Effect of the Mixture of Cationic Starch and Selenized Starch on the Catalytic Activity of Starch-based Biomimetic Glutathione Peroxidase
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摘要: 为了提升淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的催化活力，采用木薯淀粉（CS）制备的硒化淀粉（SCS）和阳离子淀粉（CCS）进行混合，获得含催化中心和底物识别位点的目标淀粉（SCS/CCS）。首先，采用辛烯基琥珀酸酐、硒氢化钠和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵分别对CS进行改性制备SCS和CCS；通过核磁共振波谱仪（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）、X射线衍射仪（XRD）、同步热分析仪（TG）和扫描电子显微镜（SEM）等手段对改性后的样品进行表征；最后以氮和硒物质的量比为变量，考察SCS与CCS的混合对GPx催化活力的影响。结果表明，与CS相比，硒含量为11.35 μg/g的SCS的1H NMR图谱在化学位移0.6~2.5之间出现了辛烯基琥珀酸酯分子链上质子的信号峰；SCS的FT-IR谱图与CS FT-IR谱图相似，但羟基（3300 cm−1）和结合水（1639 cm−1）特征峰的强度降低，表明SCS的合成过程消耗了CS骨架上的羟基，并提高了CS的疏水性；CCS的1H NMR图谱上3.22 ppm处出现季铵基的特征峰，同时，CCS的FT-IR谱图在1483 cm−1处出现了归因于季铵基C−N拉伸振动的特征峰，表明阳离子基团季铵基已成功修饰于CCS骨架上；与CS相比，SCS和CCS的颗粒形状无明显变化，但颗粒表面粗糙，表明改性反应主要发生在淀粉颗粒的表面；CS、SCS和CCS的XRD花样和失重曲线无明显差别，说明反应未显著影响淀粉的结晶结构和热稳定性。当SCS/CCS中氮和硒物质的量比为1200时，其在4-硝基苯硫酚+枯烯过氧化氢（NBT+CUOOH）、3-羧基-4硝基苯硫酚+氧化氢（TNB+H2O2）、NBT+CUOOH和NBT+H2O2反应体系中的GPx催化活力分别为13.94、11.25、12.91、10.87 µmol/min，比SCS分别提高了22.1%、25.8%、17.5%、19.6%。本研究为构建高催化活性的淀粉基仿生GPx提供了简单方法。Abstract: In order to promote the catalytic activity of starch-based biomimetic glutathione peroxidase (GPx), the selenized starch (SCS) and cationic starch (CCS) prepared from cassava starch (CS) were mixed, resulting in the targeted starch (SCS/CCS) with both the catalytic center and the recognition site of substrate. First, CS was modified with octenyl succinic anhydride and sodium selenide hydride, respectively, to prepare SCS. The CCS was synthesized by modifying CS with 3-chloro-2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride. Some technologies including nuclear magnetic resonance (1H NMR), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), X-ray diffraction (XRD), thermal analysis (TG) and scanning electron microscopy (SEM) were used to characterize the samples. Finally, the effect of the mixture of SCS and CCS on the catalytic activity of GPx was investigated by changing the molar ration of nitrogen and selenium. Results showed that the 1H NMR spectrum of SCS with selenium content of 11.35 μg/g revealed some new peaks (0.6~2.5 ppm) attributed to protons of the octenyl succinate compared with CS. In comparison to the FT-IR spectrum of CS, SCS showed lower intensities in the characteristic peaks of hydroxyl (3300 cm−1) and bound water (1639 cm−1), indicating the consumption of hydroxyl groups of CS in the synthesis of SCS. This would increase the hydrophobicity of the resultant starch. The appearances of the proton signal quaternary ammonium group (3.22 ppm) in the 1H NMR spectrum of CCS and the C−N stretching (1483 cm−1) in the FT-IR spectrum indicated the introduction of the positively charged quaternary ammonium group on the CCS backbone. With a similar particle size to the CS, SCS and CCS revealed a rough surface, indicating that the modification reaction mainly occurred on the surface of starch granules. No significant change was observed in the XRD patterns and TG curves of CS, SCS and CCS, indicating that the modified reaction did not dramatically affect the crystalline structure and thermal stability of starch. When the molar ratio of nitrogen and selenium in SCS/CCS was 1200, the catalytic activities of the biomimetic GPx in the reaction systems of 4-nitrothiophenol+cumene hydroperoxide (NBT+CUOOH), 3-carboxy-4-nitrothiophenol+hydrogen oxide (TNB+H2O2), NBT+CUOOH and NBT+H2O2 were 13.94, 11.25, 12.91 and 10.87 µmol/min, respectively, which were 22.1%, 25.8%, 17.5%, 19.6% higher than that of SCS, respectively. This study provided a simple method for constructing starch-based biomimetic GPx with high catalytic activity.
