Study on Structure and Properties of Hydrolyzed Rice Protein with High Emulsification Properties
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摘要: 为了探究大米蛋白酶解产物中乳化性较好的关键组分，采用酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶限制性酶解大米蛋白，分析表面疏水性、二级结构、乳化活性及乳液稳定性以探究不同酶解产物结构特性和乳化特性的关系；筛选最优乳化特性样品后对其超滤分离得到<5 kDa、5~10 kDa和>10 kDa组分，通过界面张力、耗散型石英晶体微天平、粒径、微观结构及贮藏稳定性等指标，探究不同分子量肽的界面特性和乳液稳定性的关系。结果表明，胰蛋白酶酶解产物的得率最高；与大米蛋白相比，除水解度为6%的胰蛋白酶酶解产物外，其他酶解产物的表面疏水性均降低；酶解后β-折叠显著降低，蛋白结构更加舒展；胰2%具有较好的乳化性能；<5 kDa制备的乳液稳定性最差，贮存7 d后粒径由2.59 μm增加到7.82 μm；而>10 kDa组分界面张力较小，界面层较厚，具有较好的乳液贮藏稳定性，表明分子量较大的肽更能有效地稳定乳液。Abstract: In order to explore the key components affecting the emulsification characteristics in hydrolyzed rice protein. rice protein was hydrolyzed by acidprotease, papain and trypsin, respectively. The relationships between the structural and functional properties of different hydrolyzed rice proteins were studied by surface hydrophobicity, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), emulsifying activity index and emulsifying stability index. <5 kDa, 5~10 kDa, and >10 kDa were separated from the rice protein with degree of 2% treated with trypsin (trypsin 2%) by ultrafiltration. The interfacial tension, quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D), mean diameter particle, confocal laser scanning microscope (CLSM) and storage stability were measured to explore the influence of molecular weight on the interfacial characterization and emulsion stability. The results demonstrated that hydrolysates treated with trypsin exhibited the highest yield. Compared with the rice protein, the surface hydrophobicity of the enzymatic hydrolysis products declined significantly except for the rice protein with degree of 6% treated with trypsin (trypsin 6%). The secondary structure content revealed that the β-sheet contents of hydrolyzed rice protein significantly decreased, showing that the structure of hydrolyzed rice protein was more unfolded. The trypsin 2% exhibited the better emulsifying capacity. The mean diameter particle of <5 kDa-stabilized emulsions increased from 2.59 μm to 7.82 μm after 7 days storage. The result suggested that emulsion stabilized with <5 kDa had poor storage stability. >10 kDa had lower interfacial tension and thicker interfacial film than the others. The emulsion prepared by >10 kDa exhibited better emulsion stability. The results indicated that the emulsion stabilized by high molecular peptides was more stable than the smaller ones.
