Characteristics of Water-soluble Pectin from Greengage and Its Anti-inflammatory Activity in LPS-induced RAW246.7 Cells
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摘要: 本研究从青梅果汁中提取可溶性果胶（WSP），通过高效液相色谱（HPLC）、高效凝胶色谱（HPGFC）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电镜（SEM）及X-射线衍射（XRD）等对其组成和结构进行了表征，并用酶联免疫法（ELISA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW246.7细胞的抗炎活性进行评价。结果表明，WSP的酯化度为18.89%，属于低酯果胶，其半乳糖醛酸（GalA）含量为69.72%，主要中性多糖是半乳糖（Gal）（18.36%），重均分子量（Mw）为353.73 kDa，属于非晶型结构。WSP可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）(P<0.05)、干扰素-γ（IFN-γ）(P<0.05)、白介素6（IL-6）（P<0.001）的释放量，增加白介素10（IL-10）(P<0.01）的分泌，起到抗炎作用。为了探究其抗炎机理，通过实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time qPCR)和蛋白印迹法（Western blot）研究了WSP对Janus 激酶/信号转导和转录激活因子信号通路（JAK/STAT信号通路）的影响。与LPS模型组相比，WSP显著上调了与炎症密切相关的JAK1（P<0.01），JAK2（P<0.05），JAK3（P<0.001）和STAT1（P<0.001），STAT2（P<0.001）和STAT3（P<0.05）的mRNA表达量，且使JAK1和STAT3的磷酸化水平显著降低（P<0.05），该结果表明WSP可通过干预JAK/STAT信号通路，抑制与炎症信号相关的JAK和STAT家族的磷酸化水平来缓解LPS诱导的RAW264.7细胞炎症。本研究可为评价青梅果的健康促进作用和提高青梅果加工附加值提供参考。
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关键词:
- 青梅 /
- 可溶性果胶 /
- RAW246.7细胞 /
- 抗炎 /
- JAK/STAT通路
Abstract: In this study, the water soluble pectin (WSP) from greengage juice was extracted. The structure and composition of WSP were characterized by high performance liquid chromatography (HPLC), high performance gel filtration chromatography (HPGFC), Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), scanning electron microscope (SEM) and X-ray diffraction (XRD). And the anti-inflammatory activity of WSP in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW246.7 cells was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that WSP was a low-methoxy pectin with DE value of 18.89%. The content of galacturonic acid (GalA) was 69.72%, and the galactose (Gal) was the predominant neutral sugar with the content of 18.36%. The molecular weight (Mw) of WSP was 353.73 kDa. WSP significantly inhibited the release of tumor necrosis factor α (TNF-α) (P<0.05), interferon-γ (IFN-γ) (P<0.05), interleukin-6 (IL-6) (P<0.001) and increasing the secretion of interleukin-10 (IL-10) (P<0.01). The effects of WSP on Janus kinase/signal transduction and transcription activator signaling pathway (JAK/STAT signaling pathway) were investigated by real-time quantitative PCR and Western blot in order to clarify the anti-inflammatory mechanism. Compared with LPS group, WSP significantly upregulated the mRNA