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Keywords:
- selenized starch /
- cationic starch /
- GPx /
- substrate recognition sites /
- catalytic mechanism
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硒是一种微量元素，硒及其化合物虽然都具有一定毒性，但是硒是动植物必需的营养元素[1-3]。硒在生命化学中的作用依赖于一个独特的官能团：硒醇基团（−SeH）[4]。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）以还原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）为底物，催化还原多种过氧化物，进而清除细胞组织中过量的脂质过氧化物和自由基，避免机体受过氧化物损伤[5-6]。这对于保持生物体正常的生理代谢起着重要的作用，通常将GPx活性作为衡量硒在人体内功能的指标。GPx对治疗和预防克山病、心血管病、炎症及癌症等疾病具有很重要的作用[7-8]。天然GPx是优秀的生物催化剂，在温和的条件下具有高效的催化特异性。然而，几乎所有的天然GPx都具有蛋白质固有的缺点，包括体外稳定差、来源有限、利用率低、成本高，难以回收和难再生等。近年来，天然GPx的独特催化性能激发了许多科学家推动仿生GPx模拟催化剂的开发[9]。仿生GPx的研究进展不仅促进了人们对催化机理的认识，也促进了具有潜在医药应用前景的仿生GPx的生产[10]。将硒或碲引入仿生GPx中已成为人工酶研究的热点。
淀粉作为可再生的天然高分子材料具有很大的开发前景，本文在前期研究了以木薯淀粉（Cassava Starch，CS）为骨架构建仿生GPx，辛烯基琥珀酸淀粉酯（Starch Octenyl Succinate ，OSA-starch）[11-14]与硒氢化钠（NaSeH）的亲核加成反应为所得硒化淀粉（Selenized Starch，SCS）提供了催化活性位点（−SeH）和疏水微环境，赋予SCS良好的抗氧化催化活性。同时在SCS上添加正电荷基团，能够有效地模拟识别位点，与催化中心有效配合能够富集底物，对催化活性具有提升作用，但在SCS上直接修饰阳离子基团所受到的影响因素比较多，很难保证催化中心和正电荷基团达到最佳配合，而且过多的阳离子改性会导致催化活性降低。合成制备具有正电荷基团的阳离子淀粉（Cationic Starch， CCS）[15-18]与SCS进行有效地混合，SCS提供的催化活性位点（−SeH）和疏水微环境与CCS的正电荷基团实现有效配合，可以提升SCS的催化活力。同时，阳离子淀粉的制备工艺比较成熟[15,19]，可以进行大规模的生产，因此本研究采用SCS与CCS混合构建类GPx的催化中心、疏水微环境、识别位点，通过类GPx的催化活性测试和催化机理分析，表明提升淀粉基仿生谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的催化活力，这些可以为淀粉基仿生GPx规模化生产应用提供了理论和技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
辛烯基琥珀酸酐、无水硫酸铜、硼酸、甲基红、芘 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、硫酸钾、氢氧化钠、硫酸、硝酸、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 西陇科学股份有限公司；硼氢化钠 国药集团化学试剂有限公司；硒粉 天津市大茂化学试剂厂；溴甲酚绿 成都市科隆化学品有限公司；4-硝基苯硫酚 英国Fluorochem公司；过氧化氢 成都金山化学试剂有限公司；高氯酸 福晨（天津）化学试剂有限公司；2,3-环氧丙基三甲基氯化铵 上海麦克林生化科技有限公司；以上试剂均为分析纯；氮气（99.99%） 广西瑞达化工科技有限公司；木薯淀粉（工业级） 广西农垦明阳生化集团有限公司；3-羧基-4-硝基苯硫酚（TNB） 根据Dong等[20]报道的方法自制。所有化学试剂无需进一步纯化即可使用。
PSB 50-72石墨消解器 Perkin-Elmer美国股份有限公司；AFS-9530原子荧光光度计 北京海光仪器有限公司；Perkin-Elmer Frontier傅里叶变换红外光谱仪 美国Perkin-Elmer股份有限公司；AVANCE III HD 500 MHz核磁共振波谱仪、D8 ADVANCE X射线衍射仪 德国布鲁克科技公司；Sigma HD扫描电子显微镜 德国蔡司股份公司；UV-2600紫外可见分光光度计 日本岛津公司；TG/DSC 1热分析仪 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；Agilent Cary Eclipse荧光分光光度计 美国安捷伦科技有限公司；Zetasizer Nano-ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 硒化木薯淀粉的制备
将135.2 mg硒粉（Se）和194.3 mg硼氢化钠（NaBH4）置于三口烧瓶中，通入氮气10 min除去体系中的空气，然后在氮气氛围下向烧瓶中加入20 mL无氧的去离子水。反应在室温条件下进行30 min，得到硒氢化钠（NaSeH）溶液。在氮气氛围和搅拌的条件下，将上述NaSeH溶液滴加到含有5.0 g OSA-starch（DS=0.012）和80 mL乙醇的250 mL烧瓶中。反应在40 ℃下保持6 h。然后在氮气氛围下用去离子水和75%乙醇交替洗涤产物，在55 ℃真空干燥24 h后，获得SCS[21]（图1）。
