Inhibitory Effects of Enterococcus faecalis Z096 on Biofilm and Quorum Sensing of Vibrio parahaemolyticus
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摘要: 为了研究粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜和群体感应（quorum sensing，QS）系统的抑制作用，采用竞争、清除、排阻三种方式模拟Z096与副溶血弧菌在微菌落环境中的相互作用，并进一步探究了Z096的提取物（Z096-E）对副溶血弧菌生物被膜形成、成熟生物被膜清除、细胞表面疏水性、自聚性、QS信号分子AI-2活性、群集泳动能力以及胞外多糖和蛋白合成的影响。结果表明：Z096可通过竞争、清除、排阻的方式与副溶血弧菌相互作用，降低浮游和生物被膜状态的副溶血弧菌细胞数量，干扰副溶血弧菌在载体表面的粘附，且Z096-E能够显著抑制副溶血弧菌生物被膜形成，有效清除成熟生物被膜，1.6 mg/mL的Z096-E处理12 h，副溶血弧菌生物被膜抑制率为70.43%，代谢活性减少率为84.15%；12.8 mg/mL的Z096-E处理副溶血弧菌成熟生物被膜4 h，生物被膜清除率为58.21%，代谢活性减少率为69.84%。而且1.6 mg/mL的Z096-E对副溶血弧菌群集和泳动能力、细胞表面疏水性和自聚性、胞外多糖和蛋白合成的抑制率分别为47.26%、53.56%、63.37%、89.38%、77.65%和51.91%，抑制效果具有浓度依赖性。此外，Z096-E可使副溶血弧菌QS信号分子AI-2活性减弱，表明Z096-E是一种AI-2类群体感应抑制剂，其可通过干扰QS系统，从而影响副溶血弧菌的生理特性。因此，本研究发现了一株能够抑制副溶血弧菌生物被膜的乳酸菌，其提取物Z096-E能作为一种防控副溶血弧菌生物被膜的新型乳酸菌生物制剂，这对消除致病菌生物被膜污染以及开发新型抗菌剂具有积极的作用。Abstract: To study the inhibitory effects of Enterococcus faecalis Z096 on the biofilm and quorum sensing (QS) system of Vibrio parahaemolyticus, the competition, elimination and exclusion were performed to simulate the interaction between Z096 and V. parahaemolyticus in microbial communities. In addition, the effects of Z096 extract (Z096-E) on V. parahaemolyticus biofilm formation, mature biofilm elimination, cell surface hydrophobicity, auto-aggregation, QS signal molecule AI-2 activity, motility ability (swarming and swimming), extracellular polysaccharide and protein synthesis were further explored. The results showed that Z096 could significantly reduce the number of V. parahaemolyticus cells in plankton and biofilm by competition, elimination and exclusion, and interfere with the adhesion of V. parahaemolyticus on the carrier surface. Moreover, Z096-E could significantly inhibit biofilm formation and effectively eliminate the mature biofilm of V. parahaemolyticus. When treated with 1.6 mg/mL of Z096-E for 12 h, the biofilm inhibition rate was 70.43%, and the metabolic activity decreased by 84.15%; When the mature biofilm of V. parahaemolyticus was treated with 12.8 mg/mL of Z096-E for 4 h, the biofilm removing rate was 58.21%, and the metabolic activity decreased by 69.84%. The swarming and swimming ability, cell surface hydrophobicity and auto-aggregation, extracellular polysaccharide and protein synthesis of V. parahaemolyticus were inhibited by 1.6 mg/mL of Z096-E by 47.26%, 53.56%, 63.37%, 89.38%, 77.65% and 51.91%, respectively, and the inhibitory effect was dose-dependent. In addition, Z096-E weakened the activity of QS signal molecule AI-2 of V. parahaemolyticus, indicating that Z096-E was an AI-2 quorum sensing inhibitor, which could affect the physiological characteristics of V. parahaemolyticus by interfering with the QS system. Therefore, we found one strain of lactic acid bacteria (LAB) that could inhibit V. parahaemolyticus biofilm, and the Z096-E could be used as a novel LAB-based biological agent to prevent and control V. parahaemolyticus biofilm. This study would be of positive significance to eliminate V. parahaemolyticus biofilm pollution and develop novel antibacterial agents.