expressions of JAK1 (P<0.01), JAK2 (P<0.05), JAK3 (P<0.001), STAT1 (P<0.001), STAT2 (P<0.001) and STAT3 (P<0.05). Further analysis showed that the phosphorylation levels of JAK1 and STAT3 were significantly inhibited by WSP treatment (P<0.05). Therefore, the WSP can alleviate LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells by interfering with JAK/STAT signaling pathway and inhibiting the phosphorylation levels of JAK and STAT families related to inflammatory signaling. This study can provide a basis for the evaluation of the health improvement effect of greengage fruit and the development of value added greengage product.-
Keywords:
- greengage /
- water-soluble pectin /
- RAW246.7 cells /
- anti-inflammatory /
- JAK/STAT pathway
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青梅（Prunus mume，蔷薇科杏属植物）是一种在中国广泛种植的重要观赏植物。近年来，随着青梅种植面积的逐渐扩大，青梅果的产量也不断增多，青梅果加工业发展需求日益增加。青梅果在传统的医学中可被用来治疗腹泻、咳嗽等疾病，具有药食同源的特性[1]。目前对于青梅果的营养功能研究主要集中在对其多酚[2]、萜类、有机酸[3]等生物活性物质上，对于其主要多糖成分——果胶的研究还未见报道。果胶主要存在于植物细胞壁中，通常与纤维素、半纤维素等大分子相结合，一部分果胶以游离形式存在于果汁中（可溶性果胶），这部分果胶作为可溶性膳食纤维对肠道健康起着促进作用[4]。为深入了解青梅果的功能特性，有必要对青梅果中的可溶性果胶进行研究。
植物多糖一般具有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]和改善肠道健康[8]等多种生物功能，果胶作为多糖的一种，抗炎活性是其主要生物活性之一[9-10]。如Li等[11]从豆腐柴叶子中提取果胶，结果表明碱法提取的果胶具有较强的抗氧化性，并能对LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症具有显著的抑制作用。多糖的抗炎机理与细胞内的多种信号通路相关[12]，其中包括重要的炎症转导通路Janus激酶/信号转导与转录激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路[13]。Le等[14]对从豆渣中提取的多糖（MESP）的抗炎作用及其机理进行了研究，他们发现MESP可抑制细胞JAK/STAT信号通路中JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，从而抑制促炎细胞因子的表达进而发挥抗炎作用。已有文献报道果胶寡糖对结肠炎症的缓解作用也与JAK/STAT信号通路相关[15]。青梅果胶作为天然植物多糖的一种，可能通过相似的抗炎机制发挥抗炎活性。
本研究从青梅果汁中提取可溶性果胶（WSP），并对其结构和组成进行分析，同时采用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，从细胞水平评估青梅果中可溶性果胶对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响，并探讨它对JAK/STAT通路的影响，为揭示果胶的抗炎机制，全面了解青梅果的健康促进功能，推动青梅果加工业的发展，以及进一步提高青梅果加工附加值提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
RAW264.7细胞 中国科学院上海生命科学研究院细胞库；青梅果 南京农力佳农业发展有限公司提供，2020年5月收获于南京溧阳；DMEM培养基、标准牛胚胎血清（FBS） 美国Gibco公司；青霉素-链霉素混合溶液 北京索莱宝科技有限公司；ELISA试剂盒（IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ） 北京四正柏生物科技有限公司；TRIzol试剂 Invitrogen公司；逆转录试剂盒、BCA试剂盒、β-actin、STAT3、p-STAT3、抗体辣根过氧化物标记山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（HRP） 上海碧云天生物技术有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；JAK1 英国abcam公司；p-JAK1 美国Cell Signaling Technology公司；葡聚糖T系列标品（T-300、T-150、T-10、T-5）、脂多糖（LPS）、咔唑等其余化学试剂 阿拉丁试剂（上海）有限公司；单糖标品（≥99%） 上海源叶生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
