃、三氯乙酸、溴化钾、苯酚、三氟乙酸等　分析纯，天津市科密欧化学试剂科技有限公司；MRS培养基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨1 g/L、牛肉膏1 g/L、酵母提取物5 g/L、无水乙酸钠0.5 g/L、柠檬酸铵0.2 g/L、K₂HPO₄ 0.2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.058 g/L、MnSO₄·H₂O 0.025 g/L、吐温−80 0.1 mL/L，用于乳酸菌的活化及培养；产糖MRS-S培养基：用20 g/L蔗糖取代MRS培养基中的葡萄糖。

ABI9700 PCR仪　美国基因公司；Alpha-1900Plus紫外-可见分光光度计　上海谱元仪器有限公司；TDA305凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）　英国马尔文有限公司；利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）　岛津国际贸易上海有限公司；IRAffinity-1S傅里叶变换红外光谱仪　株式会社岛津制作所；AVANCE III核磁共振谱仪　瑞士Bruker公司；S-4800场发射扫描电子电镜　日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产EPS乳酸菌的分离

根据稀释倒平板法，将稀释后的酸菜发酵液涂布于含 1%（w/w）CaCO₃的MRS培养基上，30 ℃ 培养 48 h。利用接种环挑取产生钙溶圈的单菌落接种于 30 mL MRS-S 液体培养基中，30 ℃ 培养 36 h 后，以葡萄糖作为标准品，利用苯酚硫酸法，以葡萄糖含量（μg）为横坐标，吸光值OD_{490 nm}为纵坐标绘制标准曲线，方程式为y=0.0089x−0.0034，R²=0.9992。用于分析发酵液中 EPS 的含量，选取能够高产 EPS 的乳酸菌用于下一步试验。

1.2.2 高产EPS乳酸菌的16S rDNA鉴定

取菌株MRS发酵液2 mL，12000 r/min离心1 min，获得菌体沉淀。利用细菌基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。利用引物5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’和5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’^[12]，进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证正确后，于上海生工生物公司测序，将序列与GenBank数据库中已有核苷酸序列进行同源比对，并提交至NCBI数据库。下载与获得的16S rDNA核苷酸序列同源性高的模式菌株核苷酸序列，构建系统发育树，根据同源性鉴定菌株的种属水平。

1.2.3 EPS的提取、纯化及纯度检测

以2%（v/v）的接种量将种子液接入到MRS-S产糖培养基中，30 ℃、120 r/min培养36 h，发酵液4 ℃、12000 r/min离心30 min后，向其中加入80%（w/v）的三氯乙酸使其终浓度为4%（w/v）。4 ℃静置过夜后，4 ℃、12000 r/min离心30 min去除蛋白，向上清液中加入三倍体积95%预冷乙醇，4 ℃静置过夜沉淀EPS，4 ℃、12000 r/min离心20 min获得沉淀，将沉淀溶于适量的去离子中，并装入截留分子量为8000~12000 Da的透析袋中，4 ℃透析2 d，每8 h换一次水，将透析后的EPS样品加入到Sephadex G-100凝胶过滤层析柱中，上样量为1~2 mL，利用蒸馏水为洗脱液，流速为0.2 mL/min。根据洗脱图上出峰时间接洗脱液，将收集到的洗脱液真空冷冻干燥，获得纯EPS^[13]。利用去离子水中配置成浓度为1 mg/mL的EPS溶液，经紫外分光光度计进行全波长扫描，检测纯度。

1.2.4 EPS的结构测定

1.2.4.1 分子量测定

将2.0 mg EPS溶于1 mL 0.1 mol/L NaNO₃溶液中，并以0.1 mol/L NaNO₃溶液作为洗脱剂，流速为0.5 mL/min，利用GPC测定EPS的分子量。以不同分子量的葡聚糖为标准品，上机检测，根据洗脱峰保留时间绘制标准曲线，方程式为y=−0.201x+1.385，R²=0.993。