1.2.2 阳离子淀粉的制备
根据任红锐等[15]、冒爱荣等[19]的实验方法，将20.0 g木薯淀粉和100 mL异丙醇水溶液（30%，w/w）配制成乳液，加入1.0 g NaOH进行活化30 min，将4.0 g 2,3-环氧丙基三甲氯化铵（GTA，基于淀粉样品质量的25%）溶解于20 mL去离子水中，并缓慢滴加入淀粉乳液中，滴加完毕以后在40 ℃下搅拌进行反应6 h。反应结束后用HCl溶液（0.5 mol/L）逐滴加入直至反应液成中性，真空抽滤反应液，然后采用去离子水和75%乙醇交替洗涤产物，最后在55 ℃条件下烘干12 h，即可得到阳离子淀粉（CCS）样品（图2）。
1.2.3 核磁共振氢谱分析
CS、SCS和CCS的核磁共振氢谱（1H NMR）测试在核磁共振仪（Bruker AVANCE III HD 500 MHz）上进行，将干燥后的样品溶于重水（D2O）中，超声处理5 min，将样品转移进入核磁管，然后进行测试[22]。
1.2.4 傅里叶红外光谱分析
CS、SCS和CCS的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）测试在傅里叶红外光谱仪（PerkinElmer Frontier）上进行，干燥的样品使用衰减全反射（ATR）模式在4000～500 cm−1的范围内扫描，扫描次数为32次，分辨率为4 cm−1。
1.2.5 X射线衍射分析
CS、SCS和CCS的X射线衍射（XRD）曲线的测定在X射线衍射仪（Bruker D8 ADVANCE）上进行。扫描条件为电压为40 kV，电流为40 mA，衍射角（2θ）的扫描范围为5～50°，步宽为0.05°。在测定之前，样品在50 ℃下平衡24 h。根据Frost等[23]先前报道的方法定量估计样品的相对结晶度，即结晶域面积（衍射峰的面积）与XRD总面积之比。
1.2.6 热失重测定
CS、SCS和CCS的热重分析在同步热分析仪（Mettler-Toledo TGA/DSC1）上进行，干燥的样品（10 mg左右）在氮气条件下（20 mL/min）进行升温测定，温度范围为30～600 ℃，加热速率为10 ℃/min。
1.2.7 扫描电子显微镜分析
CS、SCS和CCS的形貌检测在扫描电子显微镜（Zeiss Sigma HD）上进行，将干燥后的样品轻薄且均匀的涂抹在样品台上的导电胶上，随后进行喷金处理，在加速电压5.0 kV条件下进行扫描，拍摄具有代表性的形貌图片。
1.2.8 SCS与CCS的混合
称取0.5 g的SCS，根据正电荷基团与催化中心不同的比例，即氮与硒的摩尔比（n（N）/n（Se））为100、300、600、1200、2000、3000、6000，添加不同质量的CCS（7.194、21.58、43.16、86.32、215.8、431.6 g）与SCS进行充分的研磨混合，记为SCS/CCS。
1.2.9 SCS中硒含量的测定
0.5 g的SCS样品和10 mL硝酸-高氯酸混合酸（
VHNO3 :VHClO4 =4:1）加入到消解管中，盖上弯颈漏斗冷消解过夜。次日使用消解器在100 ℃下热消解1 h，然后分别在120、150、170 ℃下热消解2 h，最后在180 ℃下进行赶酸处理，当溶液变为清亮无色并伴有白烟产生时，再继续加热至剩余体积为1 mL左右消解结束。冷却，用2.5 mL浓HCl进行还原处理并静置6 h，最后用HCl溶液（10%，v/v）进行定容，采用氢化物原子荧光光谱法进行硒含量的测定。同时，做试剂空白实验，每个测试样品做3个平行实验，取平均值。SCS样品的硒含量为11.35 μg/g[24]。1.2.10 CCS中氮含量的测定
0.5 g CCS样品、0.5 g无水硫酸铜（CuSO4）和4.5 g硫酸钾（K2SO4）加入到50 mL锥形瓶中，然后加入10 mL浓H2SO4，盖上弯颈漏斗摇匀后拿去加热板上进行消解处理。分别在180、240、400 ℃消解60 min，然后冷却至室温待测。加入10 mL去离子水将消解后的样品转移至凯氏定氮管中并放置于凯氏定氮仪中，样品中的氨在蒸气的作用下被蒸馏出来，被硼酸溶液所吸收，颜色由紫红色变为绿色。最后用硫酸溶液（0.5 mol/L）进行滴定，滴定终点是绿色变为淡红色。同时，做空白实验，样品氮含量根据下式计算[25]：
X=1.401×c×(V1−V0)m (1) 式中，X为淀粉样品的氮含量（%）；c为H2SO4溶液的浓度（mol/L）；V1为淀粉样品滴定消耗硫酸的体积（mL）；V0为空白滴定消耗硫酸的体积（mL）；m为淀粉样品的质量（g）；1.401为氮的相对原子质量/10（g/mol）。每个测试样品做3个平行实验，取平均值。CCS样品的氮含量为0.136%。
1.2.11 催化活性的测定
根据Wu等[26]报道的方法测定GPx的催化活性，即使用苯硫酚（ArSH）和氢过氧化物（ROOH）作为底物在紫外-可见分光光度计上进行测定。首先，将700 µL磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.0，50 mmol/L）、100 µL淀粉样品分散液和100 µL ArSH底物溶液（4-硝基苯硫酚（NBT）或3-羧基-4硝基苯硫酚（TNB），1.5 mmol/L）加入石英比色皿（1 mL，L=1 cm）中。石英比色皿中的混合物在室温下在超声下孵育1 min。通过添加100 µL ROOH （枯烯过氧化氢（CUOOH）或过氧化氢（H2O2），2.5 mmol/L）启动酶促反应。在紫外-可见分光光度计上监测410 nm吸光度的变化（ΔA）。使用上述相同方法进行对照测试，但淀粉样品分散液被100 µL PBS代替。酶促反应的初始反应速率（v0，μmol/(L·min)），即GPx的催化活性，由下式计算：