SKG大口径原汁机 广东艾诗凯奇智能科技有限公司；TM-3000扫描电子显微镜、U-3900紫外可见分光光度计 日本日立公司；X射线衍射仪 德国Bruker AXS；Freezone 2.5真空冷冻干燥机 美国LABCONCO公司；Agilent 1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Waters 1525高效凝胶过滤色谱仪 美国Waters公司；Tensor 27傅里叶红外光谱仪 德国Bruker公司；Heracell 240i CO2培养箱微量、U-3900紫外分光光度计 日本日立公司；Axio Vert.A1倒置式生物显微镜 北京Precise仪器有限公司；SpectraMax® M2/M2e全波长酶标仪 美国Molecular Devices公司；Archimed-X4实时荧光定量PCR仪 北京鲲鹏基因科技有限责任公司；EPS-300电泳仪、Tanon-5200化学发光凝胶成像仪 上海天能科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 可溶性青梅果胶（WSP）的提取
根据Wellala等[16]的方法提取果汁中的可溶性果胶，具体如下：新鲜的青梅果用榨汁机榨汁，将果汁过滤并减压浓缩。浓缩后的青梅果汁中加入6倍体积95%的乙醇，搅拌2 h，得到果胶粗提物的沉淀，将沉淀用丙酮洗涤，经过滤、干燥后重新用超纯水溶解，并使用透析袋（3.5 kDa）在蒸馏水中透析72 h，得到进一步纯化后的果胶溶液，经浓缩后在3.0 Pa，−80 ℃条件下进行真空冷冻干燥，得到WSP冻干粉。
1.2.2 可溶性青梅果胶（WSP）的表征
1.2.2.1 果胶中半乳糖醛酸（GalA）的测定
参照Zhou等[17]的方法并略有修改。将WSP冻干粉配成1 mg/mL的溶液。将果胶溶液与浓硫酸按体积比1:6在冰浴下混匀，随后在85 ℃水浴中加热15 min，冷却至室温后加入0.5 mL 0.15%咔唑无水乙醇摇匀，并在暗处放置1.5 h。测定其在528 nm下的吸光度。以半乳糖醛酸为标品，计算果胶样品中半乳糖醛酸含量。
1.2.2.2 果胶中单糖的组成测定
WSP中的单糖组成按照Zhang等[18]的方法测定。
色谱条件：采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）色谱柱，设定检测波长为250 nm，进样体积为10 μL，流速1 mL/min，用流动相A和B（分别为含15%和40%乙腈的pH7.0的磷酸缓冲溶液）按如下梯度进行洗脱：0~10 min，0~15% B；10~30 min，15%~25% B，洗脱时间为30 min。以果胶中常见的单糖标品（甘露糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖和岩藻糖）为对照，通过它们的保留时间和标准曲线来对WSP中的单糖进行定性和定量分析。
1.2.2.3 果胶分子量测定
配制2 mg/mL WSP水溶液，用高效凝胶过滤色谱（HPGFC）与示差折光检测器（RID）测定果胶样品的分子量（Mw）和分布。具体方法如下：采用两个色谱柱（Ultrahydrogel TM Linear 300 mm×7.8 mmid）串联进行分离，设定柱温40 °C，流速0.8 mL/min，用含有0.05% NaN3的NaNO3（0.1 mol/L）溶液为流动相进行洗脱，进样体积为20 μL，洗脱时间为30 min。以葡聚糖（Dextran）T-300（Mw=300600）、DextranT-150（Mw=135030）、Dextran T-10（Mw=9750）和Dextran T-5（Mw=2700）为标准品进行分子量计算。
1.2.2.4 傅里叶红外光谱检测
青梅果胶粉末与溴化钾按1:200混合压片，用傅里叶变换红外光谱仪测定样品在4000～400 cm−1范围的吸收光谱。
1.2.2.5 扫描电镜（SEM）
用导电胶带将果胶粉末固定在样品架上，并在真空下溅射金粉，然后在两种放大倍数下（×0.5 k和×1.5 k）通过15 kV的加速电压照相，来获取果胶形态的图片。
1.2.2.6 X射线衍射 （XRD）
果胶粉末样品的结构用X射线衍射仪进行测定，扫描范围为0~80度衍射角，Cu-Kα辐射，电压设置为40 kV，电流为40 mA。
1.2.3 细胞培养
取对数生长期的RAW 264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，用含有10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL青霉素、100 µg/mL硫酸链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B）的DMEM全培养基进行培养。控制温度为37 ℃，CO2浓度为5%。24 h后给药预处理4 h，然后加入5 μL LPS的磷酸缓冲溶液（PBS），使其在1 μg/mL的LPS刺激下培养24 h，具体分组如下：
样品组：分别用含50、100、200 μg/mL WSP的DMEM溶液预处理4 h，然后加入LPS继续培养24 h；模型组（LPS组）：用DMEM培养基培养4 h后加入LPS继续培养24 h；正常组（Control组）：用DMEM培养基培养4 h后加入5 μL PBS继续培养24 h。
1.2.4 果胶的毒性评价（MTT法）