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食品行业中常用的乳化剂有合成乳化剂和动物基乳化剂[1]。植物基乳化剂（如植物蛋白）因价格低廉，对环境友好，是食品乳化剂发展的主要趋势，且与联合国粮农组织可持续发展的理念一致。大米蛋白作为优质植物蛋白之一，具有高生物效价、低过敏性、氨基酸配比全面合理和易消化吸收等优点[2]，引起人们的广泛关注，逐渐成为食品领域的研究热点。然而大米蛋白分子链间相互交联、高度疏水等因素[2]致使其水溶性差，限制了其在食品乳化剂领域中的应用。因此通常对大米蛋白进行改性，进而改善大米蛋白的乳化性。
酶法改性具有反应温和、节约能源成本等优点[3]，被广泛应用在蛋白的改性方面[4-6]。蛋白酶有特定的酶切位点，且最适pH不同，如酸性蛋白酶主要作用于C-端疏水性氨基酸残基[7]，最适pH为2~4；木瓜蛋白酶作用于精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的羧基端[8]，在pH7下反应；胰蛋白酶作用位点为精氨酸和赖氨酸的羧基[8]，最适pH为8左右。根据“结构决定性质”的理论观点，蛋白酶类型和水解度均会影响酶解产物的结构，进而改变功能特性，如乳化性。值得注意的是，蛋白质过度水解会降低乳化特性等功能特性，因此进行限制性酶解至关重要[9]。江连洲等[10]使用多种蛋白酶酶解大豆蛋白，发现碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解产物的乳化性变化不大，其他酶解产物的乳化性有不同程度的提升。有研究报道用木瓜蛋白酶处理大豆分离蛋白，酶解产物的乳化活性随着水解度的增加而降低[8]。因此，酶类型和水解度对大米蛋白酶解产物结构和功能特性的影响值得探究。酶解蛋白是混合物，包括不同分子量段的肽。有研究表明乳清蛋白的>5 kDa的肽组分比<5 kDa肽组分形成的乳液更稳定[11]。但是对于植物蛋白，尤其是大米蛋白酶解产物中乳化性较好的主要组分尚不明确。
因此，本文用不同类型的酶处理大米蛋白，研究酶解产物的结构特性和功能性质，筛选乳化性较好的酶解产物分离出<5 kDa，5~10 kDa和>10 kDa三种不同分子量的肽组分，研究其界面特性和乳液稳定性间的相互关系，为大米蛋白作为新型植物基乳化剂的商业化的开发与应用提供理论指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大米蛋白（纯度90%） 江西金农生物科技有限公司；酸性蛋白酶（100000 U/g） 安琪酵母股份有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白酶（1500 U/mg） 北京索莱宝科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、Florisil分子筛（60~100目）、尼罗红 上海麦克林生化科技有限公司；1-十六烷硫醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超滤膜（5 kDa、10 kDa） 美国密理博有限公司；喜燕玉米胚芽油 超市购买；其它试剂均为分析纯。
F2700荧光分光光度计 日本日立公司；T18数显高速分散机 德国IKA仪器有限公司；Nicolet islo傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司；Labscale超滤系统 美国密理博有限公司；JY92-IIDN超声波细胞破碎仪（900 W） 宁波新芝生物科技股份有限公司；DSA100S光学接触角测量仪 德国Krüss公司；S3500粒度分析仪 美国麦奇克有限公司；TCS SP5型激光共聚焦显微镜 美国安捷伦公司；Q-Sense Explorer耗散型石英晶体微天平 瑞典百欧林科技有限公司。
1.2 实验方法
本文的研究路线图如图1所示。
1.2.1 大米蛋白酶解产物的制备
本文采用的原料为大米粉直接碱提酸沉而得，根据Xu等[12]的方法对大米蛋白进行酶法水解：30 g大米蛋白于500 mL蒸馏水中室温搅拌分散1 h，分别置于最适温度和pH下进行酶解。其中，酶与底物的质量比为1:100。酶解条件分别为胰蛋白酶50 ℃，pH8；木瓜蛋白酶50 ℃，pH7；酸性蛋白酶37 ℃，pH3。酶解过程中，分别滴加0.1023 mol/L NaOH或0.1051 mol/L HCl溶液以保持pH稳定。酶解完成后，置于90 ℃加热10 min灭酶，迅速冰浴冷却至室温，最后调为pH7，离心（3000 r/min，15 min）后取上清液冻干，以备后用。水解度（the degree of hydrolysis，DH）通过pH-stat法测定[13]，公式如下：