1.2.4.2 单糖组成测定

将2 mg的EPS样品溶于含1 mol/L HCl的无水甲醇中，80 ℃下水解16 h，加入2 mol/L三氟乙酸后于120 ℃下水解1 h，所得水解产物经丙二醇甲醚丙酸酯衍生后，利用LC-15C HPLC测定EPS的单糖组成。以葡萄糖、甘露糖、半乳糖及半乳糖醛酸等为标准品，经衍生化后上机检测，根据标准品的出峰时间进行比对。

1.2.4.3 官能团组成测定

将干燥的EPS与溴化钾混合并充分研磨后，压制成薄片，利用傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR），在分辨率4 cm⁻¹，波数范围400~4000 cm⁻¹条件下，测定EPS的官能团组成。

1.2.4.4 键链接方式测定

取30 mg冻干的EPS充分溶解于重水（D₂O），在25 ℃条件下利用400 M核磁共振（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）测定¹H-NMR、¹³C-NMR谱图。

1.2.4.5 结晶构型测定

将干燥的EPS研磨后平铺于样品池中，利用X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD）测定结晶结构，测试速率为2°/min。

1.2.4.6 表面形态观察

将冻干的EPS样品固定在导电胶上，镀金后，利用扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）在电压为10 kV，放大倍数为400×条件下，观察EPS的表面结构。

1.2.5 EPS的性质测定

1.2.5.1 水溶性测定

取45 mg EPS样品充分溶解于0.5 mL去离子水中，12000 r/min离心40 min得到沉淀进行冻干，冻干样品称质量记为M₁（mg）^[14]。水溶性（Water solubility index，WSI）计算公式如下：

$\rm WSI({\text{%}})=[(45-M_{1})/45]\times 100$

1.2.5.2 持水性测定

取45 mg烘干后的EPS充分溶解于0.5 mL去离子水中，12000 r/min离心40 min得到沉淀，用滤纸小心擦掉沉淀表面水分并称质量，记为W₁（mg），称量冷冻干燥后的沉淀质量，记为W₂（mg）^[15]。EPS持水性（Water holding capacity，WHC）计算公式如下：

$\rm WHC({\text{%}})=(W_{1}/W_{2})\times 100$

1.2.5.3 黏度稳定性测定

利用粘度计测定，pH自然、室温条件下，浓度（20、40、60 mg/mL）对EPS黏度的影响；pH自然，不同温度（20、30、40 ℃）对EPS（20 mg/mL）黏度的影响；室温条件下，不同pH（4、6、8）对EPS（20 mg/mL）溶液黏度的影响。

1.2.5.4 乳化性测定

分别取2.5 mL汽油、柴油、橄榄油、豆油、葵花籽油和苯与2.5 mL浓度为2 mg/mL的EPS溶液混匀，充分振荡5 min后，在24和48 h时测定混合液乳化层。计算公式如下：

$乳化值({\text{%}})=(乳化层高度/液体总高度)\times 100$

1.2.5.5 抗氧化性能测定

DPPH自由基清除能力的测定：将2 mL（浓度范围0.5~5 mg/mL）EPS溶液与2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液混匀，暗反应30 min后，以V_C为阳性对照，测定OD_{517 nm}^[16]。DPPH自由基清除能力计算公式如下：

$\rm DPPH自由基清除率 ({\text%}) = \left[{1-}\left({A}_{1}{-A}_{2}\right){/A}_{0}\right]\times 100$

式中：A₀：水与DPPH反应；A₁：样品与DPPH反应；A₂：水与样品反应，以排除样品自身对试验的干扰。

ABTS自由基清除能力的测定：将2 mL（浓度范围0.5~5 mg/mL）EPS溶液与4 mL 7 mmol/L的ABTS工作液充分混匀，室温条件下反应6 min后，以V_C为阳性对照，测定OD_{734 nm}^[17]。ABTS自由基清除能力计算公式如下：

$\rm ABTS自由基清除率({\text%}) = \left[{1-}\left({A}_{1}{-A}_{2}\right){/A}_{0}\right]\times 100$

式中：A₀：水与ABTS反应；A₁：样品与ABTS反应；A₂：水与样品反应，以排除样品自身对试验的干扰。

1.3 数据处理

利用SPSS Statistics19软件对数据进行统计学分析，P<0.05表示差异显著。每项检测均重复3次，数据以 $\bar {\rm x}\pm {\rm s}$ 表示。