按照1.2.3进行细胞培养和分组实验，WSP的浓度设置为50、100、200、500 μg/mL，经4 h给药处理和24 h LPS刺激培养后，将培养液换成5 mg/mL的噻唑蓝（MTT）溶液继续培养4 h，然后去掉上清液，加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），在37 ℃下振荡15~20 min，用酶标仪在490 nm处读取各孔的OD值[19]。
细胞存活率(%)=OD样品OD空白×100 (1) 1.2.5 LPS诱导RAW264.7细胞分泌的细胞炎症因子含量测定
收集按1.2.3中方法处理的各实验组细胞上清液，按照ELISA试剂盒的操作说明，分别测定上清液中TNF-α、IL-6、IL-10和IFN-γ的含量。
1.2.6 RAW264.7细胞中JAK/STAT通路相关基因mRNA表达测定
取对数生长期的细胞以2×105~4×105个/mL的密度接种至12孔板，分组同1.2.3，24 h后用Trizol试剂提取细胞中的RNA，微量紫外分光光度计检测RNA浓度。用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。按照实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒的说明操作，置于实时荧光定量PCR仪中，进行循环反应，反应完毕后采用差异倍数2−△△Ct计算mRNA的相对表达水平，至少进行3次平行实验。相关引物序列如表1所示[20]。
表 1 内参β-actin和JAK/STAT通路相关基因引物序列Table 1. The sequence of the primer of reference β-actin and relative genes in JAK/STAT pathway基因 上游引物 下游引物 β-actin 5'-ATGTGGATCAGCAAGCAGG-3' 5'-GTCAAAGAAAGGGTGTAAAACG-3' JAK1 5'-ATGCCCACCATTACCTCTGT-3' 5'-ATCCCCTCTTCACTCCCTTC-3' JAK2 5'-CATAGACGAGTCAACCAGGCA-3' 5'-AAAGTCATCAAGCAGAGGAGC-3' JAK3 5'-GGAGGTCGTGGATGGTGAGA-3' 5'-GCGGGTAGGATACTTGGCT-3' STAT1 5'-AACCTTCCTCCTCTTCCAGC-3' 5'-CAATTTCACCAACAGTCTCAGC-3' STAT2 5'-ACATCACAACCAACGAAAACC-3' 5'-GAGTCCATCCCAAGAGTCCA-3' STAT3 5'-GGAGCAGAGATGTGGGAATG-3' 5'-CAACTGGCAAGGAGTGGGT-3' 1.2.7 RAW264.7细胞中JAK/STAT通路相关蛋白表达测定
取对数生长期的细胞以1×106个/mL的密度接种至6孔板中，按1.2.3中的方法分组培养，孵育24 h后移除上清，用PBS清洗后加入200 μL的裂解液进行裂解，然后在4 ℃和12000 r/min下离心15 min，用BCA试剂盒测定上清的蛋白含量，在95 ℃下加热5 min使蛋白质变性。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（SDS-PAGE）进行电泳，先在80 V恒电压下电泳30 min，然后在120 V恒电压下电泳60 min，电泳结束后将胶片转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美国）上，用5%脱脂牛奶4 ℃封闭40 min；PBST中冲洗后，分别加入JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3和β-actin抗体，4 ℃下孵育过夜，回收一抗。PBST冲洗后4 ℃孵育二抗1 h，回收二抗，用PBST清洗PVDF膜洗4次后将用化学发光显影液滴加在PVDF膜上，反应1 min后用化学发光凝胶成像仪进行显影。
1.3 数据处理
数据用平均值±标准差表示，采用SPSS、GraphPad Prism 7.0和Origin软件进行数据分析和作图，以ANOVA进行显著性分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 可溶性青梅果胶（WSP）的纯度、单糖组成及分子量
半乳糖醛酸含量是果胶纯度指标，按照果胶标准（GB 25533-2010），用作食品添加剂的果胶中半乳糖醛酸含量不低于65%。根据紫外可见分光光度法得到WSP的半乳糖醛酸含量为78.93%，说明所提取的WSP具有较高的纯度。
果胶的单糖及其结构域组成是其表征中的重要指标，有研究表明，果胶的结构与它的功能特性之间有着密切的联系[4]。图1是WSP酸解后的单糖PMP衍生物的HPLC色谱图，可以看到WSP中共检测出七种单糖，定量分析结果见表2，果胶中的主要单糖是半乳糖醛酸（GalA）占总单糖含量的69.72%。而半乳糖（Gal）为主要的中性单糖，占单糖含量的18.36%，其次是阿拉伯糖（Ara）和鼠李糖（Rha），分别占6.31%和4.63%。有研究从苹果、胡萝卜[21]和秋葵[22]中提取水溶性果胶，发现其主要中性单糖也是半乳糖，与本研究结果一致，而Marcclin等[23]从番石榴中提取的水溶性果胶的主要中性单糖是阿拉伯糖。不同来源的果胶其中性糖组成有明显差异。果胶主要是由同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I和II（RG-I和RG-II）三个结构区域组成。根据单糖的组成，计算得到WSP主要含HG和RG-I结构域，占比分别为65.09%和33.93%。在抑制炎症方面，果胶的HG结构域是缓解急性炎症的优先区域，而RG-I区域的侧链与半乳糖凝集素-3（Gal-3）可以紧密结合，对其抗炎作用也具有重要贡献[24]。
