Isolation, Purification, Identification and Oxidation Analysis of Walnut Globulin
-
摘要: 为揭示核桃球蛋白主要组成及体外抗氧化活性，以脱脂核桃粕为原料，对其中的球蛋白进行分离纯化并通过2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）阳离子自由基清除能力对其抗氧化能力进行评价，即经进一步脱脂后，根据Osborne分级法提取得到核桃球蛋白粗提物，再通过HiTrapTM CaptoTM Q阴离子交换柱和SephacrylTM S 100HR凝胶过滤柱两步分离纯化，得到主要蛋白组分。结果表明，制备的球蛋白蛋白含量为51.53%，占核桃总蛋白的15.3%，等电点为3.8。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，纯化得到主要蛋白组分分子量为10.1 kDa。经高效液相色谱-质谱联用分析表明，该主要蛋白组分在活性状态下由一种7S球蛋白vicilin Car i 2.0101和2S清蛋白组成。研究发现，球蛋白粗提物和纯化蛋白组分均对ABTS+自由基有较好的清除能力，其IC50值分别为0.302和0.075 mg/mL，表明纯化蛋白组分的清除能力提高了4倍以上。研究结果可为核桃球蛋白开发利用提供理论基础。Abstract: In order to reveal the main composition of walnut globulin and its antioxidant activity in vitro, defatted walnut meal was used as raw material to separate and purify the globulin. And 2,2'-azido-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS) cationic radical scavenging ability was used to evaluate its antioxidant capacity, after further defatting, the crude walnut globulin extract was extracted according to the Osborne fractionation method, and then the main protein components were separated and purified by HiTrapTM CaptoTM Q anion exchange column and SephacrylTM S 100HR gel filtration column. The results showed that the prepared globulin protein content was 51.53%, accounting for 15.3% of the walnut protein, and the isoelectric point was 3.8. The results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis showed that the molecular weight of the purified main protein component was 10.1 kDa. The major protein component in the active state consists of a 7S globulin vicilin Car i 2.0101 and 2S albumin. It was found that both crude globulin extract and purified protein component had good scavenging ability against ABTS+·, with IC50 values of 0.302 and 0.075 mg/mL, respectively, indicating that the scavenging ability of purified protein component was increased by more than 4 times. The research results could provide a theoretical basis for the development and utilization of walnut globulin.
-
Keywords:
- walnut /
- globulin /
- extract /
- isolation and purification /
- identification /
- antioxidant activity
-
核桃（Juglans regia L.）属斗科目胡桃科胡桃属植物,是世界四大坚果之一[1]。我国核桃栽培历史悠久，种植面积及总产量已远超美国[2]，截至2018年底，我国核桃种植面积为816.57万m2，核桃年产量383万t[3]。核桃仁营养价值很高，其蛋白质含量达15%~20%[4]，核桃经压榨制油后会产生大量的饼粕，其蛋白质含量更是可达50%，是一种优质的蛋白质资源[5]。然而，目前核桃粕大多只被用作动物饲料、植物肥料，甚至直接丢弃，其附加值利用率较低[6]。因此，如何研究开发核桃粕蛋白的应用价值对实现核桃粕的综合利用、提高其附加值具有重要意义。
国内外对核桃蛋白的研究集中在蛋白的提取、理化性质及其活性多肽方面的研究[7-10]。根据溶解性的不同，核桃蛋白可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中，清蛋白和球蛋白的溶解性最佳，其中清蛋白的溶解度61.23%[11]、球蛋白的溶解度可达近25%[12]，目前相关研究也最多。清蛋白约占核桃总蛋白6.81%[13]，它也是核桃蛋白研究热点的最主要对象，包括清蛋白的提取、酶解制备多肽的工艺条件以及清蛋白和酶解肽生物活性的探究等[14-15]。相比之下，球蛋白的含量更高，约占17.57%[16]，但针对球蛋白的科学研究却较少。现有研究中，关于球蛋白的报道主要集中在蛋白提取、功能特性和过敏性测定等方面[17-18]，韩海涛等[19]利用Osborne法制备冷榨核桃球蛋白，并对其功能性质进行研究。Blankestijn等[20]纯化得到核桃11S 球蛋白Jug r4，并对其进行SDS-PAGE印迹分析，以鉴定其是否为核桃过敏原蛋白；Downs等[21]鉴定和表征了来自核桃7S 种子储存球蛋白原蛋白N 末端区域的一系列肽，表明成熟的7S球蛋白和新表征的7S球蛋白N端肽是两种不同类型的过敏原。而对球蛋白的组成信息、生物活性的探究等方面的研究却很少，这一定程度上限制了它的开发与应用。
本研究即以榨油后核桃粕为对象，提取其中球蛋白组分，通过纯化获得球蛋白主要组分，进一步探究球蛋白及其纯组分的功能活性，以期为脱脂核桃粕的深度开发以及核桃蛋白的研究提供基础数据和参考，具有积极的现实意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
核桃粕（北方香玲核桃） 由河北养元智汇饮品股份有限公司提供；乙腈（质谱级）、二硫苏糖醇、碘乙酰胺（分析纯） Fisher Chemical公司；测序级胰蛋白酶（酶活力14742 U/mg） Promega公司；HiTrapTM CaptoTM Q、SephacrylTM S-100 High Resolution柱料 美国GE公司；丙烯酰胺（纯度≥99.9%）、甲叉双丙烯酰胺（纯度≥98%） 北京拜尔迪生物技术有限公司；ABTS（纯度≥98%） 北京博奥拓达科技有限公司。