DH(%)=B×Nbα×Mp×htot×100 (1) 式中：B和Nb分别是NaOH消耗的体积（mL）和NaOH的浓度（mol/L）；Mp是蛋白质质量（g）；α是pH8和50 ℃处理下α-NH3+的解离度（0.885）；htot是每克大米蛋白中肽键的理论毫摩尔数（7.40 meq/g）[12]。
水解度为2%的胰蛋白酶酶解产物命名为“胰2%”，水解度为6%的称为“胰6%”，其它酶解产物命名同理。
1.2.2 结构特性的测定
1.2.2.1 表面疏水性
表面疏水性采用ANS荧光探针法，对Chen等[14]的步骤稍作修改。将蛋白酶解产物溶于磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7）使其浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08和0.1 mg/mL。激发波长和发射波长参数分别设置为390和470 nm。将20 μL 8 mmol/L的ANS分别加入酶解产物溶液中，涡漩振荡5 s后，避光静置10 min，摇匀后测定荧光强度。荧光强度对不同样品的酶解产物浓度作图，表面疏水性指数用初始段斜率表示。
1.2.2.2 傅里叶红外光谱
取适量酶解产物粉末与溴化钾研磨均匀并压片，设置分辨率参数为4 cm−1、扫描32次，在4000~400 cm−1下测定。
1.2.3 乳化活性及乳化稳定性的测定
参考Zheng等[6]的方法略作修改测定乳化特性。将16 mL酶解产物溶液（1 g/100 mL）与4 mL玉米油用高速分散机以12000 r/min的速度高速分散1 min。立即准确量取距离容器底部0.5 cm处的乳状液70 μL，与7 mL SDS溶液（0.1 g/100 mL）涡漩10 s混匀。在500 nm下测定溶液的吸光值A0，10 min后再次测定A10，计算乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI），公式如下：
EAI(m2/g)=2×2.303C×(1−ϕ)×104×A0×稀释倍数 (2) ESI(%)=A10×100A0 (3) 式中：C为酶解产物的浓度（g/mL），ϕ为油相的体积分数（L/L），本实验中为0.20。
1.2.4 酶解产物的超滤分离
参考宋凯强等[15]的方法稍作修改，采用Labscale超滤系统对胰2%酶解产物进行分离。首先采用10 kDa超滤膜进行超滤，当截留液体积剩余5%左右时，停止超滤，收集截留液称为“>10 kDa”。透过液继续采用5 kDa超滤膜进行分离，收集截留液为“5~10 kDa”，透过液为“<5 kDa”。超滤过程中，循环压力和进口压力分别设置为0.2 MPa。超滤得到的分级肽液体于−80 ℃预冻后在真空冷冻干燥机中冻干备用。<5 kDa、5~10 kDa和>10 kDa的得率分别为40.20%、13.88%和45.92%。
1.2.5 不同分子量肽的界面特性测定
1.2.5.1 界面张力
参考王金梅[16]的方法，采用悬滴法测定了油-水界面上吸附蛋白质的界面张力（σ）随吸附时间的变化。因玉米油中有少量表面活性成分，先通过Florisil分子筛进行纯化。100 g玉米油中加3 g Florisil分子筛，搅拌30 min后离心，重复操作三次，直到10 mmol/L磷酸盐缓冲液的界面张力在30 min内不发生明显变化。将纯化后的玉米油盛在玻璃槽中，不同浓度（0.01、0.1 g/100 mL）的分级肽溶液通过注射器在针尖形成45 μL的液滴。在实验过程中，整个系统避免外部振动干扰测量。基于液滴形状，由Young-Laplace方程式计算出界面张力σ（精确至0.01 mN/m）。
1.2.5.2 肽在疏水表面吸附行为的测定
参考Zhang等[17]的方法，采用耗散型石英晶体微天平（quartz crystal microbalance with dissipation，QCM-D）研究肽在疏水表面上的吸附行为。洁净的金芯片（QSX 301,4.95 MHz）浸入1-十六烷硫醇至少8 h，形成自组装疏水层模拟油-水界面，用乙醇和超纯水冲洗，除去未吸附的1-十六烷硫醇。先通10 mmol/L pH7的磷酸盐缓冲液获得稳定基线，随后泵入1 g/100 mL样品溶液，流速0.1 mL/min。90 min后再次通入磷酸盐缓冲液，以冲洗未结合或结合松散的乳化剂。最后用Q-ToolsTM软件分析不同倍频下的频率和耗散，并用Sauerbrey模型分析吸附的厚度。本研究使用第三倍频分析数据，因为此倍频下共振受机械影响最小[17]。
1.2.6 乳液的制备