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图 1 WSP中单糖PMP衍生物的高效液相色谱图注：A：单糖标品；B：WSP水解产物；1-PMP衍生剂，2-甘露糖，3-鼠李糖，4-葡萄糖醛酸，5-半乳糖醛酸，6-葡萄糖，7-半乳糖，8-阿拉伯糖，9-果糖。Figure 1. High performance liquid chromatogram of monosaccharide PMP derivate of WSP表 2 WSP的单糖和结构域组成Table 2. Monosaccharide and region constitution of WSP单糖组成（%） 结构域组成（%）A 半乳糖醛酸
（GalA）半乳糖
（Gal）阿拉伯糖
（Ara）鼠李糖
（Rha）葡萄糖
（Glc）甘露糖
（Man）葡萄糖醛酸
（Gluc）同型半乳糖醛酸聚糖
（HG）鼠李半乳糖醛酸聚糖I
（RG-I）69.72±0.38 18.36±0.42 6.31±0.17 4.63±0.01 1.25±0.04 0.32±0.03 0.15±0.021 65.09 33.93 A注：HG（同型半乳糖醛酸聚糖）=GalA-Rha；RG-I（鼠李半乳糖醛酸聚糖I）=2Rha+Ara+Gal。 果胶的分子量不仅与其乳化和凝胶特性等物理性质有关，还与其生物功能，如抗氧化活性和对肠道健康的影响有关[25]。通过高效凝胶过滤色谱与示差折光检测器联用（HPGFC-RID），以不同分子量的葡聚糖（Dextran）为标品，对WSP的分子量进行了测定。图2为WSP的高效凝胶过滤色谱，表3为测定结果。由图2可以看到，WSP高效凝胶过滤色谱分离出现两个色谱峰，第一个峰的保留时间为15.60 min，其对应的重均分子量（Mw）和数均分子量（Mn）分别为370.27和45.91 kDa；而在19.60 min时出现第二个峰，其对应的Mw和Mn分别是1.17和0.88 kDa；按照峰面积比和仪器自带软件ASTRA7.3.2计算得到WSP的平均Mw为353.73 kDa，平均Mn为31.16 kDa，分散指数（PDI=Mw/Mn）为11.35。Zhou等[17]从山楂、苹果、桃子和胡萝卜中分别提取水溶性果胶，发现这四者的Mw分别是80.6、128、396和198 kDa，Li等[22]从秋葵茎中提取的水溶果胶其Mw为178.4 kDa，本研究中WSP的分子量与桃子中可溶性果胶的分子量接近。
表 3 WSP的分子量分布Table 3. The molecular weight distribution of WSP平均值 峰1 峰2 重均分子量
Mw（kDa）数均分子量
Mn（kDa）多分散指数
PDI（Mw/Mn）重均分子量
Mw（kDa）数均分子量
Mn（kDa）多分散指数
PDI（Mw/Mn）峰面积
（%）重均分子量
Mw（kDa）数均分子量
Mn（kDa）多分散指数
PDI（Mw/Mn）峰面积
（%）353.73 31.16 11.35 370.27 45.91 8.07 95.52 1.17 0.88 1.33 4.48 2.2 可溶性青梅果胶（WSP）红外光谱特征及酯化度
WSP的FTIR光谱见图3A。由图3A可以观察到在3500~2900 cm−1处有一个大的包峰，该峰对应的是羟基和羧基的O-H伸缩振动峰，由于氢键作用而形成了宽峰。在1736.89 cm−1处的吸收是由甲基酯化羧基的C=O伸缩振动引起的，而1637.45 cm−1处的吸收峰是由游离羧基的C=O伸缩振动引起的，在1529.17 cm−1处存在芳香环振动峰。在950~1200 cm−1之间的吸收区中存在强烈的峰，可能是由于与糖苷键和吡喃环相关的振动所致[26]。通过计算1736.89 cm−1（COO-R）的峰面积与1637.45 cm−1（COO-）的峰面积之和的比值[27]，可以得到WSP的酯化度为18.89%，属于低酯果胶。
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图 3 WSP的傅里叶红外光谱（A）和X-射线衍射（B）Figure 3. Fourier transforms infrared spectrum (FTIR) (A) and X-ray diffraction (XRD) (B) of WSP2.3 可溶性青梅果胶（WSP）的形貌特征
为了分析WSP的形貌特征，本研究采用X-射线衍射（XRD）和扫描电镜（SEM）对其进行了测定，结果分别见图3B和图4。XRD（图3B）结果显示，WSP在21.78°处显示出非常细小的尖峰，其余地方无明显的峰，因此可以判断它是含有少量微晶的无定型结构。
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图 4 WSP的扫描电镜注：A：放大倍数×0.5 k；B：放大倍数×1.5 k。Figure 4. Scanning electron microscope (SEM) of WSP图4A和4B是用扫描电镜在不同放大倍数下测得的WSP的表面形态，由图4A可以看到，WSP表面是丝状和片状交联的结构，为非晶型结构，与Pan等[28]从甜瓜中提取的水溶性果胶形态相似。放大后可以观察到表面有少量凹凸的颗粒（图4B），与XRD测得有少量微晶结构的结果一致。
2.4 可溶性青梅果胶（WSP）对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响