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Keywords:
- Enterococcus faecalis /
- Vibrio parahaemolyticus /
- inhibitory effects /
- biofilm /
- quorum sensing
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副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为革兰氏阴性兼性厌氧菌，通常分布于沿海地区，如海水、海鲜产品中，也常见于盐渍类食品中，是我国沿海区域最常见的食源性致病菌[1]。感染副溶血弧菌会出现腹痛、腹泻、恶心、呕吐、痉挛等症状，严重时会出现脱水、休克，甚至死亡[2]。副溶血弧菌的高致病性与其产生多种毒力因子有关，其主要的毒力因子包括溶血性毒素、Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion systems，T3SS）、Ⅵ型分泌系统（Type Ⅵ secretion systems，T6SS）、胞外蛋白酶、粘附因子和脂多糖等[3-4]。在世界范围内，副溶血弧菌引起的食物中毒事件位居微生物食物中毒事件的首位，严重威胁着人类生命健康安全。
在食品加工过程中，副溶血弧菌能够在玻璃、瓷砖、不锈钢、塑料和聚合物涂层管道上形成生物被膜[5]。许多研究表明，浮游菌体一旦形成生物被膜后，细菌对传统抗生素的抵抗能力最高可提升至1000倍，这是因为细菌生物被膜产生的胞外多聚物基质（多糖、蛋白质、脂质、DNA）可以形成一道保护屏障[6]。当生物被膜细胞暴露于营养缺乏、抗菌剂、高盐度、缺氧、低温等恶劣环境中时依然能够正常生长和繁殖，这使得致病菌的防治变得更为困难[7]。群体感应（quorum sensing，QS）是细菌利用信号分子进行信息交流的一种方式，通过分泌特定的信号分子如autoinducer（AI）调控细菌群体的生理特征，如生物被膜形成、菌体运动、毒素分泌等[8-9]。副溶血弧菌的QS信号分子主要是AI-2（呋喃基硼酸二酯类化合物），主要由lux S基因编码产生[10]。因此，通过干扰致病菌QS系统，阻止信号分子的产生和积累或阻止其被受体蛋白识别和结合，就能达到防治致病菌生物被膜和毒素的效果[11]。
目前，在医疗卫生、食品加工等领域防控致病菌污染的主要方式是使用消毒剂和抗生素，然而消毒剂并不能彻底地清除致病菌生物被膜，而且抗生素的长期使用也极易造成耐药菌株的产生[12]。因此，开发新型抗菌剂以及探寻新型致病菌防治策略显得尤为重要。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品工业、医疗保健行业、饲料产业以及化妆品行业等广泛使用的公认安全性（generally recognized as safe，GRAS）菌[13]。乳酸菌能够在肠道内定植，增强肠道屏障，并且其代谢产生的有机酸、生物表面活性剂、细菌素、胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）等对致病菌及其生物被膜具有很强的拮抗作用[14]，如YAN等[15]从乳酸片球菌27167和植物乳杆菌27172的发酵液中提取得到的生物表面活性剂有效抑制金黄色葡萄球菌在聚苯乙烯载体表面的粘附，破坏生物被膜致密完整的结构，而且对QS信号分子AI-2活性也具有良好的淬灭作用；黄湘湄等[16]从海洋源乳酸菌中分离得到一株淬灭单增李斯特菌QS信号分子AI-2活性的戊糖乳杆菌zy-B-1，发现其乙酸乙酯提取物能够显著抑制单增李斯特菌生物被膜的形成，降低鞭毛的运动能力。值得注意的是，目前有关乳酸菌对常见食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等生物被膜的拮抗作用及淬灭其QS的研究比较丰富，但对副溶血弧菌在相关方面的研究相对匮乏。因此，本文以副溶血弧菌为研究对象，考察粪肠球菌Z096乙酸乙酯提取物对其生物被膜及QS调控系统的抑制效果，为防控致病菌生物被膜形成以及开发新型抗菌剂提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC17802 广东微生物菌种保藏中心；粪肠球菌Z096 由本实验室从内蒙古开菲尔中分离；结晶紫、酸水解酪蛋白 麦克林生化科技有限公司；L-精氨酸 上海源叶生物科技有限公司；乙酸乙酯、二甲苯、浓硫酸、冰乙酸、苯酚、丙酮、NaCl、葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温−80、甘油 广州化学试剂厂；TCBS培养基、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉 广东环凯微生物科技有限公司；XTT、甲萘醌 生工生物工程（上海）股份有限公司；Bradford蛋白质浓度测定试剂盒 索莱宝生物科技有限公司；TSB培养基：胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 15 g，pH7.2，蒸馏水1000 mL，121 ℃灭菌15 min；MRS培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾1.52 g，乙酸钠3.53 g，柠檬酸三铵2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.038 g，吐温−80 1.0 mL，蒸馏水1000 mL，pH6.0，121 ℃灭菌15 min；AB培养基：硫酸镁12.3 g，NaCl 17.5 g，酸水解酪蛋白2 g，蒸馏水1000 mL，氢氧化钾溶液调节pH7.5，121 ℃灭菌15 min后添加10 mL 1 mol/L无菌磷酸氢二钾溶液（pH7.5）及10 mL 0.1 mol/L L-精氨酸溶液（pH7.5），20 mL 50%甘油。
Forma ClassⅡ A2生物安全柜、Multiskan FC酶标仪 Thermo公司；R1001-VN旋转蒸发仪 郑州长城科工贸公司；SP-02型生化培养箱 恒丰医疗器械有限公司；TS-200B摇床 上海天呈科技公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；Bioscreen C全自动生长曲线仪 芬兰Biosrceen。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株活化
粪肠球菌Z096接种于5 mL的MRS培养基中，37 ℃静置培养12 h。副溶血弧菌接种于5 mL 3% NaCl-TSB培养基中，并置于摇床中37 ℃，150 r/min培养12 h。哈维氏弧菌BB170接种于5 mL AB培养基中，置于摇床中30 ℃培养12 h。上述菌株均按上述液体培养方法活化3代后使用。
1.2.2 Z096对副溶血弧菌生物被膜的影响
参考MARIANA等[17]和WOO等[18]的方法并稍作改动，以竞争、清除、排阻试验来模拟微菌落环境中乳酸菌与副溶血弧菌的相互作用。
1.2.2.1 竞争试验
在24孔板中，加入2 mL TSB培养基（含副溶血弧菌终浓度106 CFU/mL、Z096终浓度108 CFU/mL），37 ℃静置培养2 d，在8、16、24、32、48 h时间点，平板计数法测定浮游态和生物被膜态副溶血弧菌菌体数量。
1.2.2.2 清除试验
在24孔板中加入2 mL 3% NaCl-TSB培养基（含副溶血弧菌终浓度106 CFU/mL），37 ℃静置培养48 h形成成熟生物被膜，弃菌液，用无菌生理盐水洗涤生物被膜3次，加入2 mL TSB培养基（含Z096终浓度108 CFU/mL），培养和计数方法同上。
1.2.2.3 排阻试验
在24孔板中，加入2 mL MRS培养基（含Z096终浓度106 CFU/mL），37 ℃静置培养24 h形成成熟生物被膜。弃菌液，用无菌生理盐水洗涤生物被膜3次，加入2 mL TSB培养基（含副溶血弧菌终浓度106 CFU/mL），培养和计数方法同上。
1.2.3 Z096乙酸乙酯提取物（Z096-E）的制备
将活化后的Z096菌液以2%接种到MRS液体培养基，37 ℃静置培养24 h后，冷冻离心（4 ℃，12000 r/min，10 min），将上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得到Z096无细胞上清液，选取乙酸乙酯作为萃取剂，将无细胞上清液与乙酸乙酯等体积混合，置于摇床（150 r/min，2 h），随后将混合液置于分液漏斗中静置2 h，收集有机相，重复上述的操作3次。将3次萃取获得的有机相合并后经旋转蒸发除去有机相，用无菌水复溶后得到Z096-E。
1.2.4 Z096-E对副溶血弧菌及哈维氏弧菌生长的影响
全自动生长曲线仪测定乳酸菌Z096-E对副溶血弧菌和哈维氏弧菌生长的影响。在100孔微型板中分别加入200 μL含Z096-E浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的3% NaCl-TSB培养基或AB培养基，将活化后的副溶血弧菌或哈维氏弧菌接入孔内（终浓度106 CFU/mL），37 ℃下培养24 h，每隔2 h测定一次OD600 nm。
1.2.5 Z096-E对副溶血弧菌生物被膜形成的影响
