Ultrasound-Assisted Extraction of Polyphenols from the Mushroom of Cantharelles cibarius and Its Antioxidant Activity
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摘要: 以鸡油菌为原料获得鸡油菌多酚提取的最佳工艺条件，采用超声波辅助乙醇提取法，以料液比、超声温度、乙醇浓度、超声时间为单因素，利用Box-Behnken方法进行四因素三水平的实验设计优化了多酚最佳提取工艺条件。同时，以超高效液相色谱质谱技术UPLC-MS对鸡油菌中的多酚成分进行了分析，采用DPPH法、ABTS法、FRAP法对多酚进行了体外抗氧化活性评价。此外，比较了乙醇浸提、索式热回流提取与超声波辅助乙醇提取三种方法对鸡油菌多酚含量的差异。结果表明：采用超声波辅助乙醇提取鸡油菌多酚的最佳条件为料液比1:32（g/mL）、超声温度40 ℃、乙醇浓度40%、超声时间21 min；超声辅助提取多酚的量最大，为11.80 mg/g；浸提多酚含量为8.60 mg/g；索式热回流多酚含量为3.60 mg/g。UPLC-MS分析结果表明鸡油菌多酚提取物主要包含没食子酸、咖啡酸和丁香酸酚类成分；与传统方法比较，超声波辅助提取法是一种简单快速高效的多酚提取方法；三种体外抗氧化活性试验表明，鸡油菌多酚具有较强的体外抗氧化活性。Abstract: An optimized method of ultrasound-assisted extraction (UAE) was proposed for the effective extraction of polyphenols from the mushroom of Cantharelles cibarius and evaluated by response surface methodology. In this study, solid-liquid ratio, ultrasonic temperature, ethanol concentration and ultrasonic time were investigated and optimized using a central composite rotatable design. The main polyphenols were identified by UPLC-MS method. Besides, traditional extracting methods including maceration and soxhlet extraction methods were also carried out for comparison. Moreover, the antioxidant activity of polyphenols was evaluated by the scavenging abilities of DPPH free radical, ABTS+ free radical and measuring Fe3+ reduction capacity. The results showed that the best extraction conditions were ethanol concentration 40%, solid-liquid ratio 1:32 g/mL, ultrasonic temperature 40 ℃ and ultrasonic time 21 min . Ultrasonic assisted extraction of polyphenols was the highest, 11.80 mg/g, the content of extracted polyphenols was 8.60 mg/g, the polyphenols of Soxhlet heat reflux was 3.60 mg/g. The result of UPLC-MS analysis showed that the main phenols contained gallic acid, caffeic acid and eugenic acis. Compared to conventional methods, the ultrasonic assisted extraction was an efficient, rapid and simple approach for the extraction of polyphenols with good antioxidants activity from Cantharelles cibarius.
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鸡油菌（Cantharelles cibarius）又名黄丝菌、杏菌，是一种外生菌根真菌，属真菌界担子菌纲鸡油菌科鸡油菌属真菌。鸡油菌富含多糖、酚类、挥发油、氨基酸、抗真菌蛋白等多种生理活性成分，是全球六大菌根性食用菌之一[1]。鸡油菌的食用与药用价值都很高，具有明目、抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗病毒、抗氧化、抗菌等作用[2-5]。多酚类化合物含有酚羟基，是鸡油菌抗氧化活性的主要成分之一[2-3]。