2. 结果与分析

2.1 高产EPS乳酸菌的分离与鉴定

从酸菜发酵液中共分离得到4株产EPS的乳酸菌，其中菌株HDL-3能够产（60.94±2.01）g/L的EPS，明显高于其他3株菌。HDL-3在MRS平板上呈白色、圆形、不透明、表面光滑的菌落形态（图1A）；在MRS-S平板上菌落较大，表面附着黏稠性液体（图1B），符合一般产EPS乳酸菌的菌落形态特征。16S rDNA序列分析表明，菌株HDL-3部分序列长1478 bp，NCBI数据库比对后发现，该菌株与多株Ln. pseudomesenteroides基因序列的亲缘关系最近，其中与Ln. pseudomesenteroides 3818同源性达到99%（图1C）。因此，将HDL-3鉴定为Ln. pseudomesenteroides，并命名为Ln. pseudomesenteroides HDL-3。序列提交至NCBI，获得登录号为MZ959413。

图 1 菌株HDL-3菌落形态图及系统发育树

注：A：HDL-3在MRS平板；B：HDL-3在MRS-S平板；C：系统发育树。

Figure 1. Colony morphology of strain HDL-3 and phylogenetic tree

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2.2 EPS的分离纯化及纯度分析

Ln. pseudomesenteroides HDL-3发酵液经去菌体、除蛋白、沉淀EPS、凝胶过滤层析后，在检测器上呈现单一对称的洗脱峰，表明获得相对分子量相对均一的纯品EPS。EPS溶液经全波长扫描后，在260和280 nm处未出现吸收峰，表明EPS中无核酸和蛋白污染。纯化后，EPS的浓度为（50.73±1.84）g/L，高于Ln. pseudomesenteroides XG5（35.5 g/L）^[18]，但低于W. confuse XG-3 EPS（97.5±1.1 g/L）^[19]。经冷冻干燥后，该EPS呈现白色棉花状固体。

2.3 EPS结构分析

2.3.1 EPS的分子量及单糖组成分析

GPC洗脱峰呈现单一对称峰（图2A），表明EPS样品纯度较高。根据标准曲线，计算得出EPS的分子量为1.581×10⁶ Da，与Ln. pseudomesenteroides YF32 EPS（5.54×10⁶ Da）^[20]相符合，但是高于W. cibaria SJ14 EPS（7.12×10⁴ Da）^[21]，低于Ln. pseudomesenteroides DRP-5 EPS（6.23×10⁶ Da）^[6]。EPS的分子质量与其理化特性及益生功能密切相关，低分子量的EPS具有较好的溶解性和相对舒展的糖链构象，具有更好的生物学活性^[22]。HPLC测定EPS的单糖组成，对比不同标准单糖的保留时间，表明HDL-3 EPS是由葡萄糖组成的同型多糖（图2B）。同样，W. confusa XG-3 EPS^[19]和Ln. lactis L2 EPS^[5]也是由葡萄糖组成的同型多糖。

图 2 HDL-3 EPS的GPC（A）、HPLC（B）和 FT-IR（C）谱图

Figure 2. GPC (A), HPLC (B)和 FT-IR (C) spectrum of HDL-3 EPS

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2.3.2 FT-IR分析

FT-IR可以鉴别EPS中不同的单糖，确定糖苷键构型。如图2C所示，在3423.17 cm⁻¹处有一较宽且强烈的特征吸收峰，这归因于O-H键的伸缩振动，在2923.12 cm⁻¹处的吸收峰，则归因于C-H键的伸缩振动，这两个吸收峰是多糖类物质的特征峰^[23]。在1645.22和1356.49 cm⁻¹处出现的特征信号峰则是由C=O伸缩振动引起的，在1015.23 cm⁻¹处有一个较强的信号峰，是由C-O振动引起的^[24-25]。548.30 cm⁻¹处的信号峰归因于α-D-吡喃糖的存在^[10]。HDL-3 EPS是由葡萄糖组成葡聚糖，与单糖测定结果相一致。