Ultimate 3000毛细管高效液相色谱仪、Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer电喷雾-组合型离子阱、Orbitrap质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Allegra X-30R型高速冷冻离心机 美国贝克曼公司；Alpha 2-4 LD Plus型冷冻干燥机 德国Christ公司；INFINITE Spark 10M型多功能酶标仪 瑞士TECAN公司；Cary 60型紫外可见分光光度仪 Agilent公司；BS-100A型自动部分收集器、BT-100型恒流泵、TH-500梯度混合器 上海泸西分析仪器厂有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理
核桃粕经粉碎后过80目筛，在4 ℃条件下，用正己烷（m脱脂核桃粕:V溶剂=5:1）处理1 h后抽滤得到滤饼，滤饼用正己烷再次处理，直至滤液呈无色为止，收集滤饼，于通风橱中挥干剩余溶剂，在4 ℃贮存[22]。
1.2.2 核桃球蛋白提取
球蛋白根据改进的Osborne法[23]制备：将脱脂粉与蒸馏水按1:10（w/v）的比例混合，然后在恒温水浴摇床中保温振荡，离心弃上清液。对沉淀进行两次上述操作，收集沉淀加入一定体积1 mol/L NaCl溶液，充分混匀，在37 ℃保温振荡提取1 h后，4 ℃、8000 r/min离心30 min取上清液，再重复提取2次。收集上清液于4 ℃条件下用滤纸滤去不溶物后用蒸馏水透析，冷冻干燥获得球蛋白粗提物。蛋白含量依据GB 5009.5-2016[24]测定, 氮换算为蛋白质的系数为6.25[18]。球蛋白提取率，公式（1）：
蛋白质提取率(%)=提取液蛋白含量×提取液体积脱脂粉的蛋白含量×脱脂粉的取样量×100 (1) 1.2.3 球蛋白等电点测定
参照李婷等[25]的方法进行改进，取4 mL核桃球蛋白提取液6份，初步调节pH分别为3、4、5、6、7、8，静置后10000 r/min离心5 min，在280 nm下测定上清液吸光度。根据上述结果，参考訾艳等[26]的方法，再在吸光度最低时的pH附近均衡选择5个点，间隔为0.2，重新准备5份蛋白提取液，按此条件分别调节每管的pH。静置后10000 r/min离心5 min，测定上清液中蛋白质含量，蛋白含量测定采用BCA试剂盒法，蛋白含量最低点对应的pH即为球蛋白的等电点。
1.2.4 球蛋白纯化
1.2.4.1 HiTrapTM CaptoTM Q离子交换层析
采用HiTrapTM CaptoTM Q作为固定相，纯化的色谱条件为：先用平衡缓冲液（25 mmol/L pH8.5的Tris-HCl溶液）平衡离子交换柱后，步骤1.2.2提取得到球蛋白粗提物用平衡缓冲液溶解，经4 ℃、8000 r/min离心5 min后取上清液，上清液过0.45 µm滤膜后上柱，再用初始浓度0 mol/L、最高浓度2 mol/L氯化钠的25 mmol/L pH8.5的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，1 mL/管分管收集。收集后测定每管溶液的A280 nm值，绘制洗脱曲线，分别将各峰收集后用SDS-PAGE电泳分析，然后分别于4 ℃截留分子质量为3500 Da的透析袋中透析72 h。透析完毕后收集蛋白溶液，于4 ℃条件下保存备用，以待进一步纯化。
1.2.4.2 SephacrylTM S 100HR凝胶过滤层析
用含有0.3 mol/L NaCl的PBS（50 mmol/L，pH7.4）平衡SephacrylTM S 100HR柱（1.6 cm×120 cm），上一步离子交换层析纯化得到峰1蛋白样品经过3 kDa滤膜超滤浓缩后过0.45 µm滤膜后上柱，再用相同的缓冲液进行洗脱，流速为1 mL/3 min，采用自动部份收集器收集洗脱液测定A280 nm值，绘制洗脱曲线。分别将各峰收集后用SDS-PAGE 电泳分析，收集得到各峰的蛋白溶液分别于4 ℃截留分子质量为3500 Da的透析袋中透析72 h后收集蛋白溶液，−80 ℃冷冻过夜后真空冷冻干燥，收集冻干粉于−20 ℃条件下保存备用。
1.2.5 蛋白表征
1.2.5.1 SDS-PAGE分析
制备12.5%分离胶、4.5%浓缩胶，电极缓冲液为0.025 mol/L Tris-HCl、0.1% SDS、0.192 mol/L甘氨酸的缓冲溶液。样品在浓缩胶中电压为80 V，进入分离胶之后将其增至110 V。电泳完毕后染色30 min，最后脱色至背景透明[27]。（Maker：鸡蛋清溶菌酶14.4 kDa、人生长素22.0 kDa、牛碳酸酐31.0 kDa、兔肌动蛋白43.0 kDa、牛血清白蛋白66.2 kDa、兔磷酸化酶97.4 kDa，标准蛋白的标准曲线为y=−1.1608x+2.0666，R2=0.9807）。
制备15.5%分离胶、10%夹层胶、4%浓缩胶，阳极缓冲液为pH8.9、2 mol/L Tris-HCl溶液、阴极缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCl、0.1% SDS、0.239 mol/L甘氨酸的缓冲溶液。样品在浓缩及夹层胶中电压为30 V，进入分离胶之后将其增至110 V。电泳完毕后考马斯亮蓝染色30 min，最后脱色至背景透明（Maker：3.3、5.8、7.8、14.4、20.1 kDa，标准蛋白的标准曲线为y=−1.8612x+2.4，R2=0.9574）。
1.2.5.2 Native-PAGE分析
1.2.4.2步骤中得到峰1蛋白用水溶解，然后与缓冲溶液按体积比为1:2混合，缓冲溶液中含有30%甘油、12.5%Tris-HC1（0.5 mol/L，pH6.8）和2%质量浓度为0.5%溴酚兰，充分混合后参照文献[28]方法进行Native-PAGE检测。
1.2.6 蛋白分析与鉴定
1.2.6.1 胰蛋白酶酶解
将Native-PAGE上的目的条带切成1 mm3的胶粒，分别装入1.5 mL塑料离心管中，加入含有50%乙腈-50% 50 mmol/L NH4HCO3的脱色液进行脱色，静置10~30 min后除去脱色液，重复此操作至胶粒无色。每管各加入100 μL纯乙腈溶液，放置30 min，待胶粒呈白色索至团状，弃去乙腈，室温放置干燥。然后每管各加入100 μL 10 mmol/L的DTT，于56 ℃水浴条件下还原1 h后，除去DTT，之后再按照100 μL/管的比例加入55 mmol/L的IAA，室温避光反应1 h，除去溶剂。之后再加脱色液（50%乙腈-50% 50 mmoL/L NH4HCO3）洗一遍，除去溶剂后，加入100 μL纯乙腈，放置30 min，待胶粒呈白色索至团状，弃去乙腈，室温放置干燥。用50 mmol/L NH4HCO3溶液配制得到浓度为0.22113 U/μL的酶液，按照7~10 μL/管的量加入酶液，于4 ℃条件下孵育40 min后取出，每管补加5~10 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液，密封于37 ℃水浴条件下反应16 h。然后每管加100 μL提取液（5%甲酸-50%乙腈-45%水，于37 ℃条件下水浴1 h后，超声5 min，离心5 min，将提取液移入另一新离心管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。酶切后的肽段使用自填脱盐柱脱盐，于45 ℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂备用以待下一步质谱检测[29]。