一般来说，多酚的提取方法主要有传统提取法和现代提取法两种。传统的提取方法有索氏提取、热回流提取和浸渍提取，现代提取技术主要有微波辅助、超声辅助和加速溶剂提取[4-6]。传统提取法具有耗时长、能耗大、提取率低等缺点，超声波辅助提取技术（ultrasound-assisted extraction，UAE）因其具有提取时间短、有机溶剂用量少、目标成分提取率高等优点而越来越多地受到人们的关注[7-11]。目前，关于鸡油菌多酚的响应面优化提取分析的研究还鲜有报道。
本研究通过响应面法优化超声波辅助提取鸡油菌中的多酚，并将结果与传统的浸提法与索氏提取法作比较，通过超高效液相色谱质谱技术UPLC-MS分析鉴定鸡油菌中所包含的单体多酚，采用体外DPPH自由基清除等三种试验进一步探究了鸡油菌体外抗氧化活性，旨在为该种食用菌资源的进一步开发利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鸡油菌 云南省玉溪市；福林酚试剂 国药集团；儿茶素、迷迭香酸、丁香酸、槲皮素、绿原酸、原儿茶酸、咖啡酸、没食子酸标准品 北京盛世康普化工技术研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美国Sigma公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS） 成都艾科达化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯 西陇科学股份有限公司。
4500 QTRAP LC-MS三重四级杆液质联用仪 美国AB SCIEX公司；TGL-10B高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；电子分析天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；台式加热超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；UV-2700紫外分光光度计 日本岛津；TG16-WS台式高速离心机 湘仪集团；pH838酸度计 希玛仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鸡油菌多酚的提取工艺流程及操作要点
在室温下，将干燥粉碎至恒重的鸡油菌样品过20目筛，放置−20 ℃冰箱保存备用。称取一定量的鸡油菌粉末，加入不同体积分数的乙醇溶液，在超声功率150 W条件下，在不同的料液比、温度、时间下进行提取，在高速离心机中以6000 r/min的速度离心10 min，从离心管上端取出无沉淀的上清液，即为鸡油菌多酚提取液。
1.2.2 单因素实验
准确称取0.5000 g鸡油菌粉末，固定条件料液比1:30 g/mL，超声温度，乙醇浓度50%，超声时间20 min，分别考察料液比（ 1:20、1:25、1:30、1:35、1:40（g/mL））、超声温度（ 30、35、40、45、50 ℃）、乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%）、超声时间（ 10、20、30、40、50 min）对鸡油菌多酚含量的影响，以上实验每组平行三次。
1.2.3 响应面试验
在单因素实验基础上，采用Design-Expert.12软件中的Box-Behnken设计四因素三水平试验。以鸡油菌多酚含量为响应值，对实验结果进行回归优化，找到最佳提取工艺条件，因素水平见表1。
表 1 响应面试验因素水平设计Table 1. Factors levels design of Box-Behnken test水平 A料液比（g/ mL） B超声温度（℃） C乙醇浓度（%） D超声时间（min） −1 1:25 35 35 15 0 1:30 40 40 20 1 1:35 45 45 25 1.2.4 鸡油菌多酚含量的测定
精密称取没食子酸标准品0.0050 g，溶解定容，得浓度0.01 mg/mL的标准溶液。分别移取上述标液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL于25 mL的比色管中，加入去离子水15.00 mL，分别加入0.3 mL福林酚试剂，摇匀，静置10 min，加入10%的Na2CO3溶液2.0 mL，定容，室温下避光放置1 h，以不加标液的去离子水15.00 mL为空白对照，在760 nm下测定吸光值，平行三次取平均值；以标液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=88.156x+0.0038，R2=0.9994。取鸡油菌多酚提取液0.3 mL于25 mL比色管，分别加入10 mL去离子水、0.3 mL福林酚试剂，静置10 min，加入2.0 mL10%的碳酸钠溶液，定容，避光静置1 h，于760 nm处测定吸光度值，计算鸡油菌多酚含量[8]。
鸡油菌多酚含量(mg/g)=(C×V×N)/(M×1000) 式中C：鸡油菌多酚的质量浓度，mg/mL；V：提取液体积，mL；N：稀释倍数；M：鸡油菌粉末质量，g。
1.2.5 不同方法提取鸡油菌多酚的比较
1.2.5.1 超声辅助提取法
在料液比1:32（g/mL）、提取温度40 ℃、乙醇浓度40 %、超声时间21 min优化条件下提取鸡油菌多酚，计算多酚含量。
1.2.5.2 浸泡提取法
分别称取5.0000 g鸡油菌3份，置于三个锥形瓶中，分别加入40%的乙醇溶液200 mL，摇匀，置于暗处，封上保鲜膜，反应24 h，将混合液离心20 min得到提取液，计算多酚含量。