v0=ΔAε×L×Δt (2) 式中，ΔA为淀粉样品和对照组之间在410 nm处的吸光度变化；ε为ArSH底物的摩尔消光系数（εNBT=14600 L/mol∙cm，εTNB=13600 L/mol∙cm，pH=7.0）；L为石英比色皿的光程（cm）；Δt为410 nm处吸光度变化的时间差（min）。所有样品测定3次，取平均值。
1.2.12 催化活性的分析
根据Wu等[26]建立评估天然GPx和仿生GPx的催化活性的方法，以初始速率（v0，（μmol/L）/min）作为抗氧化催化活性的指标。在测定v0的过程中扣除了ArSH的自氧化速率，使用一个分子催化中心（−SeH）作为酶的催化中心来计算活性，以ArSH底物和氢过氧化物（ROOH）底物为双重底物，测量SCS、CCS、SCS/CCS和GTA/SCS的抗氧化催化活性（v0，（μmol/L）/min）。此外，其他酶学参数根据Michaelis-Menten方程（式3）和双倒数图（式4）确定。
v0=vmax[S]Km+[S] (3) 1v0=(Kmvmax)1[S]+1vmax (4) 式中，Km是米氏常数（µmol/L），[S]是底物的浓度（µmol/L），vmax表示最大反应速率（µmol/（L∙min））。
[E]0是酶的初始浓度（µmol/L），反应常数（Kcat，1/min）可以根据以下式进行计算：
Kcat=vmax[E]0 (5) 1.2.13 疏水性测定
采用芘荧光探针法分析SCS、CCS和SCS/CCS样品的疏水性。芘采用甲醇配制成1×10−4 mol/L的芘储备液。100 μL的储备溶液添加比色管中，然后在除去甲醇后分别添加10 mL的淀粉样品分散液（2% w/V），室温下超声处理20 min。荧光光谱测定在荧光分光度计（Agilent Cary Eclipse）中进行，荧光激发波长为334 nm，激发狭缝宽度为5 nm，发射狭缝宽度为2.5 nm，发射波长范围为350～500 nm。每个样品做3个平行，取平均值。采用λ1=372 nm处峰与λ3=383 nm处峰的强度比（I1/I3）评价疏水性[27]。
1.2.14 Zeta电位分析
不同氮与硒物质的量比的SCS/CCS样品Zeta电位的测定在纳米粒度及Zeta电位分析仪（Zetasizer Nano-ZS）进行，样品分别采用去离子水配制成分散液（1% w/V），室温下超声处理20 min，然后将上述分散液分别加入样品池中，在25 ℃下测定样品的Zeta电位，每个样品做3个平行，取平均值。
1.3 数据处理
数据结果以平均值±标准差表示，采用Origin 2018 64Bit制图。
2. 结果与分析
2.1 1H NMR分析
CS、SCS和CCS的1H NMR谱图如图3所示。信号峰在约5.46 ppm（a）和3.5～4.3 ppm（b）主要来源于淀粉糖单元骨架上亚甲基氢（−CH2−）和次甲基氢（−CH−）[28]，出现在CS的1H NMR光谱中。与CS相比，c信号峰代表的是酯化改性OSA上双键以外氢的信号峰。在SCS的1H NMR谱中，a和b信号峰仍然存在，表明在硒化和酯化改性过程中保留了CS的主要骨架结构。对比CS的核磁谱图，CCS谱图中b信号峰的强度较弱，主要是淀粉骨架上活化的羟基与阳离子醚化剂发生了阳离子醚化改性反应。CCS的谱图上在化学位移3.22 ppm（d）处一个额外的信号峰，这归因于季铵基（CH3）3N+上的质子氢[22]，季铵基基团特征峰的出现表明，CS上成功改性了阳离子基团，氮含量的测定也同时印证了这一观点。
2.2 FT-IR分析
CS、SCS和CCS的FT-IR光谱如图4所示。所有特征峰均根据报道的文献进行分配[29-30]。在CS的FT-IR光谱中：3300 cm−1左右的较宽的峰信号主要是由于−OH伸缩振动引起；1639 cm−1左右出现的峰信号峰源于淀粉中结合水的吸收振动。与CS的FT-IR光谱图相比，SCS的FT-IR光谱显示出与CS基本相同的信号峰，表明淀粉的分子骨架在改性过程中是稳定的。同时，3300 cm−1的−OH拉伸强度和1639 cm−1处结合水振动强度降低，这些结果表明SCS的合成制备过程消耗了淀粉骨架上的羟基，并且在改性过程中可能产生了疏水特性导致结合水的减少。与木薯的FT-IR光谱图相比，CCS在1483 cm−1处表现出新的信号峰，这个特征信号峰可归因于季铵基C−N拉伸振动，这就是阳离子基团与淀粉主链结合的证据[31]。同时，在1238 cm−1处C−O−C的特征峰信号强度有所增强，这些证据表明在CS骨架上成功改性了阳离子基团，这个结果与1H NMR分析结果一致。CCS的FT-IR光谱显示出与CS基本相同的吸收峰，表明在阳离子醚化改性过程中淀粉的分子骨架没有发生改变，具有稳定性。
2.3 XRD分析
X射线衍射技术是一种重要的结构测试手段，可以检测淀粉样品的晶体结构变化，进而分析淀粉样品的结构稳定性变化。CS、SCS和CCS的X射线衍射曲线如图5所示。所有样品均显示出典型的A型结构，即在15°、17°、18°和23°处出现衍射峰[32-33]，改性过程并未破坏淀粉的主体晶体结构。与CS的结晶度（44.1%）相比，SCS的结晶度降低到38.1%。由于硒化改性只在OSA链上发生亲核加成，不影响淀粉的结晶度，结晶度的轻度降低可能是强碱性环境引起的[31]。CCS的XRD衍射峰与CS基本上一致，结晶度降低到38.6%，阳离子醚化改性也是在碱性条件下进行，这些可能是强碱性的反应环境影响的结果。总体而言，SCS和CCS保持淀粉结构的稳定性，碱性反应条件的腐蚀使结晶度有所降低。