1.2.6.2 LC-MS/MS检测
将上述处理好的样品在流动相A（0.1%甲酸，2%乙腈/水）中溶解后使用自填脱盐柱脱盐，在线LC-MS/MS分析。LC-MS/MS过程参数设置为：
毛细管液相色谱分离条件：流动相A为含有体积分数0.1%甲酸，2%乙腈的超纯水，流动相B为含有体积分数0.1%甲酸，19.9%超纯水的乙腈溶液，预柱为packed with Acclaim PepMap RPLC C18（100 Å，5 μm，300 μm×5 mm），流速为600 nL/min。经过反复多次的试验，最终采用线性梯度洗脱程序为：开始0 min，4% B；0~2 min，4%~8% B；2~45 min，8%~28%；45~55 min，28%~40% B；55~56 min，45%~95% B；56~66 min，95% B。
质谱条件：一级质谱参数：Resolution：70000；AGCtarget：3e6；MaximumIT：40ms；Scanrange：300 to 1800 m/z；二级质谱参数：Resolution：17500；AGCtarget：1e5；MaximumIT：60ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：27[30]。
质谱原始文件使用Maxquant（1.6.2.10）分别检索目标蛋白数据库，检索参数如下：固定修饰：脲基（C）；可变修饰：氧化（M），乙酰基（Protein N-term）；酶：胰蛋白酶；肽段/碎片离子质量数：单同位素；显著性阈值：0.01。
1.2.7 核桃球蛋白抗氧化能力测定
ABTS法参考汪小玉等[31]的方法：先制备ABTS工作液，测定时将球蛋白和纯化得到蛋白主要组分加水制成质量浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 µg/mL的待溶液，吸取待测溶液各20 µL，置于96孔板中，每孔加入工作液200 µL，混匀，静置10 min，于734 nm波长处测定吸光度。以维生素C为阳性对照，按下式计算ABTS+自由基清除率，利用SPSS软件分别计算IC50（样品）、IC50（维生素C），并计算其抗坏血酸当量，用AEAC表示，ABTS+自由基清除率按式（2）进行计算，样品的抗坏血酸当量按式（3）进行计算：
自由基清除率(%)=(1−A−A0A1)×100 (2) 式中：A为样品溶液+ABTS的吸光度；A1为水+ABTS的吸光度；A0为样品溶液+水的吸光度。
AEAC=IC50(维生素C)IC50(样品)×100 (3) 式中：IC50（维生素C）为维生素C对ABTS阳离子自由基的半数抑制浓度，IC50（样品）为样品对ABTS阳离子自由基的半数抑制浓度。
1.3 数据处理
本实验所有数据均重复三次，结果用±标准差表示，数据利用Excel 2019、Origin来绘制图形，SPSS软件进行方差及显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 核桃球蛋白的提取制备
本研究以冷榨脱油后的核桃粕为原料，经二次脱脂处理后核桃粕的蛋白含量从39.90%提高至47.10%（表1）。韩海涛等[19]研究表明冷榨的“清香”核桃饼中蛋白含量为48.64%，脱脂后蛋白含量提高至60.05%，略高于本研究的结果，可能是因为原料存在差异和提取工艺的不同。
表 1 不同物质的蛋白含量Table 1. Protein contents of different substances样品 蛋白含量（%） 核桃粕 39.90±1.20 脱脂核桃粕 47.10±0.60 球蛋白粗提物 51.53±1.17 脱脂核桃粕进一步提取获得了球蛋白粗提物，其蛋白含量可达51.53%，占核桃总蛋白的15.3%，此结果与毛晓英等[32]研究新疆和田核桃的结果基本一致。而王晓飞等[18]制备得到蛋白含量为80.71%的球蛋白，高于本研究的结果，一方面可能是提取液种类不同；另一方面可能是考虑到硫酸铵盐析纯化蛋白时，蛋白溶液中引入硫酸铵不利于后续处理[33]，所以本研究在制备球蛋白时没有进行硫酸铵盐析这一操作步骤所致。
2.2 核桃球蛋白等电点测定结果
如图1所示，pH为4时，上清液吸光度最小，因此，初步确定核桃球蛋白等电点在4左右。继续研究pH4左右的核桃球蛋白等电点（图2），发现该蛋白在pH3.8时上清液中的蛋白含量最少，而随着pH低于或者高于3.8时蛋白含量又呈现明显的上升，这表明其等电点为pH3.8。核桃球蛋白的等电点与其他植物来源的球蛋白的等电点值相近，如花生粕[25]、米糠[34]、谷子[35]中球蛋白的等电点分别为4.6、4.0和3.6，他们也与大多数食品蛋白质一样属于典型的酸性蛋白质[36]，而对于核桃蛋白等电点的解析也是为后续该蛋白的纯化提供了基础数据。
![]()
图 1 不同pH下离心后上清液蛋白吸光度Figure 1. Protein absorbance of supernatant after centrifugation at different pH![]()
图 2 不同pH下离心后上清液蛋白含量Figure 2. Protein content of supernatant after centrifugation at different pH2.3 核桃球蛋白纯化结果
球蛋白粗提物先经离子交换层析色谱纯化，获得两部分蛋白分离物（图3），采SDS-PAGE分析各部分的蛋白条带分布情况（图4），其中峰1的分离效果更好，继续进行后续纯化。采用凝胶过滤层析进一步分离峰1中的蛋白，共得到2个峰（图5）。其中，首先收集到的蛋白经SDS-PAGE分析后证实为球蛋白中10.1 kDa大小的主要蛋白（图6），其纯度可达电泳级纯。再经Native-PAGE电泳分析该组分，它由两个活性蛋白条带组成，后续分别对两个蛋白条带进行蛋白鉴定。
![]()
图 3 脱脂核桃粕球蛋白离子交换层析Figure 3. Ion exchange chromatography of globulin from degreased walnut meal![]()
图 4 脱脂核桃粕球蛋白SDS-PAGE电泳图注：泳道1：球蛋白原样； 泳道2：纯化后的峰1的样品；泳道3：纯化后峰2的样品。Figure 4. SDS-PAGE electropherogram of defatted walnut meal globulin![]()
图 5 脱脂核桃粕球蛋白凝胶过滤层析Figure 5. Gel filtration chromatography of degreased walnut meal globulin![]()
图 6 球蛋白SDS-PAGE电泳（A）和纯化得到主要蛋白Native-PAGE（B）电泳分析注：A:泳道1：球蛋白原样；泳道2：纯化后的峰1的样品。Figure 6. Globulin SDS-PAGE electrophoresis (A) and purification of the main protein Native-PAGE (B) electrophoresis analysis脱脂核桃粕球蛋白粗提物由多种蛋白组成，其中含有2个主要条带（图6），其分子量分别为7.8和10.1 kDa（图6）。而Mao等[37]研究发现新疆核桃的球蛋白显示出九个条带，其中两个主要条带的分子量为20.1和35.0 kDa，这可能是由于核桃品种不同而造成的差异。
2.4 蛋白的质谱鉴定结果
2.4.1 条带1蛋白的鉴定结果