1.2.5.3 索式热回流提取
准确称取鸡油菌3.0000 g，定性滤纸包好放入索式提取器中，加入120 mL 40%的乙醇溶液，加热至95 ℃，加热回流4 h得提取液，计算多酚含量。
1.2.6 鸡油菌多酚提取物成分分析
以没食子酸、咖啡酸、槲皮素、迷迭香酸、原儿茶酸、绿原酸、丁香酸、儿茶素为标准品，以甲醇溶解配成浓度分别为0.515、0.510、0.515、0.520、0.515、0.530、0.520、0.500 mg/mL的标准溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，8种酚类化合物在线性范围内线性关系良好（r>0.99）。利用4500 QTRAP三重四级杆液质联用仪（AB SCIEX）对上述超声辅助提取法优化得到的鸡油菌多酚提取物进行分析测定[12-13]，计算样品中各种酚类化合物的含量。
1.2.7 鸡油菌多酚抗氧化性测定
1.2.7.1 DPPH自由基清除活性测定
准确称取0.0200 g DPPH，定容，摇匀，得100 mmol∕L溶液。将鸡油菌多酚提取液干燥后的样品分别在不同浓度（0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20 mg/mL）条件下，加入2.0 mL DPPH溶液，避光静置30 min，于517 nm测定吸光度值A1。分别移取剩余样液2.0 mL，加入2.0 mL 40%的乙醇溶液，于517 nm测定吸光度值A2，以VC作为阳性对照，平行测定3次[14]。
DPPH自由基清除率(%)=[1−(A1−A2)/A0]×100 1.2.7.2 ABTS+自由基清除活性测定
将鸡油菌多酚提取液干燥后的样品分别在不同样品浓度（0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175 mg/mL）条件下，加入3.0 mL ABTS+溶液，避光静置6 min，于734 nm测定吸光度值A1。分别移取剩余样液2.0 mL，加入3.0 mL 40%的乙醇溶液，于734 nm测定吸光度值A2。以VC作为阳性对照，平行测定3次[14]。
ABTS+自由基清除率(%)=[1−(A1−A2)/A0]×100 1.2.7.3 铁离子还原能力
将鸡油菌多酚提取液干燥后的样品于不同浓度（0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20 mg/mL）条件下分别加入2.0 mL pH6.6磷酸缓冲溶液和2.0 mL 1%铁氰化钾溶液，于50℃水浴中加热20 min，加入2.0 mL10%三氯乙酸溶液，加氯化铁0.5 mL溶液，避光静置6 min后于700 nm处测定吸光度值[14]。
1.3 数据处理
每个实验重复3次取平均值，结果以平均值±标准差（
ˉx ±s）表示。采用Design-Expert.12软件对数据进行统计分析。采用 SPSS 20.0软件进行相关性分析。2. 结果与分析
2.1 单因素结果
2.1.1 料液比对鸡油菌多酚含量的影响
由图1可知，在料液比1:20～1:40 （g/mL）范围内，鸡油菌多酚含量随料液比增大而逐渐增大，当料液比为1:30（g/mL）时，多酚含量达到最大，可能由于溶剂增多导致传质推动力变大，鸡油菌粉末与溶剂接触面积增大，多酚溶出速率高[12]。随着料液比的增大，鸡油菌多酚含量逐渐下降，可能由于多酚成分已大部分溶出，倘若继续增加溶剂比例，会导致杂质增多从而抑制了多酚的析出，使其含量减少[13]。因此，选择最佳料液比为1:30（g/mL）。
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图 1 料液比对鸡油菌多酚含量的影响Figure 1. Effect of ratio of solid-liquid on polyphenols contents of Cantharelles cibarius2.1.2 超声温度对鸡油菌多酚含量的影响
由图2可知，在超声温度30～50℃范围内，鸡油菌多酚含量随超声温度的升高而逐渐增大，当温度达到40 ℃，多酚含量达到最大，随后多酚含量逐渐下降，可能在一定范围内温度的升高会加快分子间的运动程度，同时软化样品的细胞壁，继而破坏其结构组成，使细胞内的多酚物质析出，但是温度太高会破坏多酚结构从而影响其含量[15-17]。因此，最佳超声温度选择40 ℃。
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图 2 超声温度对鸡油菌多酚含量的影响Figure 2. Effect ofultrasonic temperature on polyphenols contents of Cantharelles cibarius2.1.3 乙醇浓度对鸡油菌多酚含量的影响
由图3可知，在乙醇浓度20%～60%范围内，鸡油菌多酚含量随乙醇浓度增大而逐渐增大，当乙醇浓度达到40%时，其多酚含量达到最大,可能原因是不同浓度的乙醇溶液所具有的极性存在差异，对多酚的溶解度不同，因而浓度在20%～40%范围内多酚含量随乙醇浓度的增大而增大，但如果浓度过高，会使脂溶性杂质变多从而抑制多酚的溶出，导致其含量降低[16-17]。因此，最佳乙醇提取浓度选择40%。
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图 3 乙醇浓度对鸡油菌多酚含量的影响Figure 3. Effect of ethanol concentration on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius2.1.4 超声时间对鸡油菌多酚含量的影响