参考王霞等[18]的方法稍作修改。将4 g分级肽分散于100 mL磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7）中，搅拌1 h并4 ℃过夜水化。第2 d放置室温后，取18 g分级肽溶液与2 g玉米油高速分散（10000 r/min，2 min）制备粗乳液，随后在450 W超声功率下超声8 min，期间用冰水浴防止过热。乳液制备完成后，加入叠氮化钠（0.01 g/100 mL）以抑制微生物的生长。
1.2.7 乳液的贮藏稳定性测定
1.2.7.1 乳液液滴平均粒径
使用粒度分析仪测量乳液在0和7 d表面积平均粒径（d3,2）。玉米油折光率设置1.45，分散相折光率1.33，搅拌速度1200 r/min。所有样品均用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7）稀释，以避免多重散射影响。
1.2.7.2 乳液的微观结构分析
采用激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）观察乳液的微观结构。1 mL乳液加入20 μL尼罗红溶液（1 mg/mL于乙醇中）进行染色，取6 μL样品于载玻片上，盖上盖玻片。将香柏油滴至盖玻片中央，使用488 nm激光激发源，HCX PLAPO 63×油镜观察乳液。
1.3 数据处理
每组实验重复3次，结果采用平均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 20进行单因素分析和Tukey分析样品之间的显著性差异（P<0.05），采用Origin 2021进行数据作图处理。
2. 结果与分析
2.1 酶解时间对大米蛋白水解度的影响
大米蛋白在三种蛋白酶的最适条件下进行酶法水解，结果如图2所示，水解度在最初10 min均迅速增加，表明大量肽键被破坏，随后水解度增加缓慢，可能是因为氨基酸酶解位点的减少或者酶失去活性，这与Hanafi等[19]的报道一致。酶解过程中胰蛋白酶的水解度最高，其次为酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶，这可能与蛋白酶的酶活不同有关。综合考虑酶解时间和样品得率，本次研究选用水解度为2%、6%的酶解产物作后续研究。其中酸性蛋白酶酶解时间分别为1.29和43.03 min，木瓜蛋白酶酶解时间分别为6.57和57.92 min，胰蛋白酶酶解时间分别为1.64和25.49 min。经不同酶处理后各样品蛋白的得率如表1所示，随着水解度的增加，酶解蛋白的得率也随之增大。不同蛋白酶酶解产物得率不同，这可能是由于酶的酶切位点不一致，酶解后肽段大小不一，进而导致溶解在上清液中肽的质量也有差异[20]。
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图 2 不同酶酶解过程中大米蛋白水解度随时间变化Figure 2. Changes of hydrolysis degree of rice protein withtime in different enzymes表 1 不同酶酶解大米蛋白产物的得率Table 1. The yield of rice protein hydrolysates treated with different enzymes样品名称 酸2% 酸6% 木2% 木6% 胰2% 胰6% 酶解产物得率（%） 33.9 38.7 22.4 34.0 35.2 45.0 2.2 酶类型对酶解产物结构特性的影响
2.2.1 表面疏水性分析
如图3所示，与大米蛋白相比，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物表面疏水性显著降低（P<0.05）。这与Singh等[5]结果一致。他们发现采用木瓜蛋白酶处理米糠浓缩蛋白后，表面疏水性显著降低。这可能是因为酶解后具有亲水位点的肽释放而减少了ANS探针的结合位点，表面疏水区域被破坏或者疏水相互作用使肽段之间发生了聚集，将疏水区域埋在聚集体内[21]。胰6%的表面疏水性比胰2%高，这可能是由于肽段发生解折叠，而阻碍肽的聚集，使更多疏水基团暴露[22]。不同酶类型的酶解产物表面疏水性结果存在差异，这可能是由于不同的酶作用蛋白质的位点不一致，进而导致酶解产生的肽亲疏水性位点不同。这与韩仁娇等[23]研究结果一致。他们采用六种蛋白酶限制性酶解乳清蛋白后，发现酶解产物疏水性降低的程度不同，主要是不同的酶切割位点不同，疏水性氨基酸末端暴露不一致导致的。
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图 3 大米蛋白及不同酶解产物的表面疏水性注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 3. The surface hydrophobicity of the rice protein and enzymatic hydrolysis product2.2.2 傅里叶红外光谱分析