LC-MS/MS检测结果显示，Native-PAGE电泳图上的条带1蛋白经液相色谱分离后，在质谱中检测到的肽段数量与丰度较高（图7），共检测到145条肽段，其中的98条肽段均在其对应的蛋白质组中是唯一的。质谱采集结果经软件MaxQuant（1.6.2.10）数据库检索，得到鉴定蛋白的比对结果，仅列出得分较高的前5个蛋白比对结果（表2）。综合蛋白的得分和含量结果表明该蛋白为vicilin Car i 2.0101，属于7S种子储存蛋白家族，是一种7S球蛋白。这也与Regina等[38]报道的结果一致，其发现7S球蛋白通常由大量多肽组成，其分子质量范围在10~70 kDa，不存在二硫键。
表 2 条带1蛋白的鉴定结果Table 2. Identification results of band 1 protein登录号 蛋白 特征性肽段 序列覆盖率 （%） 分子量（kDa） 序列长度 匹配得分 含量 A0A2I4DYF1 vicilin Car i 2.0101 37 24.6 94.4 789 323.31 11418000000 P93198 2S albumin 9 54 16.373 139 323.31 6640100000 A0A2I4F3R2 barwin-like 1 6.8 20.455 192 323.31 116920000 A0A2I4F6R4 11S globulin-like 4 9.2 58.293 511 126.31 52859000 A0A2I4EG83 11S globulin seed storage protein 2-like 6 14.6 54.307 481 111.28 42719000 2.4.2 条带2蛋白的鉴定结果
LC-MS/MS检测结果显示，Native-PAGE电泳图上条带2蛋白经液相色谱分离后，在质谱中检测到的肽段数量与丰度较高（图8），共检测到177条肽段，其中的127条均在其对应的蛋白质组中是唯一的。质谱采集结果经过软件MaxQuant（1.6.2.10）数据库检索，得到鉴定蛋白的对比结果，仅列出得分较高的前5个蛋白对比结果（表3）。综合蛋白的得分和含量结果表明该蛋白为2S清蛋白。这也与Downs等[21]报道的结果一致，他们表明2S清蛋白是一类结构紧凑，半胱氨酸残基结构保守的低分子量蛋白，其分子质量范围在10~15 kDa之间。另有，Spiric等[39]从山核桃中提纯得到由5和12 kDa的主要条带及16 kDa蛋白条带共同组成的天然的2S清蛋白，与本研究得到的结果有所不同。本文通过Osborne法制得核桃球蛋白，在对其进行纯化后得到2S清蛋白，这与郭彦飞[40]报道结果不同，他们证明苦荞中属于2S清蛋白家族的16 kDa过敏原仅存于苦荞种子清蛋白中，推测这可能是由于采用此方法提取核桃清蛋白和球蛋白时，两种蛋白很难绝对分开，导致出现交叉的现象。
表 3 条带2蛋白的鉴定结果Table 3. Identification results of the band 2 protein登录号 蛋白 特征性肽段 序列覆盖率 （%） 分子量（kDa） 序列长度 匹配得分 含量 P93198 2S albumin 8 54 16.373 139 323.31 16864000000 A0A2I4DYF1 vicilin Car i 2.0101 27 25 94.4 789 323.31 8514700000 A0A2I4F6R4 11S globulin-like 5 11 58.293 511 323.31 545190000 Q2TPW5 11S globulin seed storage protein Jug r 4 7 15.6 58.144 507 323.31 443470000 A0A2I4GEH1 legumin B-like 15 30.8 55.855 490 273.45 2420900000 2.5 核桃球蛋白抗氧化效果
ABTS+被广泛应用于测定抗氧化剂的总抗氧化能力（图9，表4）。核桃球蛋白、球蛋白纯化得到主要蛋白组分蛋白以及维生素C对ABTS+自由基的清除能力均与其质量浓度呈正相关，其强弱依次为维生素C>纯化得到主要蛋白组分>核桃球蛋白，同浓度下球蛋白纯化得到蛋白组分对 ABTS +自由基的清除率显著高于核桃球蛋白。核桃球蛋白和球蛋白纯化得到主要蛋白组分的IC50值分别为0.302、0.075 mg/mL，两者之间存在显著性差异，后者IC50值仅为前者的1/4。同时球蛋白纯化得到主要蛋白组分的抗氧化能力弱于对照品维生素C，但与之相比也是具有较好的清除ABTS+自由基的能力。本试验的结果表明，球蛋白及从球蛋白中纯化得到主要蛋白组分均具有较高的总抗氧化能力，可以利用这一性质，将其添加到肉汤、火腿等食品中，提高产品的货架期[41]。
![]()
图 9 不同质量浓度蛋白对ABTS+自由基的清除率Figure 9. Scavenging rate of ABTS+ free radicals by protein at different mass concentrations表 4 不同蛋白对ABTS+自由基的IC50、AEACTable 4. IC50, AEAC of different proteins to ABTS+ free radicals组别 IC50（µg/mL） AEAC（g/100 g） 核桃球蛋白 302.425±16.244a 3.987±0.126b 纯化得到主要蛋白组分 74.950±2.134b 16.066±0.123a 抗坏血酸组 12.040±0.275c 注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。 3. 结论
本文以改进的Osborne法制备脱脂核桃粕球蛋白粗提物，球蛋白粗提物蛋白含量达51.53%，占核桃总蛋白的15.3%，其等电点为3.8；经离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化获得大小为10.1 kDa的球蛋白；该蛋白在活性状态下呈现出两条条带，经HPLC-MS分析表明条带1为vicilin Car i 2.0101，是一种7S球蛋白，条带2为2S清蛋白。研究发现，核桃球蛋白粗提物和纯化的球蛋白均具有良好的抗氧化能力，而纯化后球蛋白的抗氧化效果是粗提蛋白的4倍，其IC50值可低至0.075 mg/mL。通过以上研究，可为深入了解与开发核桃球蛋白组分与功能提供一定的理论基础。
-
![]()
图 1 不同pH下离心后上清液蛋白吸光度
Figure 1. Protein absorbance of supernatant after centrifugation at different pH
![]()
图 2 不同pH下离心后上清液蛋白含量
Figure 2. Protein content of supernatant after centrifugation at different pH
![]()
图 3 脱脂核桃粕球蛋白离子交换层析
Figure 3. Ion exchange chromatography of globulin from degreased walnut meal
![]()
图 4 脱脂核桃粕球蛋白SDS-PAGE电泳图
注：泳道1：球蛋白原样； 泳道2：纯化后的峰1的样品；泳道3：纯化后峰2的样品。
Figure 4. SDS-PAGE electropherogram of defatted walnut meal globulin
![]()
图 5 脱脂核桃粕球蛋白凝胶过滤层析
Figure 5. Gel filtration chromatography of degreased walnut meal globulin
![]()
图 6 球蛋白SDS-PAGE电泳（A）和纯化得到主要蛋白Native-PAGE（B）电泳分析
注：A:泳道1：球蛋白原样；泳道2：纯化后的峰1的样品。