MTT法对细胞存活率的测定结果如图5所示，WSP在50~200 μg/mL范围内不会对RAW264.7细胞存活率产生影响，而当果胶浓度为500 μg/mL时，RAW264.7细胞的存活率显著降低（P<0.05）。因此选取50、100和200 μg/mL作为WSP的低中高三个浓度进行后续实验。
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图 5 WSP对LPS诱导RAW264.7细胞存活率的影响注：与LPS组比，#P<0.05。Figure 5. Effect of WSP on viability of LPS-induced RAW264.7 cells2.5 可溶性青梅果胶（WSP）对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的影响
脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作用于细胞表面会促进大量的细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β等的释放，导致炎症细胞浸润，而IL-10是一种重要的抗炎因子，它可以拮抗其他细胞因子（如TNF-α、IL-6）的促炎作用，从而控制炎症[29]。本研究采用ELISA法测定细胞培养液中细胞因子水平，探究WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的缓解作用，结果见图6。由图6可以看到，LPS刺激下RAW264.7细胞的TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的释放量分别由正常组的5.62±0.06 ng/mL，69.01±4.43 pg/mL，15.75±9.17 pg/mL和116.99±1.74 pg/mL增加至39.02±2.55 ng/mL，274.22±1.77 pg/mL，386.79±31.97 pg/mL和521.24±12.57 pg/mL，即RAW264.7细胞在LPS诱导作用下产生了较强的炎症反应。而用WSP预处理显著抑制了促炎因子TNF-α（P<0.05）、IFN-γ（P<0.05）和IL-6（P<0.001）的产生，促进抗炎因子IL-10的分泌（P<0.01），并具有剂量依赖关系，说明WSP可显著缓解LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症。研究表明果胶的抗炎活性与其酯化度相关[30]，与高酯果胶相比，低酯果胶具有更好的抗炎活性[31-32]。前面的分析表明，WSP属于低酯果胶，其酯化度仅为18.89%，因此WSP的结构有利于其发挥抗炎活性。
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图 6 WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达水平的影响注：与正常组比，****P<0.0001；与LPS组比，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001，####P<0.0001；（A）TNF-α ；（B）IFN-γ；（C）IL-6和（D）IL-10。Figure 6. The effect of WSP on the expression of inflammatory factorsin LPS-induced RAW264.7 cells2.6 可溶性青梅果胶（WSP）对LPS诱导的RAW264.7细胞JAK/STAT通路的影响
JAK/STAT信号通路参与调节多种生物功能[33]。JAK家族中JAK1、JAK2、JAK3和STAT家族成员中的STAT1，STAT2和STAT3与炎症反应密切相关[34]。在本研究中，首先考察了WSP对JAK1、JAK2、JAK3及STAT1，STAT2和STAT3的mRNA表达的影响。从图7可以看到，LPS处理后上述mRNA的表达量明显下调。与LPS组相比，高浓度组（200 μg/mL）WSP预处理可显著上调RAW264.7细胞上述所有JAK及STAT的mRNA表达（P<0.01）。在低浓度WSP（50 μg/mL）的处理条件下，仅JAK1（P<0.001）和STAT3（P<0.05）的mRNA的相对表达量显著上调，而JAK2、3和STAT1、2的mRNA表达与LPS组相比无显著性差异（P>0.05）。该结果表明，WSP可调控JAK/STAT信号转导，其中对JAK1和STAT3的影响最为显著。
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图 7 WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞JAK/STAT通路相关基因mRNA含量表达的影响注：与正常组比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,****P<0.0001；与LPS组比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001；（A）JAK1；（B）JAK2；（C）JAK3；（D）STAT1；（E）STAT2和（F）STAT3。Figure 7. Effect of WSP on the mRNA expression of the genes related to JAK/STAT pathway in LPS-induced RAW264.7 cells2.7 可溶性青梅果胶（WSP）对LPS诱导的RAW264.7细胞JAK1/STAT3蛋白磷酸化的影响