由图4可知，在超声时间10～50 min范围内，鸡油菌多酚含量随超声时间的延长而逐渐增大，并在20 min时达到最大，20 min后其含量逐渐下降，可能由于时间过长会使氧气有更多机会与多酚物质发生氧化反应从而使多酚含量减少[18-19]。因此，选择最优超声时间为20 min。
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图 4 超声时间对鸡油菌多酚含量的影响Figure 4. Effect of ultrasonic time on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius2.2 响应面优化结果分析
2.2.1 响应面模型设计与分析
依据单因素实验，由Box-Behnken试验设计原理，以料液比、超声温度、乙醇浓度及超声时间4个因素，共29个试验点进行分析，结果见表2。
表 2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2. Box-Behnken experiment design and results实验号 A料液比（g/mL） B超声温度（℃） C乙醇浓度（%） D超声时间（min） 多酚含量（mg/g） 1 1:30 35 40 30 10.47 2 1:30 35 40 20 9.59 3 1:30 40 30 10 10.08 4 1:30 40 50 10 10.28 5 1:30 35 50 20 10.44 6 1:30 45 40 30 10.68 7 1:25 40 50 20 9.29 8 1:25 45 40 20 9.89 9 1:30 40 50 30 11.01 10 1:25 40 40 10 9.17 11 1:25 45 40 20 9.46 12 1:30 35 40 10 10.24 13 1:30 35 30 20 10.30 14 1:30 40 40 20 12.15 15 1:25 35 40 20 9.27 16 1:30 45 30 20 11.05 17 1:30 40 40 20 12.38 18 1:30 40 30 30 10.90 19 1:30 40 40 20 12.21 20 1:30 45 40 10 10.29 21 1:35 40 40 10 9.29 22 1:35 40 50 20 9.47 23 1:30 45 50 20 10.57 24 1:25 40 30 20 9.37 25 1:25 40 40 30 9.12 26 1:35 40 30 20 9.66 27 1:30 40 40 20 12.43 28 1:30 40 40 20 12.09 29 1:35 40 40 30 9.35 对Design-Expert.12 软件表中数据进分析，建构出提取条件和多酚含量间的二次多项式模型为Y=12.25+0.1308A+0.1358B−0.0250C+0.1817D+0.0275AB+0.0.0275AC+0.0275AD−0.1550BC+0.0400BD−0.0225CD−1.98A2−0.8131B2−0.7918C2−0.9843D2。各因素对响应值的影响程度可由上式各系数绝对值大小反映：模型的二次项系数均是负数，其抛面开口朝下，有极大值点，因此可对其优化评价[20-23]。对上述模型展开方差分析，结果见表3。
表 3 超声提取法回归模型方差分析Table 3. Analysis of variance of the constructed regression model by ultrasonic-assisted extraction方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性 模型 30.16 14 2.15 48.34 <0.0001 ** A-料液比 0.2054 1 0.2054 4.61 0.0498 * B-提取温度 0.2214 1 0.2214 4.97 0.0427 * C-乙醇浓度 0.0075 1 0.0075 0.1683 0.6878 D-超声时间 0.3960 1 0.3960 8.89 0.0099 ** AB 0.0030 1 0.0030 0.0679 0.7982 AC 0.0030 1 0.0030 0.0679 0.7982 AD 0.0030 1 0.0030 0.0679 0.7982 BC 0.0961 1 0.0961 2.16 0.1641 BD 0.0064 1 0.0064 0.1436 0.7104 CD 0.0020 1 0.0020 0.0454 0.8343 A² 25.38 1 25.38 569.53 < 0.0001 ** B² 4.29 1 4.29 96.23 < 0.0001 ** C² 4.07 1 4.07 91.26 < 0.0001 ** D² 6.28 1 6.28 141.03 < 0.0001 ** 残差 0.6239 14 0.0446 失拟项 0.5374 10 0.0537 2.49 0.1971 不显著 纯误差 0.0865 4 0.0216 R2 = 0.9797 R2Adj=0.9595 注：“*”表示差异显著，P<0.05；“**”表示差异极显著，P<0.01。 