2.3.3 NMR分析

NMR分析可以进一步揭示EPS的糖单元种类、糖苷键构型和连接方式^[26]。¹H NMR结果显示（图3），在4.89 ppm有一个明显的特征信号峰，表明HDL-3 EPS由α-（1,6）糖苷键连接^[27]。¹³C NMR谱中73.365、71.385、70.215、69.496、65.416 ppm处出现的信号峰分别对应吡喃糖环上C3、C2、C5、C4和C6的信号峰。此外，在101和105 ppm之间无吸收峰，表明HDL-3 EPS的糖苷键类型为α构型^[13,27]。因此，根据FT-IR和NMR分析表明，HDL-3 EPS是由α-（1,6）糖苷键连接而成的线性葡聚糖。

图 3 HDL-3 EPS ¹H NMR和¹³C NMR光谱图

Figure 3. ¹H NMR and ¹³C NMR chromatograms of the HDL-3 EPS

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2.3.4 XRD分析

EPS的结晶结构与溶解性、膨胀性及一些物理特性息息相关，XRD技术可以有效的解析EPS的无定形或结晶特性。HDL-3 EPS呈现出一种无定形状态，只在2θ为20°时出现强衍射峰（图4），这是因为该EPS中含有大量的无定形区域，少量的结晶区隐藏在无定形区域内，整体上呈现出一种相对无定形的状态。此结果与W. confusa XG-3 EPS^[19]和W. confusa C19 EPS^[28]相符。

图 4 HDL-3 EPS的XRD光谱图

Figure 4. XRD chromatograms of HDL-3 EPS

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2.3.5 SEM测定

SEM可用来观察EPS的形貌，已成为研究大分子生物多糖表观形貌的有力工具。结果如图5所示，HDL-3 EPS展现出表面光滑、有光泽且紧凑的片状结构。Lb. plantarum WLPL04 EPS也呈现紧凑的片状结构^[29]，而Lb. plantarum AR307 EPS呈现分支化状链结构^[30]。片状紧凑的结构使EPS具有良好的机械稳定性，光滑、有光泽的结构使EPS具备制成可塑性膜材料的潜力，应用于医药、化工及食品等领域^[31]。

图 5 HDL-3 EPS的SEM显微形态（400×）

Figure 5. Microscopic morphology under SEM of HDL-3 EPS (400×)

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2.4 EPS性质分析

2.4.1 水溶性及持水性分析

HDL-3 EPS的溶解率和持水率分别为98.63%±1.03%、401.30%±4.92%，其中溶解性显著高于、持水性低于Ln. lactis L2 EPS（分别为91.90%±2.45%和509.45%±28.59%）^[7]。较高的溶解率是归因于EPS含有大量羟基的葡萄糖单元，可与氢键形成大量的水。HDL-3 EPS展现良好的亲水性和保水能力，可作为生物表面活性剂和稳定剂应用于化工及食品等领域^[32]。

2.4.2 粘度稳定性分析

HDL-3 EPS的粘度稳定性分析如图6所示，随转速的增加EPS溶液的粘度逐渐减小，即表现出非牛顿流体的剪切稀释特征。在室温条件下，EPS溶液粘度与浓度呈正相关。浓度的增加提高了多糖链之间的相互作用，使得部分EPS分子发生联结，聚合程度增加。在pH自然、不同温度条件下，EPS溶液粘度与温度呈负相关，这可能是因为温度升高，EPS分子运动加剧，分子间相互作用力不足以约束分子运动，致使粘度下降^[33-34]。此外，较高的pH会使EPS溶液粘度下降，这可能是因为碱性条件下EPS的组成及结构容易发生变化。因此，HDL-3 EPS可作为食品添加剂提高牛奶、酸奶、乳酪等食品的粘度，改善食品质地。

图 6 浓度（A）、温度（B）、pH（C）对HDL-3 EPS流变学特性的影响

Figure 6. Effect of concentration (A), temperature (B), pH (C) on the rheological properties of HDL-3 EPS