根据文献报道，细胞因子IL-6、IL-10及IFN-γ会激活JAK/STAT信号通路，诱导JAK的磷酸化以及JAK介导的受体磷酸化，促进非活化状态的STAT单体变为磷酸化的STAT二聚体，加剧炎症反应[35]，抑制JAK和STAT磷酸化水平可缓解炎症[36]。磷酸化JAK与JAK表达量的比值（p-JAK1/JAK1）及磷酸化STAT与STAT表达量的比值（p-STAT/STAT）分别反映了细胞内JAK和STAT由非活化状态向磷酸化状态转化的程度，即磷酸化水平[37]。结合JAK家族和STAT家族成员的mRNA表达量结果，重点考察了WSP对LPS诱导的细胞内JAK1和STAT3磷酸化水平的影响。蛋白印迹法结果如图8所示，以β-actin作为内参蛋白，与正常对照组相比，LPS刺激后细胞内P-JAK1/JAK1比值显著升高（P<0.001）（图8A）；与此同时，P-STAT3/STAT3比值也显著升高（P<0.01）（图8B）。这是因为当LPS作用于细胞膜后，会导致膜上受体传递相应的信号给JAK蛋白，从而活化JAK，使JAK蛋白磷酸化，导致STAT蛋白的磷酸化[33]。当WSP预处理浓度为100和200 μg/mL时，与LPS诱导的细胞内p-JAK1/JAK1和p-STAT3/STAT3相比均显著降低（P<0.05）。该结果进一步表明，WSP可通过下调巨噬细胞内炎症信号的JAK1和STAT3磷酸化水平而抑制LPS诱导的炎症。
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图 8 WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞中p-JAK1、JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表达的影响注：与空白组相比，**P<0.01，***P<0.001；与LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01；（A）p-JAK1/JAK1相对表达量；（B）p-STAT3/STAT3相对表达量；（C）p-JAK 1和JAK 1蛋白印迹条带；（D）p-STAT3和STAT 3蛋白印迹条带；β-actin为内参蛋白。Figure 8. Effect of WSP on the expression of p-JAK1, JAK1, p-STAT3 and STAT3 protein in LPS-induced RAW264.7 cells3. 结论
本研究从青梅果汁中提取了可溶性青梅果胶（WSP），确定了WSP是酯化度为18.89%的低酯果胶，其中性糖以半乳糖含量最高（18.36%±0.42%），其次是阿拉伯糖（6.31%±0.17%）和鼠李糖（4.63%±0.01%），结构域HG和RG-I的组成分别为65.09%和33.93%。通过构建LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，发现WSP可显著抑制促炎因子TNF-α（P<0.05）、IFN-γ（P<0.05）和IL-6（P<0.001）的释放，促进抗炎因子IL-10（P<0.01）的分泌，对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症起到有效的缓解作用。机理研究表明，WSP是通过上调LPS诱导的RAW264.7细胞内炎症相关的JAK/STAT信号通路中JAK和STAT家族mRNA的表达，降低JAK和STAT家族相关蛋白的磷酸化水平而发挥抗炎作用。本研究可为全面评价青梅的健康促进作用和提高青梅加工产品附加值提供参考。要深入了解WSP的抗炎机制，还需要进一步研究比较WSP对其它信号通路如NF-κB和MAPK信号通路的影响。
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图 1 WSP中单糖PMP衍生物的高效液相色谱图
注：A：单糖标品；B：WSP水解产物；1-PMP衍生剂，2-甘露糖，3-鼠李糖，4-葡萄糖醛酸，5-半乳糖醛酸，6-葡萄糖，7-半乳糖，8-阿拉伯糖，9-果糖。
Figure 1. High performance liquid chromatogram of monosaccharide PMP derivate of WSP
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图 3 WSP的傅里叶红外光谱（A）和X-射线衍射（B）
Figure 3. Fourier transforms infrared spectrum (FTIR) (A) and X-ray diffraction (XRD) (B) of WSP
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图 4 WSP的扫描电镜
注：A：放大倍数×0.5 k；B：放大倍数×1.5 k。
Figure 4. Scanning electron microscope (SEM) of WSP
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图 5 WSP对LPS诱导RAW264.7细胞存活率的影响
注：与LPS组比，#P<0.05。
Figure 5. Effect of WSP on viability of LPS-induced RAW264.7 cells
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图 6 WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达水平的影响