通常情况下，回归方程各因素的显著性可通过F值和P值进行检验，以揭示各变量间的相互作用，P<0.05说明建模成功。表3表明，该模型呈极显著（此时P<0.0001），说明该模型有统计学意义；失拟项0.1971>0.05，呈不显著，说明模型合适说明该模型拟合度好、实验误差小；决定系数R2=0.9797，表明试验研究的自变量（4个单因素条件）与因变量（鸡油菌多酚含量）的关系显著；校正决定系数R2Adj=0.9595，表明模型与试验较为可靠，可解释95.95%响应值变化。显著性分析表明，一次项D和二次项A2、B2、C2、D2对因变量影响极显著（P<0.01），一次项A、B影响显著（P<0.05），其他交互项都无显著影响（P>0.05）[24-26]。由F值大小可知，各因素对样液多酚含量的影响大致为：超声时间（D）>温度（B）>液料比（A）>乙醇浓度（C）。
2.2.2 响应曲面分析
三维响应面图是响应值对各影响因子所构成的曲面图，可以直观地判断出不同影响因子交互作用对响应值的影响趋势以及响应值的变化范围。根据多元回归方程做出不同处理因素对鸡油菌多酚含量的影响相应三维响应面图。如图5所示，响应曲面均为开口向下的凸形曲面，说明含量存在最大值。由图5a与图5c可知，时间与温度曲面弯曲程度较大，说明该因素对鸡油菌中多酚的含量影响显著[24-26]。
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图 5 两因素交互作用对多酚含量影响的响应面图Figure 5. Response surface diagram of the interaction of two factors on the content of polyphenols2.2.3 最优提取工艺验证
由Design-Expert.12求解回归方程，得出最优的鸡油菌提取方案为：料液比1:32.48（g/mL）、提取温度40.49 ℃、乙醇浓度39.64%、超声时间21.02 min，在此条件下鸡油菌多酚含量可达11.80 mg/g。考虑实际操作的局限性，确定实验方案为料液比1:32.48（g/mL）、提取温度40 ℃、乙醇浓度40%、超声时间21 min。在此条件平行测定三次，验证性试验结果的多酚含量为11.80 mg/g，与预测值接近，偏差较小，证实此模型可用来对鸡油菌多酚成分进行进一步的提取及优化。
2.2.4 超声提取法与浸泡、索式热回流两种提取法的效率比较
为了比较超声波辅助提取鸡油菌多酚含量的优势，采取浸泡提取法与索式热回流提取法作为对比。将鸡油菌粉末在室温下浸泡24 h后，测定多酚含量为8.60 mg/g，此方法较为安全，不需控制温度，缺点是所需时间较长、多酚提取含量较低，可能是由于室温浸取，温度较低，分子热运动较为缓慢，导致多酚溶出减少，提取率较低[27]。在95 ℃条件下，采用索氏提取法提取4 h后，测得多酚含量为3.60 mg/g，此方法的缺点是温度过高，会导致酚类物质的分解或者引起其他杂质的溶解，间接导致酚类含量减低[28]。因此，超声辅助提取鸡油菌多酚是一种高效的提取方法。
2.2.5 鸡油菌多酚成分的质谱分析
多酚类化合物分子结构中一般都含有酚羟基，具有抗氧化活性，为了进一步研究云南鸡油菌中的多酚的种类及含量，本研究通过超高效液相色谱质谱技术UPLC-MS鸡油菌种8种多酚单体。如图6、图7及表4所示，鸡油菌多酚提取物中质谱分析鉴定出的6种单体多酚有原儿茶酸、丁香酸、迷迭香酸、没食子酸、咖啡酸、槲皮素。由表4可知，鸡油菌多酚提取物中没食子酸含量最高，其次是咖啡酸，然后是丁香酸和原儿茶酸，分析所得到的这六种多酚化合物可能是鸡油菌多酚提取物具有抗氧化活性的主要物质。
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图 6 8种酚类标准品的XIC图注：1.原儿茶酸；2.儿茶素；3.丁香酸；4.迷迭香酸；5.没食子酸；6.绿原酸；7.咖啡酸；8.槲皮素；图7同。Figure 6. XIC of 8 kinds of phenolic compounds![]()
图 7 鸡油菌多酚提取物中8种酚类化合物的XIC图Figure 7. XIC of 8 kinds of phenolic compounds from Cantharelles cibarius表 4 鸡油菌样品中酚类化合物含量测定结果（μg·g−1）Table 4. Polyphenols content in Cantharelles cibarius (μg·g−1)多酚种类 没食子酸 咖啡酸 槲皮素 迷迭香酸 原儿茶酸 绿原酸 丁香酸 儿茶素 多酚含量 6.52 0.95 0.06 0.25 0.47 − 0.61 − 相对标准偏差RSD（%） 2.3 6.2 7.5 7.1 5.9 − 4.7 − 2.3 抗氧化活性研究
2.3.1 鸡油菌多酚对DPPH自由基的清除作用
由图8可知，在实验浓度范围内，随着样品浓度的增加，鸡油菌多酚提取液对DPPH自由基的清除率逐渐增加，当清除率到77.7%时达到最大，说明鸡油菌多酚对DPPH自由基具有良好的清除效果。
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图 8 鸡油菌多酚对DPPH自由基的清除作用Figure 8. Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on DPPH free radical2.3.2 鸡油菌多酚对ABTS+自由基的清除作用