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2.4.3 乳化性分析

乳化剂能够将两种不相溶解的液相体系保持稳定性，广泛应用在化学、食品、医药及石油等领域。HDL-3 EPS对不同油类及烃类物质的乳化能力如表1所示，整体的乳化趋势为：大豆油>苯>葵花籽油>汽油>柴油>橄榄油，其中对大豆油、葵花籽油和苯的乳化能力均超过60%。此外，随着时间的延长，HDL-3 EPS对汽油和柴油的乳化能力呈现少量增强的趋势，而对橄榄油、大豆油、葵花籽油和苯的乳化能力呈现降低的趋势。此结果与W. confusa H2 EPS相一致^[35]。可能是因为EPS与不同的油类和烃类发生特异性结合，使得EPS的分子质量、键合方式、氢键、糖残基、支化度和静电斥力等发生变化，从而导致不同的乳化能力。

表 1 HDL-3 EPS对不同油类和烃类化合物的乳化能力

Table 1. Emulsifying activity of HDL-3 EPS for different oils and hydrocarbons

有机相	乳化率（%）
有机相	24 h	48 h
汽油	55.74±1.23^c	59.77±0.70^cd
柴油	52.59±2.13^c	56.83±1.52^d
橄榄油	49.83±2.01^c	48.73±1.75^e
大豆油	85.44±1.92^a	80.27±2.01^a
葵花籽油	64.92±2.34^b	62.73±2.67^bc
苯	70.45±1.07^b	67.18±0.82^b
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

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2.4.4 抗氧化性分析

大多数乳酸菌EPS无论在体内还是体外均具有抗氧化功能，能够参与自由基清除，从而作为天然的安全抗氧化剂发挥作用^[36]。HDL-3 EPS对DPPH和ABTS自由基的清除能力如图7所示，随着EPS浓度的增加，清除能力呈现先增加后保持稳定的趋势，在5.0 mg/mL时，清除率最高，分别为36.58%±1.04%和34.21%±0.27%，高于Lb. casei Y3 EPS^[37]。EPS抗氧化活性与多种因素有关，包括分子质量、单糖组成、官能团类型及EPS提取方法等^[38]。研究发现，EPS的抗氧化能力与糖醛酸的含量有关，相较V_C，HDL-3 EPS不具备强的氧化能力，可能是因为其仅由葡萄糖组成^[22]。

图 7 HDL-3 EPS的DPPH（A）和ABTS（B）自由基清除能力

注：*代表试验组和对照组之间差异显著（P<0.05）。

Figure 7. The scavenging activity of DPPH (A) and ABTS (B) of HDL-3 EPS

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3. 结论

本研究从自然酸菜发酵液中分离得到一株产EPS的乳酸菌，经鉴定该菌株为Ln. pseudomesenteroides，并命名为Ln. pseudomesenteroides HDL-3。以该菌株为发酵剂发酵产EPS，并分离纯化，得到高纯度EPS，其产量为（50.73±1.84）g/L。该EPS由葡萄糖构成，分子量为1.581×10⁶ Da。结构分析发现该EPS是由α-（1,6）糖苷键连接而成的线性葡聚糖，呈表面光滑、有光泽且紧凑的片状结构。HDL-3 EPS溶解率和持水率分别为98.63%±1.03%和401.30%±4.92%。该EPS的粘度随着温度和pH的升高而降低，对大豆油、葵花籽油和苯有良好的乳化能力，DPPH和ABTS自由基的清除能力可分别达到36.58%±1.04%和34.21±0.27%。因此，Ln. pseudomesenteroides HDL-3 EPS可作为作为天然食品添加剂、增稠剂、乳化剂或抗氧化剂应用在食品及医药等领域。

图 1 菌株HDL-3菌落形态图及系统发育树

注：A：HDL-3在MRS平板；B：HDL-3在MRS-S平板；C：系统发育树。

Figure 1. Colony morphology of strain HDL-3 and phylogenetic tree

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图 2 HDL-3 EPS的GPC（A）、HPLC（B）和 FT-IR（C）谱图

Figure 2. GPC (A), HPLC (B)和 FT-IR (C) spectrum of HDL-3 EPS

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图 3 HDL-3 EPS ¹H NMR和¹³C NMR光谱图