采用结晶紫染色法测定生物被膜的生物量[6]，在96孔板中分别加入200 μL含Z096-E浓度为0、0.4、0.8、1.6 mg/mL的3% NaCl-TSB培养基，将活化后的副溶血弧菌接入孔内（终浓度106 CFU/mL），37 ℃下分别培养12、24、48 h后，弃菌液，用无菌生理盐水轻缓洗涤2次。将孔板置于60 ℃烘箱中固定30 min。固定完成后，每孔中加入200 μL 0.1%的结晶紫溶液，染色5 min后，用无菌生理盐水清洗3次，干燥30 min。在孔中加入200 μL 33%的冰乙酸，脱色10 min后，用酶标仪测定OD595 nm，按照式（1）计算抑制率。
采用XTT法测定生物被膜的代谢活性[6]，副溶血弧菌在96孔板中37 ℃下分别培养12、24、48 h后，移除菌液，用100 μL无菌PBS轻缓清洗2次，每孔加入100 μL无菌PBS缓冲液和13.5 μL的XTT-甲萘醌混合液（12.5:1），轻轻振动孔板，在37 ℃避光孵育2~3 h，用酶标仪测定OD450 nm，按照式（1）计算代谢活性减少率。
抑制率或代谢活性减少率(%)=OD对照组−OD处理组OD对照组×100 (1) 式中：OD对照组为未用Z096-E处理（Z096-E浓度为0 mg/mL）的生物被膜；OD处理组为Z096-E处理后的生物被膜。
1.2.6 Z096-E对副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用
在96孔板中加入200 μL 3% NaCl-TSB培养基（含副溶血弧菌终浓度106 CFU/mL），37 ℃下培养48 h使其形成成熟生物被膜。培养结束后除去孔中的菌液，用200 μL无菌生理盐水轻缓清洗2次，去除浮游菌体。再在孔中加入200 μL含Z096-E浓度为0、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/mL的生理盐水，37 ℃下分别孵育1、2、4 h，按照1.2.5中的结晶紫染色法和XTT法分别测定生物被膜的生物量及代谢活性，计算清除率。
清除率(%)=OD对照组−OD处理组OD对照组×100 (2) 式中：OD对照组为未用Z096-E处理的生物被膜；OD处理组为Z096-E处理后的生物被膜。
1.2.7 Z096-E对副溶血弧菌群集和泳动的影响
参照上官文丹等[14]的方法进行。在含有0、0.4、0.8、1.6 mg/mL Z096-E的群集和泳动培养基平板的中央，加入2 μL活化三代的副溶血弧菌菌液。37 ℃正置培养24 h后，观察菌株的迁移情况，并用游标卡尺测量群集、泳动平板中，副溶血弧菌的群集或泳动直径。
1.2.8 Z096-E对副溶血弧菌细胞表面疏水性和自聚性的影响
细胞表面疏水性和自聚性的测定参考SALAHEEN等[19]的方法进行，并稍作改动。将活化三代的副溶血弧菌接种于含0、0.4、0.8、1.6 mg/mL Z096-E 3% NaCl-TSB培养基中（含副溶血弧菌终浓度106 CFU/mL），37 ℃培养24 h。培养完成后，在4 ℃、8000 r/min下离心10 min，收集沉淀，用无菌PBS（pH7.2）洗涤2次并重悬菌液，测量OD595 nm，记作H0。将菌液与二甲苯等体积混合，彻底振荡3 min后，室温静置10 min，测定水相的OD595 nm，记作Ht，并计算疏水性。
疏水性(%)=H0−HtH0×100 (3) 式中：H0为加入二甲苯前PBS菌悬液的OD595 nm；Ht为加入二甲苯后水相的OD595 nm。
将上述培养的副溶血弧菌菌液离心收集菌体，用无菌PBS（pH7.2）洗涤2次并重悬菌液，并测量OD595 nm，记作A0。然后，将菌悬液涡旋混匀后，在37 ℃静置孵育2 h，测定菌液OD595 nm，记作At，并计算自聚性。
自聚性(%)=A0−AtA0×100 (4) 式中：A0为静置孵育前PBS菌悬液的OD595 nm；At为静置孵育后PBS菌悬液的OD595 nm。
1.2.9 Z096-E对副溶血弧菌信号分子AI-2活性的影响
采用哈维氏弧菌BB170生物发光法测定信号分子AI-2活性[20]。将活化三代的副溶血弧菌接种于含0、0.4、0.8、1.6 mg/mL Z096-E的3% NaCl-TSB培养基中（终浓度106 CFU/mL），37 ℃，150 r/min，培养24 h，6000 r/min离心5 min，0.22 μm滤膜过滤，收集无细胞上清液。同时，将活化三代的BB170菌液的OD595 nm调节为0.8左右，用AB培养基按1:5000的比例稀释该菌液，混匀备用。按1:50的比例将收集的无细胞上清液与BB170稀释菌液混合，30 ℃，100 r/min孵育3 h，然后取200 μL于黑色不透明酶标板中，用多功能酶标仪的化学发光模式检测BB170的发光情况，并计算抑制率。
抑制率(%)=(1−Z096−E处理组的发光值未处理组的发光值)×100 (5) 1.2.10 Z096-E对副溶血弧菌胞外多聚物的影响