Figure 6. Globulin SDS-PAGE electrophoresis (A) and purification of the main protein Native-PAGE (B) electrophoresis analysis
![]()
图 9 不同质量浓度蛋白对ABTS+自由基的清除率
Figure 9. Scavenging rate of ABTS+ free radicals by protein at different mass concentrations
表 1 不同物质的蛋白含量
Table 1 Protein contents of different substances
样品 蛋白含量（%） 核桃粕 39.90±1.20 脱脂核桃粕 47.10±0.60 球蛋白粗提物 51.53±1.17 
下载: 导出CSV
表 2 条带1蛋白的鉴定结果
Table 2 Identification results of band 1 protein
登录号 蛋白 特征性肽段 序列覆盖率 （%） 分子量（kDa） 序列长度 匹配得分 含量 A0A2I4DYF1 vicilin Car i 2.0101 37 24.6 94.4 789 323.31 11418000000 P93198 2S albumin 9 54 16.373 139 323.31 6640100000 A0A2I4F3R2 barwin-like 1 6.8 20.455 192 323.31 116920000 A0A2I4F6R4 11S globulin-like 4 9.2 58.293 511 126.31 52859000 A0A2I4EG83 11S globulin seed storage protein 2-like 6 14.6 54.307 481 111.28 42719000
下载: 导出CSV
表 3 条带2蛋白的鉴定结果
Table 3 Identification results of the band 2 protein
登录号 蛋白 特征性肽段 序列覆盖率 （%） 分子量（kDa） 序列长度 匹配得分 含量 P93198 2S albumin 8 54 16.373 139 323.31 16864000000 A0A2I4DYF1 vicilin Car i 2.0101 27 25 94.4 789 323.31 8514700000 A0A2I4F6R4 11S globulin-like 5 11 58.293 511 323.31 545190000 Q2TPW5 11S globulin seed storage protein Jug r 4 7 15.6 58.144 507 323.31 443470000 A0A2I4GEH1 legumin B-like 15 30.8 55.855 490 273.45 2420900000
下载: 导出CSV
表 4 不同蛋白对ABTS+自由基的IC50、AEAC
Table 4 IC50, AEAC of different proteins to ABTS+ free radicals
组别 IC50（µg/mL） AEAC（g/100 g） 核桃球蛋白 302.425±16.244a 3.987±0.126b 纯化得到主要蛋白组分 74.950±2.134b 16.066±0.123a 抗坏血酸组 12.040±0.275c 注：同列不同字母表示差异显著（P<0.05）。
下载: 导出CSV
-
[1] 刘瑞, 谢辰阳, 吴水霞, 等. 核桃青皮不同极性酚类物质组成分析[J]. 食品科学技术学报,2019,37(6):88−93. [LIU R, XIE C Y, WU S X, et al. Composition analysis of different polar phenols in walnut green peel[J]. Journal of Food Science and Technology,2019,37(6):88−93. doi: 10.3969/j.issn.2095-6002.2019.06.012 LIU R, XIE C Y, WU S X, et al. Composition analysis of different polar phenols in walnut green peel[J]. Journal of Food Science and Technology, 2019, 37(6): 88-93. doi: 10.3969/j.issn.2095-6002.2019.06.012
[2] 柳青, 陈晓琪, 马长路, 等. 响应面法优化低糖核桃营养派制作工艺研究[J]. 保鲜与加工,2021,21(5):81−90. [LIU Q, CHEN X Q, MA C L, et al. Optimization of processing technology of low-sugar walnut nutritional pie by response surface methodology[J]. Preservation and Processing,2021,21(5):81−90. LIU Q, CHEN X Q, MA C L, et al. Optimization of processing technology of low-sugar walnut nutritional pie by response surface methodology[J]. Preservation and Processing, 2021, 21(5): 81-90.
[3] 荣瑞芬, 齐琳, 苏晨, 等. 核桃多糖研究进展[J]. 食品科学技术学报,2021,39(3):11−21. [RONG R F, QI L, SU C, et al. Research progress of walnut polysaccharide[J]. Journal of Food Science and Technology,2021,39(3):11−21. doi: 10.12301/j.issn.2095-6002.2021.03.002 RONG R F, QI L, SU C, et al. Research progress of walnut polysaccharide[J]. Journal of Food Science and Technology, 2021, 39(3): 11-21. doi: 10.12301/j.issn.2095-6002.2021.03.002
[4] 王文倩, 王晗琦, 陈文, 等. 不同干燥方法对核桃品质及不饱和脂肪酸稳定性的影响[J]. 食品科学技术学报,2015,33(1):59−64. [WANG W Q, WANG H Q, CHEN W, et al. Effects of different drying methods on walnut quality and stability of unsaturated fatty acids[J]. Journal of Food Science and Technology,2015,33(1):59−64. WANG W Q, WANG H Q, CHEN W, et al. Effects of different drying methods on walnut quality and stability of unsaturated fatty acids[J]. Journal of Food Science and Technology, 2015, 33(1): 59-64.