Figure 3. ¹H NMR and ¹³C NMR chromatograms of the HDL-3 EPS

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图 4 HDL-3 EPS的XRD光谱图

Figure 4. XRD chromatograms of HDL-3 EPS

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图 5 HDL-3 EPS的SEM显微形态（400×）

Figure 5. Microscopic morphology under SEM of HDL-3 EPS (400×)

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图 6 浓度（A）、温度（B）、pH（C）对HDL-3 EPS流变学特性的影响

Figure 6. Effect of concentration (A), temperature (B), pH (C) on the rheological properties of HDL-3 EPS

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图 7 HDL-3 EPS的DPPH（A）和ABTS（B）自由基清除能力

注：*代表试验组和对照组之间差异显著（P<0.05）。

Figure 7. The scavenging activity of DPPH (A) and ABTS (B) of HDL-3 EPS

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表 1 HDL-3 EPS对不同油类和烃类化合物的乳化能力

Table 1 Emulsifying activity of HDL-3 EPS for different oils and hydrocarbons

有机相	乳化率（%）
有机相	24 h	48 h
汽油	55.74±1.23^c	59.77±0.70^cd
柴油	52.59±2.13^c	56.83±1.52^d
橄榄油	49.83±2.01^c	48.73±1.75^e
大豆油	85.44±1.92^a	80.27±2.01^a
葵花籽油	64.92±2.34^b	62.73±2.67^bc
苯	70.45±1.07^b	67.18±0.82^b
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

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参考文献(38)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 产EPS乳酸菌的分离
1.2.2 高产EPS乳酸菌的16S rDNA鉴定
1.2.3 EPS的提取、纯化及纯度检测
1.2.4 EPS的结构测定
1.2.4.1 分子量测定
1.2.4.2 单糖组成测定
1.2.4.3 官能团组成测定
1.2.4.4 键链接方式测定
1.2.4.5 结晶构型测定
1.2.4.6 表面形态观察
1.2.5 EPS的性质测定
1.2.5.1 水溶性测定
1.2.5.2 持水性测定
1.2.5.3 黏度稳定性测定
1.2.5.4 乳化性测定
1.2.5.5 抗氧化性能测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 高产EPS乳酸菌的分离与鉴定
2.2 EPS的分离纯化及纯度分析
2.3 EPS结构分析
2.3.1 EPS的分子量及单糖组成分析
2.3.2 FT-IR分析
2.3.3 NMR分析
2.3.4 XRD分析
2.3.5 SEM测定
2.4 EPS性质分析
2.4.1 水溶性及持水性分析
2.4.2 粘度稳定性分析
2.4.3 乳化性分析
2.4.4 抗氧化性分析
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 产EPS乳酸菌的分离
1.2.2 高产EPS乳酸菌的16S rDNA鉴定
1.2.3 EPS的提取、纯化及纯度检测
1.2.4 EPS的结构测定
1.2.4.1 分子量测定
1.2.4.2 单糖组成测定
1.2.4.3 官能团组成测定
1.2.4.4 键链接方式测定
1.2.4.5 结晶构型测定
1.2.4.6 表面形态观察
1.2.5 EPS的性质测定
1.2.5.1 水溶性测定
1.2.5.2 持水性测定
1.2.5.3 黏度稳定性测定
1.2.5.4 乳化性测定
1.2.5.5 抗氧化性能测定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 高产EPS乳酸菌的分离与鉴定
2.2 EPS的分离纯化及纯度分析
2.3 EPS结构分析
2.3.1 EPS的分子量及单糖组成分析
2.3.2 FT-IR分析
2.3.3 NMR分析
2.3.4 XRD分析
2.3.5 SEM测定
2.4 EPS性质分析
2.4.1 水溶性及持水性分析
2.4.2 粘度稳定性分析
2.4.3 乳化性分析
2.4.4 抗氧化性分析
3. 结论

参考文献(38)

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假肠膜明串珠菌HDL-3胞外多糖的分离纯化及结构性质分析

作者简介: 赵丹（1980−），女，博士，教授，研究方向：微生物次生代谢产物与生理，E-mail：zhaodan4u@163.com

通讯作者: 杜仁鹏（1989−），男，博士，副教授，研究方向：微生物次生代谢产物与生理，E-mail：durenpeng20096292@163.com

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