对蛋白质二级结构进行定量分析（表2）可知，大米蛋白的酶解产物α-螺旋和β-转角含量显著增加，而有序的β-折叠含量显著降低（P<0.05）。β-折叠相较于α-螺旋、β-转角更为稳定，随着β-折叠的减少，蛋白的二级结构更为舒展[24]。具有更灵活结构的蛋白质更易吸附到界面上并在界面上伸展，且可形成粘弹性较高的界面膜[25]。因此与大米蛋白相比，大米蛋白酶解产物更易吸附到油-水界面上以稳定乳液。
表 2 大米蛋白及酶解产物的二级结构分布、乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性（ESI）Table 2. The secondary structure compositions, emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability (ESI) of samples指标 原蛋白 酸2% 酸6% 木2% 木6% 胰2% 胰6% α-螺旋（%） 40.79±0.02a 42.48±0.07d 43.97±0.08e 42.17±0.07c 42.23±0.05c 41.74±0.05b 41.77±0.04b β-折叠（%） 43.75±0.22e 34.10±0.28b 30.75±0.2a 34.85±0.17c 34.28±0.21b 36.65±0.05d 36.34±0.13d β-转角（%） 15.46±0.25a 23.41±0.22d 25.27±0.12e 22.98±0.1c 23.49±0.16d 21.62±0.01b 21.89±0.08b 乳化活性指数（m2/g） 6.16±0.20a 9.82±0.06b 15.14±1.42d 21.31±0.92f 20.51±0.34e 20.65±3.94e 10.66±0.33c 乳化稳定性（min） 91.23±1.19f 82.77±1.95c 83.66±1.48cd 79.93±1.46b 83.09±4.08cd 84.00±10.72e 71.63±0.91a 注：同一行不同的字母表示差异显著（P<0.05）。 2.3 酶类型对酶解产物乳化活性及乳化稳定性的影响
蛋白质的两亲性使其可以作为乳化剂来制备乳液。乳化活性指数（EAI）表征蛋白质形成油水界面的能力，乳化稳定性（ESI）表征乳液液滴的抵抗应变的能力，与蛋白分子量、表面疏水等因素有关[26]。如表2所示，与大米蛋白相比，大米蛋白酶解产物的EAI显著增加（P<0.05），可能是由于酶解一定程度上降低了蛋白质的分子量，使肽链伸展。胰6%的EAI比胰2%低，这可能是由于过度酶解使蛋白质分子量进一步降低，较小的肽可能无法在乳化液滴表面形成粘弹性膜，肽段两亲性降低，在油水界面间的相互作用受到抑制，降低了乳液的稳定性[27]。并且发现酶解产物的ESI均小于原蛋白。Ghribi等[28]也发现鹰嘴豆蛋白酶解后的ESI低于原蛋白，可能是因为酶解产生的小肽在界面上相互作用的能力降低，从而降低了界面膜的粘弹性。
大米蛋白经三种蛋白酶处理后，木瓜蛋白酶酶解产物和胰2%乳化特性较好，但是木瓜蛋白酶酶解产物的得率小于胰2%。综合考虑酶解时间及得率等因素，结合能源消耗，本文最终选用胰2%超滤分离得到不同尺寸的分级肽，进行高乳化特性酶解产物界面特性和乳液稳定性的研究。
2.4 分级肽界面特性的分析
2.4.1 界面张力分析
吸附动力学在研究蛋白质乳液形成和稳定方面起着重要作用，蛋白质吸附到油-水界面上一般包含蛋白质分子扩散到界面、在界面上的渗透以及在界面上的结构重排三个主要阶段，对其乳化性质有着重要影响[29]。由图4可知，随着时间的延长，界面张力逐渐降低，这与蛋白质吸附在油-水界面上有关。在吸附初始阶段界面张力降低较快，这可能是由于在油水界面上有许多自由吸附位点。而随着时间的延长，降低速率减慢。这是因为吸附位点逐渐被肽填充，从而在界面产生更高的空间位阻和能量屏障[30]。界面张力降低将减少界面的吉布斯自由能，增强界面层的稳定性[31]。本研究中界面张力最小的为>10 kDa组分，由此推测>10 kDa可能具有更好的乳化稳定性。
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图 4 分级肽在油-水界面上界面张力随时间的变化注：蛋白浓度：（a）0.01%，（b）0.1%。Figure 4. The changes of interfacial tension of different graded peptides at the oil-water interface with time2.4.2 QCM-D分析