[5] 单春兰, 耿树香, 缪福俊, 等. 核桃蛋白多肽对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用[J]. 中国油脂,2021,46(4):33−37. [SHAN C L, GENG S X, MIAO F J, et al. Protective effect of walnut protein polypeptide on lipopolysaccharide induced acute liver injury in mice[J]. China Oils and Fats,2021,46(4):33−37. doi: 10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.2021.04.007 SHAN C L, GENG S X, MIAO F J, et al. Protective effect of walnut protein polypeptide on lipopolysaccharide induced acute liver injury in mice[J]. China Oils and Fats, 2021, 46(4): 33-37. doi: 10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.2021.04.007
[6] 李明娟, 张雅媛, 游向荣, 等. 低温喷雾干燥技术制备核桃粕蛋白粉的工艺条件优化[J]. 食品工业,2021,42(1):156−161. [LI M J, ZHANG Y Y, YOU X R, et al. Optimization of process conditions for preparation of walnut meal protein powder by low-temperature spray drying[J]. Food Industry,2021,42(1):156−161. LI M J, ZHANG Y Y, YOU X R, et al. Optimization of process conditions for preparation of walnut meal protein powder by low-temperature spray drying[J]. Food Industry, 2021, 42(1): 156-161.
[7] 豁银强, 刘传菊, 聂荣祖, 等. 核桃蛋白的组成、制备及特性研究进展[J]. 中国粮油学报,2020,35(12):191−197. [HUO Y Q, LIU C J, NIE R Z, et al. Research progress in the composition, preparation and properties of walnut protein[J]. Journal of the China Cereals and Oils Society,2020,35(12):191−197. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2020.12.030 HUO Y Q, LIU C J, NIE R Z, et al. Research progress in the composition, preparation and properties of walnut protein[J]. Journal of the China Cereals and Oils Society, 2020, 35(12): 191-197. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2020.12.030
[8] 周迎春, 姜太玲, 李月仙, 等. 蛋白质酶水解物的功能特性及其生物活性的研究进展[J]. 农产品加工,2018(3):42−46. [ZHOU Y C, JIANG T L, LI Y X, et al. Research progress on functional properties and biological activities of protease hydrolysates[J]. Agricultural Products Processing,2018(3):42−46. doi: 10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2018.02.012 [ZHOU Y C, JIANG T L, LI Y X, et al. Research progress on functional properties and biological activities of protease hydrolysates[J]. Agricultural products processing, 2018(3): 42-46. doi: 10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2018.02.012
[9] 缪福俊, 宁德鲁. 核桃多肽生物活性研究进展[J]. 中国油脂,2021,46(3):48−51. [MIAO F J, NING D L. Walnut polypeptide biological activity research progress[J]. Journal of China Oil and Fats,2021,46(3):48−51. doi: 10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.2021.03.010 [MIAO F J, NING D L. Walnut polypeptide biological activity research progress[J]. Journal of China oil and fats, 2021, 46(3): 48-51. doi: 10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.2021.03.010
[10] 李京京, 刘春雷, 闵伟红, 等. 利用Shotgun蛋白组学策略分析长白山核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)蛋白[J]. 现代食品科技,2015,31(9):256−262. [LI J J, LIU C L, MIN W H, et al. Shotgun proteomics strategy for protein analysis of Juglans mandshurica Maxim[J]. Modern Food Science and Technology,2015,31(9):256−262. LI J J, LIU C L, MIN W H, et al. Shotgun proteomics strategy for protein analysis of Juglans mandshurica Maxim[J]. Modern Food Science and Technology, 2015, 31(9): 256-262.
[11] 金子纯. 核桃粕蛋白质组分的理化性质、抗氧化性质及ACE抑制率的研究[D]. 西安: 陕西师范大学, 2017. JIN Z C. Study on physicochemical properties, antioxidant properties and ACE inhibition rate of walnut meal protein components[D]. Xi'an: Shaanxi Normal University, 2017.
[12] LV S Y, AHMED T, HU H, et al. Effects of ultrasonic-assisted extraction on the physicochemical properties of different walnut proteins[J]. Molecules,2019,24(23):4260−4260. doi: 10.3390/molecules24234260
[13] 李俊南, 习学良, 熊新武, 等. 核桃的营养保健功能及功能成分研究进展[J]. 中国食物与营养,2018,24(5):60−64. [LI J N, XI X L, XIONG X W, et al. Research progress on nutritional and health functions and functional components of walnut[J]. Food and Nutrition in China,2018,24(5):60−64. doi: 10.3969/j.issn.1006-9577.2018.05.013 LI J N, XI X L, XIONG X W, et al. Research progress on nutritional and health functions and functional components of walnut[J]. Food and Nutrition in China, 2018, 24(5): 60-64. doi: 10.3969/j.issn.1006-9577.2018.05.013
[14] 邱娟. 核桃清蛋白抗氧化肽对力竭运动小鼠抗疲劳和抗氧化能力的影响[J]. 基因组学与应用生物学,2020,39(5):2222−2229. [QIU J. Effects of walnut albumin antioxidant peptide on fatigue resistance and antioxidant capacity of exhausted exercise mice[J]. Genomics and Applied Biology,2020,39(5):2222−2229. doi: 10.13417/j.gab.039.002222 QIU J. Effects of walnut albumin antioxidant peptide on fatigue resistance and antioxidant capacity of exhausted exercise mice[J]. Genomics and applied biology, 2020, 39(5): 2222-2229. doi: 10.13417/j.gab.039.002222
[15] 刘威, 闵伟红, 刘春雷, 等. 核桃清蛋白抗氧化肽的制备及其活性研究[J]. 食品研究与开发,2017,38(17):40−44. [LIU W, MIN W H, LIU C L, et al. Preparation and activity of walnut albumin antioxidant peptide[J]. Food Research and Development,2017,38(17):40−44. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.010 LIU W, MIN W H, LIU C L, et al. Preparation and activity of walnut albumin antioxidant peptide[J]. Food Research and Development, 2017, 38(17): 40-44. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.010
[16] 姚奎章, 齐兵, 路敏, 等. 核桃乳酶解工艺及稳定性研究[J]. 现代食品科技,2016,32(8):259−264. [YAO K Z, QI B, LU M, et al. Study on enzymatic hydrolysis technology and stability of walnut milk[J]. Modern Food Science and Technology,2016,32(8):259−264. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.8.039 YAO K Z, QI B, LU M, et al. Study on enzymatic hydrolysis technology and stability of walnut milk[J]. Modern Food Science and Technology, 2016, 32(8): 259-264. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.8.039
[17] 邓欣伦, 赵强忠. 核桃蛋白及其组分构象和功能特性的研究[J]. 现代食品科技,2017,33(1):48−53,61. [DENG X L, ZHAO Q Z. Conformation of walnut protein and its components and features of research[J]. Journal of Modern Food Science and Technology,2017,33(1):48−53,61. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.1.008 DENG X L, ZHAO Q Z. Conformation of walnut protein and its components and features of research[J]. Journal of modern food science and technology, 2017, 33(01): 48-53, 61. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.1.008
[18] 王晓飞, 闵伟红, 朱运明, 等, 刘景圣. 长白山核桃球蛋白的提取、分离纯化及其功能性质研究[J]. 现代食品科技,2015,31(4):234−241. [WANG X F, MIN W H, ZHU Y M, et al. Extraction, purification and functional properties of walnut globulin from Chang bai[J]. Modern Food Science and Technology,2015,31(4):234−241. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.4.038 WANG X F, MIN W H, ZHU Y M, et al. Extraction, purification and functional properties of walnut globulin from Chang bai[J]. Modern food science and technology, 2015, 31(4): 234-241. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.4.038
[19] 韩海涛, 宴正明, 张润光, 等. 核桃蛋白组分的营养价值、功能特性及抗氧化性研究[J]. 中国油脂,2019,44(4):29−34. [HAN H T, YAN Z M, ZHANG R G, et al. Studies on nutritional value, functional properties and antioxidant activity of walnut protein components[J]. China Oils and Fats,2019,44(4):29−34. doi: 10.3969/j.issn.1003-7969.2019.04.008 HAN H T, YAN Z M, ZHANG R G, et al. Studies on nutritional value, functional properties and antioxidant activity of walnut protein components[J]. China Oils and Fats, 2019, 44(4): 29-34. doi: 10.3969/j.issn.1003-7969.2019.04.008
[20] BLANKESTIJN M A, DEN H J C F, MARTY B W, et al. A subset of walnut allergic adults is sensitized to walnut 11S globulin Jug r 4[J]. Clinical & Experimental Allergy,2018:48.