2.4 热重（TG & DTG）分析
TG是一种常用的材料结构分析技术，根据温度来改变样品的重量，并评估其热稳定性。CS、SCS和CCS的TG曲线和相应的差热分析（DTG）曲线分别如图6A和图6B所示。所有淀粉样品的热分解在TG曲线中主要分为两个阶段[34]。第一阶段是物理脱水引起的失重，第二阶段是淀粉聚合物链的热分解引起的失重。如图6A所示，在150 ℃之前，发生了第一阶段失重，SCS、CCS和CS的物理脱水重量损失分别为6.9%、8.2%和9.5%。与CS相比，SCS表现出较低的失重，这可能是由于疏水性的OSA链锚定在淀粉颗粒表面以抑制其吸水率。对于CCS，阳离子醚化反应是在碱-醇混合物中进行的，这可以使淀粉脱水。对于这些结果与相关样品在2800～3500 cm−1处峰强度的降低一致（图4）。SCS、CCS和CS在第二阶段失重终止温度基本相同，但SCS和CCS在第二阶段失重起始温度分别为234 ℃和240 ℃，低于CS失重温度（262 ℃），这可能是由于含功能基团的短链分子如OSA和GTA及其与淀粉的键合相比规整的淀粉分子更容易分解所致[35]。如图6B所示，SCS和CCS聚合物链分解的DTG峰分别位于约300 ℃和305 ℃，即SCS和CCS最大失重速率温度分别为300 ℃和305 ℃，低于木薯淀粉的最大失重速率温度（315 ℃）。这可能是由于改性轻微腐蚀了淀粉颗粒表面，有利于传热，从而加速了聚合物链的分解。
2.5 SEM分析
CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM图像如图7所示。粒径在3～10 µm范围内的木薯淀粉显示出具有光滑表面的球状或半球形结构。SCS保留了淀粉的颗粒结构，但表面粗糙。该表面可能是由于强碱性NaSeH溶液的侵蚀和锚定的OSA链和一些游离淀粉链在制备过程中的聚集所致。也就是说，大部分催化活性位点（−SeH）锚定在淀粉颗粒表面，这将有利于活性位点的暴露以进行催化反应。CCS的淀粉结构比较完整，形貌的改变主要发生在淀粉颗粒表面，部分淀粉颗粒表面发生类似“剥皮”的现象，这些形貌的改变表明阳离子化醚化改性发生在淀粉颗粒表面，CCS表面改性的阳离子基团能够识别催化底物，聚集催化底物与SCS表面上修饰的催化中心配合促进催化反应的进行。
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图 7 CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM图Figure 7. SEM images of CS (A1, A2), SCS (B1, B2) and CCS (C1, C2)2.6 催化活性分析
根据Wu等[26]建立评估天然GPx和仿生GPx的催化活性的方法，以初始速率（v0，μmol/（L·min））作为催化活性的指标。在测定v0的过程中扣除了CCS及GTA自身的催化速率。使用一个分子催化活性中心（−SeH）作为酶的催化中心来计算活性。
为了研究CCS上正电荷基团与SCS的催化中心不同比例配合在四个不同体系对催化活力的影响，将测定过程中ArSH和ROOH的浓度分别设置为150 µmol/L和250 µmol/L。图8显示了25 ℃、pH7.0（50 mmol/L PBS）条件下，不同比例的正电荷基团与催化中心的SCS/CCS催化ArSH还原ROOH的v0。在TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2四个体系中，SCS/CCS的v0随着氮元素物质的量比硒元素物质的量比（n（N）/n（Se））的增加呈现出相似的变化趋势，即v0随着n（N）/n（Se）的增加先增加而后逐步减低。当n（N）/n（Se）为1200时，与SCS相比，在TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2四个体系中的催化活力分别提升了22.1%、25.8%、17.5%、19.6%。这可能是CCS上的正电荷基团增加了底物识别位点，识别位点使底物富集在CCS表面周围，随着布朗运动的作用，CCS碰撞靠近SCS表面上的催化中心，底物与催化中心充分接触，进而提高反应催化活性[36]。当n（N）/n（Se）超过1200左右时，CCS表面分子链与底物形成较强的结合力，底物会附着在CCS表面周围很难释放，使SCS表面上的催化中心很难接触到底物，进而使催化活性降低[37]。SCS/CCS在n（N）/n（Se）为1200具有最佳的催化活性。
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图 8 SCS/CCS催化ArSH（150 µmol/L）与ROOH（250 µmol/L）反应的初始速率（v0）Figure 8. Initial rate (v0) of the reaction between ArSH (150 µmol/L) and ROOH (250 µmol/L) catalyzed by SCS/CCS at different systems由于CCS颗粒大小与SCS相当，与催化中心碰撞接触过程会有一定的空间位阻，需要富集更多的底物才能和催化中心进行配合达到提高催化活性的效果。进一步探索具有较小位阻的小分子阳离子基团对催化活性的影响。