如图9所示，在实验浓度范围内，鸡油菌多酚提取液对ABTS+自由基的清除率也具有明显的量效关系，在浓度0.13（mg/mL）时，清除率为98.8%时达到最大，说明鸡油菌多酚样液具有较强的清除ABTS+自由基的能力。
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图 9 鸡油菌多酚对ABTS+自由基的清除作用Figure 9. Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on ABTS+ free radical2.3.3 鸡油菌多酚的Fe3+还原能力
多酚能使反应体系中Fe3+还原成Fe2+，溶液由黄色变成不同程度的蓝色[28]，还原能力越强，吸光度越大。由图10可知，在0.05～0.20 mg/mL质量浓度范围内，随着样品质量浓度的增大，鸡油菌多酚提取物和抗坏血酸吸光度逐渐增大，表现出良好的还原能力。还原能力可延缓或终止自由基反应，实验结果提示鸡油菌多酚提取物的抗氧化活性良好，多酚质量浓度越高还原能力越强。
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图 10 鸡油菌多酚的Fe3+还原能力Figure 10. Fe3+ reduction ability of polyphenols from Cantharelles cibarius3. 结论
本文通过超声乙醇提取法得出鸡油菌中多酚的最佳提取条件：料液比1:32（g/mL）、超声温度40℃、乙醇浓度40%、超声时间21 min，多酚的含量为11.80 mg/g，各因素对样液多酚含量的影响顺序为：超声时间（D）>超声温度（B）>料液比（A）>乙醇浓度（C）。通过超高效液相色谱UPLC-MS质谱技术分析鉴定出鸡油菌中包含6种单体多酚原儿茶酸、丁香酸、迷迭香酸、没食子酸、咖啡酸、槲皮素。体外抗氧化活性研究表明，鸡油菌多酚对DPPH自由基、ABTS+自由基具有较强的清除活性，对Fe3+还原能力也较强。研究结果表明超声波辅助提取方法一种简单快速高效的鸡油菌多酚提取方法。
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图 1 料液比对鸡油菌多酚含量的影响
Figure 1. Effect of ratio of solid-liquid on polyphenols contents of Cantharelles cibarius
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图 2 超声温度对鸡油菌多酚含量的影响
Figure 2. Effect ofultrasonic temperature on polyphenols contents of Cantharelles cibarius
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图 3 乙醇浓度对鸡油菌多酚含量的影响
Figure 3. Effect of ethanol concentration on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius
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图 4 超声时间对鸡油菌多酚含量的影响
Figure 4. Effect of ultrasonic time on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius
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图 5 两因素交互作用对多酚含量影响的响应面图
Figure 5. Response surface diagram of the interaction of two factors on the content of polyphenols
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图 6 8种酚类标准品的XIC图
注：1.原儿茶酸；2.儿茶素；3.丁香酸；4.迷迭香酸；5.没食子酸；6.绿原酸；7.咖啡酸；8.槲皮素；图7同。
Figure 6. XIC of 8 kinds of phenolic compounds
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图 7 鸡油菌多酚提取物中8种酚类化合物的XIC图
Figure 7. XIC of 8 kinds of phenolic compounds from Cantharelles cibarius
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图 8 鸡油菌多酚对DPPH自由基的清除作用
Figure 8. Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on DPPH free radical
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图 9 鸡油菌多酚对ABTS+自由基的清除作用
Figure 9. Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on ABTS+ free radical