注：与正常组比，****P<0.0001；与LPS组比，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001，####P<0.0001；（A）TNF-α ；（B）IFN-γ；（C）IL-6和（D）IL-10。
Figure 6. The effect of WSP on the expression of inflammatory factorsin LPS-induced RAW264.7 cells
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图 7 WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞JAK/STAT通路相关基因mRNA含量表达的影响
注：与正常组比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001,****P<0.0001；与LPS组比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001；（A）JAK1；（B）JAK2；（C）JAK3；（D）STAT1；（E）STAT2和（F）STAT3。
Figure 7. Effect of WSP on the mRNA expression of the genes related to JAK/STAT pathway in LPS-induced RAW264.7 cells
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图 8 WSP对LPS诱导的RAW264.7细胞中p-JAK1、JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表达的影响
注：与空白组相比，**P<0.01，***P<0.001；与LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01；（A）p-JAK1/JAK1相对表达量；（B）p-STAT3/STAT3相对表达量；（C）p-JAK 1和JAK 1蛋白印迹条带；（D）p-STAT3和STAT 3蛋白印迹条带；β-actin为内参蛋白。
Figure 8. Effect of WSP on the expression of p-JAK1, JAK1, p-STAT3 and STAT3 protein in LPS-induced RAW264.7 cells
表 1 内参β-actin和JAK/STAT通路相关基因引物序列
Table 1 The sequence of the primer of reference β-actin and relative genes in JAK/STAT pathway
基因 上游引物 下游引物 β-actin 5'-ATGTGGATCAGCAAGCAGG-3' 5'-GTCAAAGAAAGGGTGTAAAACG-3' JAK1 5'-ATGCCCACCATTACCTCTGT-3' 5'-ATCCCCTCTTCACTCCCTTC-3' JAK2 5'-CATAGACGAGTCAACCAGGCA-3' 5'-AAAGTCATCAAGCAGAGGAGC-3' JAK3 5'-GGAGGTCGTGGATGGTGAGA-3' 5'-GCGGGTAGGATACTTGGCT-3' STAT1 5'-AACCTTCCTCCTCTTCCAGC-3' 5'-CAATTTCACCAACAGTCTCAGC-3' STAT2 5'-ACATCACAACCAACGAAAACC-3' 5'-GAGTCCATCCCAAGAGTCCA-3' STAT3 5'-GGAGCAGAGATGTGGGAATG-3' 5'-CAACTGGCAAGGAGTGGGT-3' 
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表 2 WSP的单糖和结构域组成
Table 2 Monosaccharide and region constitution of WSP
单糖组成（%） 结构域组成（%）A 半乳糖醛酸
（GalA）半乳糖
（Gal）阿拉伯糖
（Ara）鼠李糖
（Rha）葡萄糖
（Glc）甘露糖
（Man）葡萄糖醛酸
（Gluc）同型半乳糖醛酸聚糖
（HG）鼠李半乳糖醛酸聚糖I
（RG-I）69.72±0.38 18.36±0.42 6.31±0.17 4.63±0.01 1.25±0.04 0.32±0.03 0.15±0.021 65.09 33.93 A注：HG（同型半乳糖醛酸聚糖）=GalA-Rha；RG-I（鼠李半乳糖醛酸聚糖I）=2Rha+Ara+Gal。
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表 3 WSP的分子量分布
Table 3 The molecular weight distribution of WSP
平均值 峰1 峰2 重均分子量
Mw（kDa）数均分子量
Mn（kDa）多分散指数
PDI（Mw/Mn）重均分子量
Mw（kDa）数均分子量
Mn（kDa）多分散指数
PDI（Mw/Mn）峰面积
（%）重均分子量
Mw（kDa）数均分子量
Mn（kDa）多分散指数
PDI（Mw/Mn）峰面积
（%）353.73 31.16 11.35 370.27 45.91 8.07 95.52 1.17 0.88 1.33 4.48
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