在SCS分散液添加不同比例GTA（n（N）/n（Se）为100、300、600、900、1200、1500、2000，记为GTA/SCS）进行测试催化活性，图9显示了在25 ℃、pH7.0（50 mmol/L PBS）条件下，不同比例的GTA与催化中心的GTA/SCS催化ArSH还原ROOH的v0。GTA/SCS的催化活力在随着n（N）/n（Se）的变化呈现出相似的规律，即当n（N）/n（Se）小于900左右时，催化活力随n（N）/n（Se）逐渐增加；然而，当n（N）/n（Se）的比例进一步增加会导致催化活力的降低。与SCS相比，在TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2四个体系中的最大催化活力分别提升了15.8%、29.8%、21.2%、31.6%，这可能是GTA识别效应对底物具有聚集作用，进而接触催化中心提高催化效率，提升催化活力。同时过多添加GTA，产生较强的识别作用可能会抑制反应底物的释放，从而阻碍下一个催化循环，进而导致较低的催化活性。
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图 9 GTA/SCS催化ArSH（150 µmol/L）与ROOH（250 µmol/L）反应的初始速率（v0）Figure 9. Initial rate (v0) of the reaction between ArSH (150 µmol/L) and ROOH (250 µmol/L) catalyzed by GTA/SCS at different systems图10显示了SCS/CCS和GTA/SCS催化ArSH还原ROOH的v0随时间变化关系。GTA/SCS的催化活力在随着时间的变化呈现出相似的规律，随着时间的增加催化活力逐步减低，这可能是GTA在SCS的分散液中不能稳定存在，其识别位点的作用不能稳定，对催化效果随着时间的变化具有不稳定性。SCS/CCS的催化活性基本保持一致，这是由于正电荷基团锚定在淀粉颗粒表面，能够稳定存在，可以保证催化活性的稳定一致性。后续的催化机理研究采用n（N）/n（Se）为1200时的SCS/CCS。
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图 10 SCS/CCS和GTA/SCS催化ArSH（150 µmol/L）与ROOH（250 µmol/L）反应的初始速率比较Figure 10. Comparison of the initial rates (v0) for the reaction of ArSH (150 µmol/L) and ROOH (250 µmol/L) catalyzed by SCS/CCS and GTA/SCS at different systems为了进一步研究催化行为，将TNB或NBT的浓度固定为150 µmol/L，测试了SCS/CCS在不同浓度ROOH（CUOOH或H2O2）的不同反应体系中的v0。如图11所示，在TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2四个体系中，SCS/CCS的v0随着ROOH（CUOOH或H2O2）浓度的增加呈现出相似的变化趋势，即v0随着ROOH浓度的增加而增加，然后达到了平衡。四个体系中SCS/CCS的v0相对于ROOH浓度的曲线类似于天然GPx的催化行为，显示出典型的饱和动力学行为[38]。
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图 11 在ArSH（150 µmol/L）下SCS/CCS催化反应初始速率随ROOH浓度的变化曲线Figure 11. Profiles of initial rate against the concentration of ROOH at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentration of ArSH at 150 µmol/L2.7 催化机制分析
每个Se单体对应的v0的倒数（[E]0/v0）与ROOH浓度的倒数（1/[CUOOH]或1/[H2O2]）做双倒数曲线，即Lineweaver-Burk图。如图12所示，在TNB或NBT浓度不变的情况下，它们在不同浓度的ArSH下相互平行，表明SCS/CCS对ArSH和ROOH反应的催化机制均为与天然GPx相似的“乒乓”催化机制[39]。选择ArSH浓度为150 μmol/L的实验数据拟合到乒乓动力学机制中，其中最大反应速率（vmax，µmol/（L∙min））、反应常数（Kcat，1/min）、米氏常数（Km，µmol/L）和催化效率（Kcat/Km，L/mol∙min）等催化反应的动力学常数如表1所示。
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图 12 不同浓度ArSH（75、120和150 μmol/L）下SCS/CCS的催化速率与ROOH浓度的双倒数曲线Figure 12. Profiles of [E]0/v0 against 1/[ROOH] at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentrations of ArSH at 75, 120 and 150 μmol/L表 1 SCS/CCS催化反应的动力学常数Table 1. The kinetic parameters of catalytic reactions of SCS/CCSReaction vmax（µmol/(L·min)） Kcat（1/min） Km（ROOH）（µmol/L） Kcat/Km（×105 L/mol∙min） NBT+CUOOH 16.10 16.10 37.52 4.29 NBT+H2O2 13.02 13.02 39.58 3.29 TNB+CUOOH 15.36 15.36 28.42 5.41 TNB+H2O2 12.21 12.21 30.77 3.97 一般情况下，Km代表反应速率为最大反应速率一半时底物的浓度，反映底物与酶的结合强度[40]，Km越低，仿生GPx材料与底物之间的结合力越强，而Kcat/Km值越大意味着仿生GPx材料的催化效率越高。