按照ZHANG等[21]的方法并稍作修改进行。在24孔板中加入2 mL含不同浓度Z096-E（0、0.4、0.8、1.6 mg/mL）的3% NaCl-TSB，每孔以2%接种量接种副溶血弧菌（终浓度为106 CFU/mL），加入无菌盖玻片（14 mm×14 mm），37 ℃培养24 h，取出盖玻片置于试管中，加入1 mL生理盐水，振荡洗脱30 s，超声处理30 min，再振荡30 s，置于1.5 mL离心管中，4000 r/min离心30 min，收集上清液，过0.22 μm滤膜。
苯酚-硫酸法测定胞外多糖的含量。取0.5 mL上述所制备的上清液于试管中，加入0.5 mL 5%苯酚，混合振荡15 s后加入2.5 mL浓H2SO4，避光反应10 min，振荡10 s后放入25 ℃水浴中孵育10 min，孵育完成后测定OD490 nm，按照式（1）计算抑制率。
考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。在96孔板中加入20 µL上述制备的上清液，然后再各添加200 µL的G-250染料，将孔板于室温下放置5 min后测定OD595 nm，按照式（1）计算抑制率。
1.3 数据处理
每组实验重复三次，实验数据以平均值±标准偏差（Means±SD）表示，利用GraphPad Prism 8.0绘图，以SPSS 25.0进行ANOVA方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 Z096对副溶血弧菌生物被膜的影响
在微菌落环境中，乳酸菌通过竞争、清除、排阻的方式与副溶血弧菌相互作用，干扰副溶血弧菌在介质表面的定殖和生物被膜的形成。与对照组相比，Z096能够明显降低副溶血弧菌浮游细胞和生物被膜细胞的数量（图1）。在竞争试验中，副溶血弧菌与Z096共培养48 h后，浮游细胞和生物被膜细胞数量分别减少0.69、1.37 lg CFU/mL（图1A）。相似地，SHANGGUAN等[22]发现在干酪乳杆菌L10与副溶血弧菌共培养的体系中，干酪乳杆菌能够有效阻止副溶血弧菌在介质表面粘附，可使培养体系中浮游状态和生物被膜状态的副溶血弧菌菌体数量减少约1.5个数量级。在清除实验中，副溶血弧菌成熟生物被膜中加入Z096处理48 h后，浮游细胞和生物被膜细胞数量分别降低1.29、0.52 lg CFU/mL（图1B）。在排阻试验中，Z096明显干扰副溶血弧菌在介质表面的定殖，处理48 h后，浮游细胞和生物被膜细胞的数量分别下降1.01、1.48 lg CFU/mL（图1C）。亦有研究报道乳酸菌生物被膜的形成阻碍了食源性致病菌在载体表面的定植，如MARIANA等[17]利用清酒乳杆菌CRL1862在不锈钢和聚苯乙烯表面预先形成成熟生物被膜，显著降低了培养体系中单增李斯特菌浮游菌和生物被膜菌的数量。此外，WOO等[18]报道了副干酪乳杆菌KACC 12427在排阻实验中可使单增李斯特菌和沙门氏菌生物被膜中的菌体数量降低2个数量级，但其对两种致病菌生物被膜的清除效果均不明显。
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图 1 粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜的影响注：A-竞争、B-清除、C-排阻；P-VP为副溶血弧菌浮游状态；B-VP为副溶血弧菌生物被膜状态。Figure 1. Effects of Enterococcus faecalis Z096 on biofilm of V. parahaemolyticus2.2 Z096-E对副溶血弧菌和哈维氏弧菌生长的影响
由图2A所示，副溶血弧菌的生长趋势随着Z096-E浓度的增加而逐步下降，呈浓度依赖效应，当Z096-E浓度≥1.8 mg/mL时，副溶血弧菌的生长完全被抑制。图2B表明，在Z096-E处理的浓度范围内，哈维氏弧菌BB170的生长基本不受影响，这一结果确保了后续采用哈维氏弧菌BB170生物发光法测定信号分子AI-2活性的准确性。
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图 2 Z096-E对副溶血弧菌（A）和哈维氏弧菌（B）生长的影响Figure 2. Effects of Z096-E on the growth of V. parahaemolyticus (A) and Vibrio harvey (B)2.3 Z096-E对副溶血弧菌生物被膜形成的影响