[21] DOWNS M L, SEMIC-JUSUFAGIC A, SIMPSON A, et al. Characterization of low molecular weight allergens from English walnut (Juglans regia L.)[J]. J Agric Food Chem, 2014, 62(48): 11767-11775.
[22] 王耀松, 张唯唯, 马天怡, 等. 丙二醛氧化对核桃分离蛋白结构及乳化性的影响[J]. 中国农业科学,2020,53(16):3372−3384. [WANG Y S, ZHANG W W, MA T Y, et al. Effects of malondialdehyde oxidation on structure and emulsification of walnut protein isolate[J]. Scientia Agricultura Sinica,2020,53(16):3372−3384. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.16.014 WANG Y S, ZHANG W W, MA T Y, et al. Effects of malondialdehyde oxidation on structure and emulsification of walnut protein isolate[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(16): 3372-3384. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.16.014
[23] 任娇艳, 史传超, 常博, 等. 核桃蛋白的分离制备及其酶解物的抗氧化特性[J]. 现代食品科技,2019,35(3):118−124. [REN J Y, SHI C C, CHANG B, et al. Isolation and preparation of walnut protein and antioxidant properties of its enzymatic hydrolysates[J]. Modern Food Science and Technology,2019,35(3):118−124. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.3.019 REN J Y, SHI C C, CHANG B, et al. Isolation and preparation of walnut protein and antioxidant properties of its enzymatic hydrolysates[J]. Modern food science and technology, 2019, 35(3): 118-124. doi: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.3.019
[24] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2016: 3. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. GB 5009.5-2016 National standard for food safety Determination of protein in food [S]. Beijing: Standards Press of China, 2016: 3
[25] 李婷, 任虹, 王丹丹, 等. 4种花生粕蛋白的理化性质及功能特性研究[J]. 中国粮油学报,2016,31(11):37−42. [LI T, REN H, WANG D D, et al. Study on physical and chemical properties and functional properties of four peanut meal proteins[J]. Journal of the China Cereals and Oils Society,2016,31(11):37−42. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2016.11.007 LI T, REN H, WANG D D, et al. Study on physical and chemical properties and functional properties of four peanut meal proteins[J]. Journal of the China Cereals and Oils Society, 2016, 31(11): 37-42. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2016.11.007
[26] 訾艳, 王常青, 陈晓萌, 等. 白芸豆清蛋白提取工艺及分子组成研究[J]. 食品工业科技,2014,35(15):121−123,129. [Zi Y, Wang C Q, Chen X M, et al. Study on extraction technology and molecular composition of albumin from white kidney bean[J]. Food Industry Science and Technology,2014,35(15):121−123,129. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2014.15.016 Zi Y, Wang C Q, Chen X M, et al. Study on extraction technology and molecular composition of albumin from white kidney bean[J]. Food industry science and technology, 2014, 35(15): 121-123, 129. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2014.15.016
[27] 李述刚, 陆健康, 王萍, 等. 新疆莎车1号扁桃仁2S-清蛋白的纯化及特性研究[J]. 食品科学,2017,38(17):36−41. [LI S G, LU J K, WANG P, et al. Study on purification and characteristics of 2S-albumin from Xin jiang Sha che 1 almond seed[J]. Food Science,2017,38(17):36−41. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201717007 LI S G, LU J K, WANG P, et al. Study on purification and characteristics of 2S-albumin from Xin jiang Sha che 1 almond seed[J]. Food Science, 2017, 38(17): 36-41. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201717007
[28] MICHAEL J T, ASFARUL S H, KHANH H B, et al. X-Ray Crystallography and electron microscopy of cross- and multi-module nonribosomal peptide synthetase proteins reveal a flexible architecture[J]. Structure,2017,25(5):783−793. doi: 10.1016/j.str.2017.03.014
[29] 陶醉, 徐丽, 谢岚, 等. 米糠蛋白糖基化与非酶褐变机理的研究[J]. 中国粮油学报,2021,36(7):20−25. [TAO Z, XU L, XIE L, et al. Mechanism of glycosylation and non-enzymatic browning of rice bran protein[J]. China Cereals and Oils Journal,2021,36(7):20−25. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2021.07.006 TAO Z, XU L, XIE L, et al. Mechanism of glycosylation and non-enzymatic browning of rice bran protein[J]. China Cereals and Oils Journal, 2021, 36(7): 20-25. doi: 10.3969/j.issn.1003-0174.2021.07.006
[30] 李莹莹, 张颖颖, 任南, 等. 液相色谱-串联质谱法测定牛排产品中大豆蛋白含量[J]. 食品科学,2020,41(10):297−303. [LI Y Y, ZHANG Y Y, REN N, et al. Determination of soybean protein content in steak products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science,2020,41(10):297−303. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20191013-105 LI Y Y, ZHANG Y Y, REN N, et al. Determination of soybean protein content in steak products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2020, 41(10): 297-303. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20191013-105