QCM-D用于分析不同肽在模拟油-水界面上的吸附-解吸行为。如图5所示，在吸附过程中频率迅速下降，耗散急剧增加，这是因为肽在疏水表面上的快速吸附所导致的。随着吸附时间的延长，频率和耗散值均变化缓慢，这是肽分子的缓慢吸附导致的，因为大多数吸附位点被填满，部分乳化剂继续吸附到已经形成的界面层上，形成多层吸附[32]。通入磷酸盐缓冲液冲洗之后，频率增加，耗散减小，但并未恢复原来的值，说明一些吸附较弱的乳化剂分子从界面上被冲洗下来。表3中样品的吸附厚度表明，界面膜的厚度随着肽分子量的增加而增加。界面膜的厚度对乳液的稳定性起着重要的作用，界面膜越厚，乳液的稳定性越好[33]。在本研究中，>10 kDa组分形成了较厚的界面层，因此推测其具有较好的乳液稳定性。
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图 5 样品吸附和冲洗在疏水金表面过程中频率和耗散（第三倍频）随时间的变化注：f代表频率，D代表耗散。Figure 5. Frequency and dissipation （of the third overtone） due to samples adsorption and rinsing onto the hydrophobic gold surface as a function of time表 3 冲洗前后吸附厚度和贮藏7 d后乳液平均粒径（d3,2）Table 3. Thickness of adsorbed layer both before and after rinsing and mean diameter (d3,2) of emulsions after storage seven days乳液类型 吸附厚度（nm） d3,2-0 d（μm） d3,2-7 d（μm） <5 kDa 0.86±0.08a 2.59±0.11b 7.82±0.25c 5~10 kDa 1.74±0.11b 1.13±0.09a 1.90±0.30b >10 kDa 1.97±0.05bc 1.14±0.05a 1.37±0.14a 注：同一列不同的字母表示差异显著（P<0.05）。 2.5 分级肽乳液贮藏稳定性的分析
通常，粒径较小的乳液对液滴聚集和重力诱导的相分离具有更好的抵抗力。由表3可知，新鲜制备的乳液表面积平均粒径由大到小依次为<5 kDa、>10 kDa和5~10 kDa，且微观结构（图6）表明液滴分布较为均一。储存7 d后，乳液平均粒径均发生了不同程度得增加，其中<5 kDa制备的乳液粒径变化最大且发生絮凝。这可能是由于<5 kDa组分酶解程度较高，尺寸较小，会降低界面层的厚度和强度，不能有效地抑制液滴聚集，导致乳液失稳[11]。通常液滴粒径越小的乳液，其抵抗液滴聚集和相分离的能力越强，乳液越稳定。结果表明，>10 kDa比<5 kDa能更有效地形成稳定的乳液。
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图 6 不同分级肽制备乳液0 d和7 d的激光共聚焦图像（63×）Figure 6. Confocal laser images of emulsion stabilized by different peptides at 0 d and 7 d (63×)3. 结论
对三种不同蛋白酶处理的大米蛋白酶解产物（水解度为2%和6%）的结构及功能性质研究发现，酶解后的蛋白表面疏水性有较大差异，乳化活性显著增加；酶解使α-螺旋和β-转角含量增加，β-折叠含量降低；相比其他酶解产物，胰2%有较好的乳化特性及得率。对其进行分离，得到<5 kDa、5~10 kDa和>10 kDa三种组分，并探究组分界面特性与乳液稳定性之间的关系，发现>10 kDa组分的界面张力最低，吸附厚度最大，乳液贮藏稳定性最好。因此>10 kDa能形成更稳定的乳液，这为高乳化性植物蛋白基产品的设计提供新思路。
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图 2 不同酶酶解过程中大米蛋白水解度随时间变化
Figure 2. Changes of hydrolysis degree of rice protein withtime in different enzymes
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图 3 大米蛋白及不同酶解产物的表面疏水性
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 3. The surface hydrophobicity of the rice protein and enzymatic hydrolysis product