图3显示Z096-E对副溶血弧菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用，且抑制作用强度与Z096-E的浓度成正相关。0.8和1.6 mg/mL的Z096-E处理12 h，其对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制率分别为43.50%和70.43%，代谢活性减少率分别为81.92%和84.15%；当处理24 h时，Z096-E对副溶血弧菌生物被膜的形成仍然具有良好的抑制效果，其对生物被膜形成的抑制率分别为38.27%和55.30%，代谢活性减少率分别为46.66%和61.20%，然而随着处理时间的进一步延长，其对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制效果减弱。这一现象与WASFI等[23]的研究结果一致，他们考察了四株益生性乳杆菌对变异链球菌生物被膜的影响，发现乳酸菌发酵上清液对变异链球菌生物被膜生物量和代谢活性抑制作用随处理浓度的增加而增大，但延长处理时间后抑制作用相对减弱。
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图 3 Z096-E对副溶血弧菌生物被膜生物量（A）和代谢活性（B）的影响注：不同小写字母表示同一时间不同浓度间差异显著（P<0.05），图4同。Figure 3. Effects of Z096-E on biofilm biomass (A) and metabolic activity (B) of V. parahaemolyticus2.4 Z096-E对副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用
Z096-E作用于副溶血弧菌成熟生物被膜后的处理效果呈现在图4中。加入梯度浓度的Z096-E处理成熟生物被膜1 h的清除效果总体偏低，而处理2 h后，6.4和12.8 mg/mL的Z096-E对副溶血弧菌成熟生物被膜的清除率分别可达到26.23%和31.41%，代谢活性减少率分别为35.28%和56.45%，处理4 h后，两种浓度的Z096-E对副溶血弧菌成熟生物被膜的清除率分别上升至45.33%和58.21%，代谢活性减少率分别达到54.97%和69.84%。结果表明，Z096-E能有效清除副溶血弧菌成熟生物被膜，且清除率与Z096-E的浓度和作用时间呈正相关。
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图 4 Z096-E对副溶血弧菌成熟生物被膜生物量（A）和代谢活性（B）的影响Figure 4. Effects of Z096-E on biomass (A) and metabolic activity (B) of V. parahaemolyticus mature biofilm2.5 Z096-E对副溶血弧菌群集和泳动能力的影响
鞭毛是副溶血弧菌进行群集和泳动的重要运动性结构，在副溶性弧菌生物被膜形成的初期和后期都发挥着关键作用[24]。由图5A1和5B1可知，副溶血弧菌未经Z096-E处理，其群集和泳动迁移直径分别为（11.51±0.44）mm和（55.58±3.08）mm，表明副溶血弧菌具有较强的群集和泳动能力。然而，在群集和泳动平板中添加Z096-E后，副溶血弧菌群集和泳动能力显著降低（P<0.05）。当Z096-E浓度为0.4 mg/mL时，群集和泳动所形成的圆形直径与对照组相比显著减小（P<0.05），直径分别为（9.46±0.33）mm和（43.18±1.47）mm，对应抑制率分别为17.81%和22.31%（图5A2和图5B2）。当Z096-E浓度为1.6 mg/mL时，群集和泳动所形成的圆形直径分别为（6.07±0.18）mm和（25.81±1.09）mm，对应抑制率分别为47.26%和53.56%（图5A4和图5B4）。因此，Z096-E对副溶血弧菌群集和泳动的抑制呈浓度依赖作用。亦有研究发现植物乳杆菌Y42无细胞上清液可通过抑制单增李斯特菌运动能力来干扰菌体在介质表面的粘附，从而抑制单增李斯特菌生物被膜的形成[25]；戊糖乳杆菌DF9发酵上清液提取物对副溶血弧菌泳动和群集能力的抑制率分别为47.91%和39.02%，且呈现浓度依赖性的抑制作用[14]。
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2.6 Z096-E对副溶血弧菌细胞表面疏水性和自聚性的影响