[31] 汪小玉, 李婷, 税丕先, 等. 仙茅总黄酮提取纯化工艺及其抗氧化、抗肿瘤活性[J]. 中成药,2022,44(3):907−912. [WANG X Y, LI T, SHUI P X, et al. Extraction and purification technology of total flavonoids from cyperaceae and its antioxidant and anti-tumor activities[J]. Chinese Patent Medicine,2022,44(3):907−912. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2022.03.040 WANG X Y, LI T, SHUI P X, et al. Extraction and purification technology of total flavonoids from cyperaceae and its antioxidant and anti-tumor activities[J]. Chinese Patent Medicine, 2022, 44(3): 907-912. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2022.03.040
[32] 毛晓英, 朱新荣, 万银松, 等. 核桃蛋白的组成分析及分离提取工艺的优化[J]. 中国食品学报,2019,19(3):195−205. [MAO X Y, ZHU X R, WAN Y S, et al. Composition analysis of walnut protein and optimization of separation and extraction process[J]. Chinese Journal of Food Science,2019,19(3):195−205. doi: 10.16429/j.1009-7848.2019.03.026 MAO X Y, ZHU X R, WAN Y S, et al. Composition analysis of walnut protein and optimization of separation and extraction process[J]. Chinese journal of food science, 2019, 19(3): 195-205. doi: 10.16429/j.1009-7848.2019.03.026
[33] 姜国庆, 闫秋丽, 李东, 等. 螺旋藻中藻蓝蛋白提取、纯化及稳态化研究进展[J]. 食品安全质量检测学报,2021,12(6):2332−2338. [JIANG G Q, YAN Q L, LI D, et al. Spirulina algae in blue protein extraction, purification and steady state research progress[J]. Journal of Food Safety and Quality Testing,2021,12(6):2332−2338. doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.06.042 JIANG G Q, YAN Q L, LI D, et al. Spirulina algae in blue protein extraction, purification and steady state research progress[J]. Journal of food safety and quality testing, 2021, 12 (6): 2332-2338. doi: 10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.06.042
[34] 张敏, 周梅, 王长远. 米糠4种蛋白质的提取与功能性质[J]. 食品科学,2013,34(1):18−21. [ZHANG M, ZHOU M, WANG C Y. Extraction and functional properties of four proteins from rice bran[J]. Food Science,2013,34(1):18−21. ZHANG M, ZHOU M, WANG C Y. Extraction and functional properties of four proteins from rice bran[J]. Food science, 2013, 34(1): 18-21.
[35] 刘敬科, 张玉宗, 刘莹莹, 等. 谷子蛋白组分分析研究[J]. 食品与机械,2014,30(6):39−42. [LIU J K, ZHANG Y Z, LIU Y Y, et al. Millet protein component analysis[J]. Journal of Food and Machinery,2014,30(6):39−42. doi: 10.13652/j.issn.1003-5788.2014.06.010 LIU J K, ZHANG Y Z, LIU Y Y, et al. Millet protein component analysis[J]. Journal of Food and Machinery, 2014, 30(6): 39-42. doi: 10.13652/j.issn.1003-5788.2014.06.010
[36] 朱科学, 周音卉, 周惠明. 小麦胚芽球蛋白的提取及功能性质研究[J]. 中国粮油学报,2008(5):19−23. [ZHU K X, ZHOU Y H, ZHOU H M. Extraction and functional properties of wheat germ globulin[J]. Journal of Chinese Cereals and Oils,2008(5):19−23. ZHU K X, ZHOU Y H, ZHOU H M. Extraction and functional properties of wheat germ globulin[J]. Journal of Chinese Cereals and Oils, 2008(5): 19-23.
[37] MAO X Y, HUA Y F, CHEN G G. Amino acid composition, molecular weight distribution and gel electrophoresis of walnut (Juglans regia L.) proteins and protein fractionations[J]. International Journal of Molecular Sciences,2014,15(2):2003−2014. doi: 10.3390/ijms15022003
[38] FREITAS R L, FERREIRA R B, TEIXEIRA A R. Use of a single method in the extraction of the seed storage globulins from several legume species. Application to analyse structural comparisons within the major classes of globulins[J]. International Journal of Food Sciences & Nutrition,2000,51(5):341−352.
[39] SPIRIC J, KOPPELMAN S J, KNULST A, et al. In vitro digestion and characterisation of 2S albumin and digestion-resistant peptides in pecan[J]. International Journal of Food Science & Technology,2018,53(6):1566−1578.
[40] 郭彦飞. 苦荞16 kDa主要过敏原的原核表达纯化、免疫活性分析及转化拟南芥研究[D]. 西安: 西北农林科技大学, 2011. GUO Y F. Prokaryotic expression and purification, immune activity analysis and transformation of Tartary buckwheat 16 kDa major allergens in arabidopsis thaliana [D]. Xi'an: Northwest A&F University, 2011.
[41] 郭帅, 李艳. 脱脂椰麸谷蛋白-1抗氧化性的研究[J]. 食品研究与开发,2018,39(15):18−22. [GUO S, LI Y. Study on antioxidant activity of fat-free coco-bran gluten-1[J]. Food Research and Development,2018,39(15):18−22. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2018.15.004 GUO S, LI Y. Study on antioxidant activity of fat-free coco-bran gluten-1[J]. Food research and development, 2018, 39(15): 18-22. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2018.15.004
-
期刊类型引用(5)
1. 马慧，顾雪敏，梅洁，李芳，王佳利，王梓棚，孔令明. 核桃谷蛋白抗菌肽的分离纯化及抑菌稳定性分析. 食品科学. 2024(07): 69-77 . 
百度学术
2. 薛建娥，王英翰，洪金明，尹志，王奕凡，白建. 响应面优化核桃蛋白的提取及性质研究. 食品工业. 2024(05): 49-54 . 百度学术
3. 马慧，梅洁，袁新超，袁新越，顾雪敏，孙欢，王梓棚，孔令明. 菌酶协同固态发酵核桃谷蛋白制备抑菌肽. 食品工业科技. 2024(12): 112-120 . 本站查看
4. 张永松，丁真真，陈辛杰，宋晶晶，夏娜. 反胶束提取扁桃仁蛋白工艺优化及理化特性比较. 现代食品科技. 2024(08): 252-262 . 百度学术
5. 李艳，程超霞，阚钰，霍新宇，冯晨，龙佩瑶，郑亚军，李琪. 银杏果仁球蛋白的提取工艺与功能特性研究. 中国粮油学报. 2024(12): 106-113 . 百度学术
其他类型引用(1)
下载:
计量
- 文章访问数: 243
- HTML全文浏览量: 119
- PDF下载量: 18
- 被引次数: 6