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图 4 分级肽在油-水界面上界面张力随时间的变化
注：蛋白浓度：（a）0.01%，（b）0.1%。
Figure 4. The changes of interfacial tension of different graded peptides at the oil-water interface with time
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图 5 样品吸附和冲洗在疏水金表面过程中频率和耗散（第三倍频）随时间的变化
注：f代表频率，D代表耗散。
Figure 5. Frequency and dissipation （of the third overtone） due to samples adsorption and rinsing onto the hydrophobic gold surface as a function of time
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图 6 不同分级肽制备乳液0 d和7 d的激光共聚焦图像（63×）
Figure 6. Confocal laser images of emulsion stabilized by different peptides at 0 d and 7 d (63×)
表 1 不同酶酶解大米蛋白产物的得率
Table 1 The yield of rice protein hydrolysates treated with different enzymes
样品名称 酸2% 酸6% 木2% 木6% 胰2% 胰6% 酶解产物得率（%） 33.9 38.7 22.4 34.0 35.2 45.0 
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表 2 大米蛋白及酶解产物的二级结构分布、乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性（ESI）
Table 2 The secondary structure compositions, emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability (ESI) of samples
指标 原蛋白 酸2% 酸6% 木2% 木6% 胰2% 胰6% α-螺旋（%） 40.79±0.02a 42.48±0.07d 43.97±0.08e 42.17±0.07c 42.23±0.05c 41.74±0.05b 41.77±0.04b β-折叠（%） 43.75±0.22e 34.10±0.28b 30.75±0.2a 34.85±0.17c 34.28±0.21b 36.65±0.05d 36.34±0.13d β-转角（%） 15.46±0.25a 23.41±0.22d 25.27±0.12e 22.98±0.1c 23.49±0.16d 21.62±0.01b 21.89±0.08b 乳化活性指数（m2/g） 6.16±0.20a 9.82±0.06b 15.14±1.42d 21.31±0.92f 20.51±0.34e 20.65±3.94e 10.66±0.33c 乳化稳定性（min） 91.23±1.19f 82.77±1.95c 83.66±1.48cd 79.93±1.46b 83.09±4.08cd 84.00±10.72e 71.63±0.91a 注：同一行不同的字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 3 冲洗前后吸附厚度和贮藏7 d后乳液平均粒径（d3,2）
Table 3 Thickness of adsorbed layer both before and after rinsing and mean diameter (d3,2) of emulsions after storage seven days
乳液类型 吸附厚度（nm） d3,2-0 d（μm） d3,2-7 d（μm） <5 kDa 0.86±0.08a 2.59±0.11b 7.82±0.25c 5~10 kDa 1.74±0.11b 1.13±0.09a 1.90±0.30b >10 kDa 1.97±0.05bc 1.14±0.05a 1.37±0.14a 注：同一列不同的字母表示差异显著（P<0.05）。
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