食源性致病菌的自聚能力与致病菌的粘附性有关，其能使致病菌在复杂的微菌落中形成竞争优势，促进生物被膜的发育和成熟[19]。细胞表面疏水性是致病菌的毒力标记，致病菌细胞表面的粘附性和生物被膜的形成能力增强与细胞表面疏水性增强密切相关[26]。图6A结果显示，未加入Z096-E的对照组副溶血弧菌细胞表面疏水性为47.01%，当Z096-E浓度为0.8和1.6 mg/mL时，副溶血弧菌表面疏水性分别为37.16%和17.22%，显著低于对照组（P<0.05），对应抑制率分别为20.95%和63.37%。图6B结果显示，未加入Z096-E的对照组副溶血弧菌自聚性为22.6%，当Z096-E浓度为0.4、0.8和1.6 mg/mL时，副溶血弧菌自聚性分别为15.76%、9.45%和2.40%，均显著低于对照组（P<0.05），对应抑制率分别为30.27%、58.19%和89.38%。因此，Z096-E能明显降低副溶血弧菌细胞表面疏水性和自聚性，且抑制效果与处理浓度呈剂量依赖效应。这一现象与宋莹龙等[27]的研究结果一致，他们发现植物乳杆菌-12分泌的胞外多糖可使志贺氏菌细胞表面疏水性和自聚性分别降低90%和30%，且作用效果随着胞外多糖浓度的增加而增强。
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图 6 Z096-E对副溶血弧菌细胞表面疏水性（A）和自聚性（B）的影响Figure 6. Effects of Z096-E on the cell surface hydrophobicity （A） and auto-aggregation （B） of V. parahaemolyticus2.7 Z096-E对副溶血弧菌QS信号分子AI-2活性和生物被膜胞外聚合物合成的的影响
AI-2型QS系统是调控副溶血弧菌运动性和生物被膜形成的关键[28]。图7显示，Z096-E能明显抑制副溶血弧菌信号分子AI-2的产生，且抑制效果随着Z096-E处理浓度的增加而增大。3种浓度的Z096-E处理后AI-2的活性有显著性差异（P<0.05），1.6 mg/mL的Z096-E对AI-2的抑制作用最强，抑制率达70.77%，而0.8和0.4 mg/mL的Z096-E对AI-2也具有明显的抑制效果，抑制率分别为48.29%和26.55%。相似地，PELYUNTHA等[29]的研究表明从发酵葡萄中分离得到的乳酸菌对沙门氏菌毒力和生物被膜的抑制作用与降低其AI-2活性有关。
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图 7 Z096-E对副溶血弧菌AI-2活性、胞外多糖和胞外蛋白质合成的影响Figure 7. Effects of Z096-E on AI-2 activity, EPS and extracellular protein synthesis of V. parahaemolyticus胞外多糖有助于菌体的粘附和生物被膜的形成，对生物被膜复杂的空间结构具有重要的支撑作用，而且能够诱导细菌耐药性的产生[30]。胞外蛋白在细菌粘附于介质表面的过程中起到重要的作用，是促进细菌生物被膜形成的主要粘附分子[31]。ONBAS等[32]研究报道了一株植物乳杆菌F-10无细胞上清液通过降低生物被膜重要组成成分胞外多糖和蛋白的含量，从而抑制铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。而本研究发现，不同浓度的Z096-E处理后，生物被膜胞外多糖和胞外蛋白的含量有不同程度的降低，0.4 mg/mL的Z096-E对胞外多糖和胞外蛋白的抑制率分别为57.60%和42.51%，随着Z096-E处理浓度的增加，胞外多糖和胞外蛋白的含量也在逐渐降低，在1.6 mg/mL浓度下抑制率达到最高，分别为77.65%和51.91%（图7）。结果表明，Z096-E可通过抑制副溶血弧菌AI-2型群体感应系统和生物被膜重要组成成分胞外多糖和胞外蛋白的合成，从而抑制副溶血弧菌生物被膜的形成。
3. 讨论与结论
本文采用竞争、清除和排阻三种试验模拟微菌落中菌体之间的相互作用，以评估乳酸菌对致病菌生物被膜形成的抑制作用。在竞争试验中，处于浮游和生物被膜状态的副溶血弧菌菌体数量与对照组相比明显减少，这一结果与RATTI等[33]和WINKELSTROTER等[34]的研究结果一致，他们认为乳酸菌在与致病菌共培养的过程中，产生了抑制性化合物（细菌素、有机酸、生物表面活性剂等）会抑制致病菌生长，阻止致病菌在介质表面附着，甚至会促使致病菌细胞从生物被膜结构中脱离。在排阻试验中，乳酸菌在载体表面预先形成成熟生物被膜对副溶血弧菌定殖有很强的抑制效果，生物被膜状态的细胞数量显著降低，这是因为乳酸菌分泌的EPS更有利于乳酸菌在载体表面的定殖，而且EPS也可有效防止致病菌在载体表面粘附[35]。在清除试验中，副溶血弧菌生物被膜状态细胞数量的减少程度低于竞争和排阻试验，这一现象与TAHMOURESPOUR等[36]的研究结果一致。生物被膜形成的过程中，致病菌在非生物载体表面的粘附是第一阶段，因此，干扰致病菌的粘附能力是控制致病菌污染的有效策略。