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图 10 鸡油菌多酚的Fe3+还原能力
Figure 10. Fe3+ reduction ability of polyphenols from Cantharelles cibarius
表 1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Factors levels design of Box-Behnken test
水平 A料液比（g/ mL） B超声温度（℃） C乙醇浓度（%） D超声时间（min） −1 1:25 35 35 15 0 1:30 40 40 20 1 1:35 45 45 25 
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表 2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Box-Behnken experiment design and results
实验号 A料液比（g/mL） B超声温度（℃） C乙醇浓度（%） D超声时间（min） 多酚含量（mg/g） 1 1:30 35 40 30 10.47 2 1:30 35 40 20 9.59 3 1:30 40 30 10 10.08 4 1:30 40 50 10 10.28 5 1:30 35 50 20 10.44 6 1:30 45 40 30 10.68 7 1:25 40 50 20 9.29 8 1:25 45 40 20 9.89 9 1:30 40 50 30 11.01 10 1:25 40 40 10 9.17 11 1:25 45 40 20 9.46 12 1:30 35 40 10 10.24 13 1:30 35 30 20 10.30 14 1:30 40 40 20 12.15 15 1:25 35 40 20 9.27 16 1:30 45 30 20 11.05 17 1:30 40 40 20 12.38 18 1:30 40 30 30 10.90 19 1:30 40 40 20 12.21 20 1:30 45 40 10 10.29 21 1:35 40 40 10 9.29 22 1:35 40 50 20 9.47 23 1:30 45 50 20 10.57 24 1:25 40 30 20 9.37 25 1:25 40 40 30 9.12 26 1:35 40 30 20 9.66 27 1:30 40 40 20 12.43 28 1:30 40 40 20 12.09 29 1:35 40 40 30 9.35
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表 3 超声提取法回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of the constructed regression model by ultrasonic-assisted extraction
方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性 模型 30.16 14 2.15 48.34 <0.0001 ** A-料液比 0.2054 1 0.2054 4.61 0.0498 * B-提取温度 0.2214 1 0.2214 4.97 0.0427 * C-乙醇浓度 0.0075 1 0.0075 0.1683 0.6878 D-超声时间 0.3960 1 0.3960 8.89 0.0099 ** AB 0.0030 1 0.0030 0.0679 0.7982 AC 0.0030 1 0.0030 0.0679 0.7982 AD 0.0030 1 0.0030 0.0679 0.7982 BC 0.0961 1 0.0961 2.16 0.1641 BD 0.0064 1 0.0064 0.1436 0.7104 CD 0.0020 1 0.0020 0.0454 0.8343 A² 25.38 1 25.38 569.53 < 0.0001 ** B² 4.29 1 4.29 96.23 < 0.0001 ** C² 4.07 1 4.07 91.26 < 0.0001 ** D² 6.28 1 6.28 141.03 < 0.0001 ** 残差 0.6239 14 0.0446 失拟项 0.5374 10 0.0537 2.49 0.1971 不显著 纯误差 0.0865 4 0.0216 R2 = 0.9797 R2Adj=0.9595 注：“*”表示差异显著，P<0.05；“**”表示差异极显著，P<0.01。
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表 4 鸡油菌样品中酚类化合物含量测定结果（μg·g−1）
Table 4 Polyphenols content in Cantharelles cibarius (μg·g−1)
多酚种类 没食子酸 咖啡酸 槲皮素 迷迭香酸 原儿茶酸 绿原酸 丁香酸 儿茶素 多酚含量 6.52 0.95 0.06 0.25 0.47 − 0.61 − 相对标准偏差RSD（%） 2.3 6.2 7.5 7.1 5.9 − 4.7 −
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