如表1所示，在NBT和TNB的两种反应体系中，Km（CUOOH）的值都小于Km（H2O2）的值，表明底物H2O2与CUOOH相比，SCS/CCS对底物CUOOH的亲和力更高。此外，SCS/CCS在催化CUOOH和ArSH反应时显示出更高的vmax和Kcat/Km，表明SCS/CCS催化ArSH还原CUOOH的反应效率高于H2O2。在这些反应体系中，ROOH（CUOOH和H2O2）是唯一的区别。因此，ROOH的结构差异可能是动力学常数变化的主要原因。由于对异丙苯基的存在，CUOOH比H2O2更疏水，并且在SCS/CCS的催化下表现出更高的还原能力。因此，可以得出结论，SCS/CCS更适合捕获催化反应的疏水底物。
由于不存在羧基，NBT与TNB相比显示出更高的疏水性。然而，与其他组合相比，TNB和CUOOH的底物组合显示出最低的Km和最大的Kcat/Km，这些结果表明，TNB和CUOOH具有更强底物结合能力，源于TNB中的羧基与识别位点的正电荷基团存在氢键作用[36]，更容易富集底物，进而提高催化效率。但是，TNB和CUOOH体系中的v0略小于NBT和CUOOH体系（图9）。一方面，SCS/CCS能够容易捕捉疏水性底物CUOOH，另一方面，CCS表面分子链段上正电基团与底物TNB之间的氢键产生的底物识别效应对底物起聚集作用，但是SCS表面催化中心和底物有一定空间位阻，不能有效进行催化，进而导致TNB和CUOOH体系中SCS/CCS催化反应的v0有所降低。
根据先前报道的文献，GPx模拟物中的疏水微环境和活性位点在提供高催化活性方面起着重要作用[38,41]。SCS表面的疏水性OSA链可以通过疏水相互作用聚集疏水性底物提供了疏水性微环境，这将有利于催化反应。而SCS/CCS中的疏水微环境增强了催化活性。为了证明SCS/CCS中疏水微环境的形成，使用芘荧光探针法进行测试。
芘是一种用于测试材料的疏水性常用的荧光探针，λ1=372 nm处的峰和λ3=383 nm处的峰的荧光强度之比（I1/I3）越小，材料的疏水性越强[42]。芘在木薯淀粉、SCS和SCS/CCS分散液中和芘的水溶液的荧光光谱如图13所示，测试中芘浓度为5×10−6 mol/L。芘/SCS的I1/I3值为1.51，小于芘/CS的I1/I3值（1.72），表明在SCS上形成了疏水性微环境。可能的解释是淀粉分子链段和OSA链的聚集导致表面粗糙，从而增加了其疏水性。芘/（SCS/CCS）的I1/I3 值（1.50）与芘/SCS的值基本一致，CCS的添加没有破坏体系疏水性微环境。SCS/CCS可以提供催化活性位点（−SeH）和疏水微环境，赋予混合淀粉良好的抗氧化性能。
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图 13 芘在SCS（a）、SCS/CCS（b）、CS（d）分散液中和水中（c）的荧光光谱Figure 13. Fluorescence spectra of pyrene in the dispersion of SCS (a), SCS/CCS (b), cassava starch (d) and water (c)前期研究表明，正电荷基团是能够高效率地模拟天然GPx中精氨酸识别位点的官能团[43]。如图14所示，随着n（N）/n（Se）的增加SCS/CCS表面的Zeta电位也增加。随着大量的CCS的添加，最后SCS/CCS表面的Zeta电位呈现电正性，可以模拟识别位点。SCS/CCS在表面的Zeta电位约为5.6 mV时，达到催化效果最优。较低的Zeta电位达到最优催化效果，这是SCS/CCS混合体系中识别位点与催化中心存在空间位阻导致的。CCS表面正电荷越多越容易富集底物，而使底物难以释放，不易与SCS表面的催化中心接触时进行反应，因此SCS/CCS混合体系中达到最优的催化活力需要较低的正电荷分布，即较低的Zeta电位。
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图 14 不同氮与硒物质的量比的SCS/CCS的Zeta电位Figure 14. Zeta potential of SCS/CCS with different molar ratios of nitrogen and selenium综上所述，SCS和CCS组成的SCS/CCS混合体系中，SCS提供的催化中心和CCS表面的底物识别位点有效配合，形成有利于结合底物的疏水微环境。SCS/CCS混合体系中底物识别位点对提升催化活力具有贡献作用，而过强的底物识别位点结合作用会降低催化活力。GPx催化中心与疏水微环境、底物识别位点的有效匹配是维持SCS/CCS的高催化活力重要因素。
3. 结论