乳酸菌对致病菌生物被膜的抑制作用机理，除了与致病菌对营养物质和粘附位点的争夺外，还与其自身产生的抑菌活性成分对致病菌的杀伤作用密切相关[37]。GIORDANI等[38]从格氏乳杆菌中分离出具有生物表面活性剂作用的脂质体，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有抗生物被膜作用。PRADEEPA等[39]研究报道了一株植物乳杆菌产生的胞外多糖能够抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及细胞表面疏水性，降低金葡菌对抗生素的耐药性。WANG等[40]从植物乳杆菌中分离纯化得到细菌素能够抑制地衣芽孢杆菌在不锈钢和玻璃表面形成生物被膜，为乳品加工生物被膜的防治提供了一个安全有效的策略。本文研究发现，Z096-E能够显著抑制副溶血弧菌生物被膜的形成，清除副溶血弧菌成熟生物被膜，而且对生物被膜重要组成成分胞外多糖和胞外蛋白的合成也具有很强的抑制效果。
致病菌形成的生物被膜使得消毒剂和抗生素的有效性大大降低，这给当前食品工业和医疗卫生行业带来巨大的挑战。与传统抗菌剂相比，群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSIs）以QS系统为靶点，在不杀死菌体的情况下，有效抑制致病菌生物被膜的形成及各种毒力因子的产生。CUI等[41]发现面包乳杆菌ZHG2-1发酵液乙酸乙酯提取物通过下调铜绿假单胞菌信号分子合成基因lasI/R和rhlI/R的表达，抑制生物被膜的形成及几丁质酶、绿脓杆菌素、鼠李糖脂等毒素的产生。MELIAN等[42]从弯曲乳杆菌中分离得到一种细菌素AL705，其可通过淬灭单增李斯特菌信号分子AI-2的活性，从而降低单增李斯特菌在介质表面的黏附，抑制了生物被膜的形成。研究结果表明，Z096-E浓度在低于0.8 mg/mL时基本不影响副溶血弧菌的正常生长，但其能够明显抑制副溶血弧菌生物被膜的形成、细胞表面疏水性、自聚性、群集泳动能力、AI-2活性以及胞外多糖和胞外蛋白的合成，且抑制效果与浓度呈剂量依赖效应。因此，可以推测Z096-E通过降低AI-2活性，干扰副溶血弧菌QS系统，调控鞭毛的运动性、胞外多糖和胞外蛋白的合成，从而达到抑制生物被膜形成的效果。总的来说，Z096-E对副溶血弧菌生物被膜具有很强的抑制效果，而且其能够通过干扰副溶血弧菌QS系统的方式来调控生物被膜的形成，是一种防控副溶血弧菌污染的新型生物制剂，但值得注意的是，其调控副溶血弧菌生物被膜的分子机制还需更加深入的研究。
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图 1 粪肠球菌Z096对副溶血弧菌生物被膜的影响
注：A-竞争、B-清除、C-排阻；P-VP为副溶血弧菌浮游状态；B-VP为副溶血弧菌生物被膜状态。
Figure 1. Effects of Enterococcus faecalis Z096 on biofilm of V. parahaemolyticus
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图 2 Z096-E对副溶血弧菌（A）和哈维氏弧菌（B）生长的影响
Figure 2. Effects of Z096-E on the growth of V. parahaemolyticus (A) and Vibrio harvey (B)
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图 3 Z096-E对副溶血弧菌生物被膜生物量（A）和代谢活性（B）的影响
注：不同小写字母表示同一时间不同浓度间差异显著（P<0.05），图4同。
Figure 3. Effects of Z096-E on biofilm biomass (A) and metabolic activity (B) of V. parahaemolyticus
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图 4 Z096-E对副溶血弧菌成熟生物被膜生物量（A）和代谢活性（B）的影响
Figure 4. Effects of Z096-E on biomass (A) and metabolic activity (B) of V. parahaemolyticus mature biofilm
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图 6 Z096-E对副溶血弧菌细胞表面疏水性（A）和自聚性（B）的影响
Figure 6. Effects of Z096-E on the cell surface hydrophobicity （A） and auto-aggregation （B） of V. parahaemolyticus
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