以CS为原料，分别制备了SCS和CCS。将两种淀粉混合可实现目标淀粉中同时含有硒氢基、季铵基和疏水性的辛烯基琥珀酸酯分子链，而此三者可模拟谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的三核心要素：含硒催化活性中心、荷正电的识别位点和疏水微环境。当混合淀粉中的氮和硒物质的量比为1200时，SCS/CCS的Zeta电位约为5.6 mV，其在TNB+CUOOH、TNB+H2O2、NBT+CUOOH、NBT+H2O2反应体系中的GPx催化活力分别为13.94、11.25、12.91和10.87 µmol/min，比SCS的催化活力分别提高了22.1%、25.8%、17.5%和19.6%。本工作为高催化活性的淀粉基仿生GPx规模化生产提供了一种简单的方法。
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图 7 CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM图
Figure 7. SEM images of CS (A1, A2), SCS (B1, B2) and CCS (C1, C2)
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图 8 SCS/CCS催化ArSH（150 µmol/L）与ROOH（250 µmol/L）反应的初始速率（v0）
Figure 8. Initial rate (v0) of the reaction between ArSH (150 µmol/L) and ROOH (250 µmol/L) catalyzed by SCS/CCS at different systems
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图 9 GTA/SCS催化ArSH（150 µmol/L）与ROOH（250 µmol/L）反应的初始速率（v0）
Figure 9. Initial rate (v0) of the reaction between ArSH (150 µmol/L) and ROOH (250 µmol/L) catalyzed by GTA/SCS at different systems
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图 10 SCS/CCS和GTA/SCS催化ArSH（150 µmol/L）与ROOH（250 µmol/L）反应的初始速率比较
Figure 10. Comparison of the initial rates (v0) for the reaction of ArSH (150 µmol/L) and ROOH (250 µmol/L) catalyzed by SCS/CCS and GTA/SCS at different systems
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图 11 在ArSH（150 µmol/L）下SCS/CCS催化反应初始速率随ROOH浓度的变化曲线
Figure 11. Profiles of initial rate against the concentration of ROOH at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentration of ArSH at 150 µmol/L
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图 12 不同浓度ArSH（75、120和150 μmol/L）下SCS/CCS的催化速率与ROOH浓度的双倒数曲线
Figure 12. Profiles of [E]0/v0 against 1/[ROOH] at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentrations of ArSH at 75, 120 and 150 μmol/L
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图 13 芘在SCS（a）、SCS/CCS（b）、CS（d）分散液中和水中（c）的荧光光谱
Figure 13. Fluorescence spectra of pyrene in the dispersion of SCS (a), SCS/CCS (b), cassava starch (d) and water (c)
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图 14 不同氮与硒物质的量比的SCS/CCS的Zeta电位
Figure 14. Zeta potential of SCS/CCS with different molar ratios of nitrogen and selenium
表 1 SCS/CCS催化反应的动力学常数
Table 1 The kinetic parameters of catalytic reactions of SCS/CCS
Reaction vmax（µmol/(L·min)） Kcat（1/min） Km（ROOH）（µmol/L） Kcat/Km（×105 L/mol∙min） NBT+CUOOH 16.10 16.10 37.52 4.29 NBT+H2O2 13.02 13.02 39.58 3.29 TNB+CUOOH 15.36 15.36 28.42 5.41 TNB+H2O2 12.21 12.21 30.77 3.97 
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