The Inhibitory Effect of Six Traditional Spices on the Formation of Heterocyclic Aromatic Amines in Fried Beef Patties
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摘要: 本文建立了固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱法检测油炸牛肉饼中8种杂环胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）含量的方法，并研究不同添加量的6种传统香辛料：花椒、辣椒、黑胡椒（0.5%、1.0%、1.5%）、生姜（1%、2%、3%）、大蒜（1%、3%、5%）、洋葱（3%、6%、9%）对油炸牛肉饼中8种HAAs生成的影响。结果表明：8种HAAs在0.5~40 ng/mL范围内线性关系良好，决定系数R2>0.999；检出限为0.047~0.102 ng/g，定量限为0.127~0.336 ng/g；精密度为1.2%~10.9%；加标回收率在54.0%~109.4%之间，相对标准偏差在1.4%~8.9%之间。该方法可满足对HAAs进行定量分析的要求。在未添加香辛料的对照组中，HAAs总量为37.5 ng/g。与对照组相比，6种香辛料的添加均可显著抑制油炸牛肉饼中总HAAs的生成（P<0.05）。1.5%花椒、1.5%辣椒、0.5%黑胡椒、1%生姜、5%大蒜和9%洋葱分别对油炸牛肉饼中总HAAs的抑制效果最好，抑制率为77.3%、67.4%、65.0%、67.1%、61.2%、47.9%。此研究结果可为肉制品热加工中HAAs的抑制提供一定的参考。Abstract: A method for the detection of 8 heterocyclic aromatic amines (HAAs) in fried beef patties by solid phase extraction-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry was established in this study, and the effects of six traditional spices added at different concentrations including Sichuan pepper (0.5%, 1.0%, 1.5%), chili pepper (0.5%, 1.0%, 1.5%), black pepper (0.5%, 1.0%, 1.5%), ginger (1%, 2%, 3%), garlic (1%, 3%, 5%), and onion (3%, 6%, 9%) on the formation of 8 HAAs in fried beef patties were investigated. The results showed that the linear range was from 0.5~40 ng/mL for 8 HAAs with the good determination coefficients (R2>0.999). The limits of detection were 0.047~0.102 ng/g, and the limits of quantification were 0.127~0.336 ng/g. The precision was 1.2%~10.9%. The recoveries were in the range of 54.0%~109.4% with the relative standard deviations of 1.4%~8.9%. This method could be effectively applied for the quantification of HAAs. The total amount of HAAs in the control group without adding spices were 37.5 ng/g. Compared with the control group, the addition of six spices could significantly reduce the total amount of HAAs (P<0.05). The best inhibition effect on total HAAs could be obtained by 1.5% Sichuan pepper, 1.5% chili pepper, 0.5% black pepper, 1% ginger, 5% garlic and 9% onion and the inhibition rates were 77.3%, 67.4%, 65.0%, 67.1%, 61.2%, 47.9%, respectively. The results from this study can provide a technical reference for inhibiting the formation of HAAs in the thermal processing of meat products.
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Keywords:
- fried beef patties /
- spices /
- heterocyclic aromatic amines /
- formation /
- inhibition
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杂环胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）是肉类等富含蛋白质的食品在热加工过程中产生的一类具有致癌和致突变性的杂环芳香族化合物[1]。迄今为止，在热加工的肉制品中已经发现了30多种HAAs[2]。根据其化学结构，HAAs可分为两类：氨基咪唑氮杂芳烃类和氨基咔啉类。其中，氨基咪唑氮杂芳烃类主要是由氨基酸、糖、肌酸或肌酸酐等前体物质在100~300 ℃的温度下通过美拉德反应形成，而氨基咔啉类通常由氨基酸或蛋白质在300 ℃以上的温度下直接热解形成[3]。1993年，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer, IARC）将2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉（2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline, MeIQ）、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline, MeIQx）、2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4,5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-f]pyridine, PhIP）、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole, AαC）、2-氨基-3甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole, MeAαC）、3-氨基-1,4-二甲基-5H吡啶[4,3-b]吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole, Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H吡啶[4,3-b]吲哚（3-amino-1-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole, Trp-P-2）和2-氨基-6-甲基二吡啶并[1,2-a:3',2'-d]咪唑（2-amino-6-methyldipyrido-5H-pyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole, Glu-P-1）定义为潜在致癌物（2B类），将2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉（2-amino-3-methyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoline, IQ）定义为可能致癌物（2A类）[4]。
油炸牛肉饼是国内外很受欢迎的一种食物，其高温加工后会产生HAAs，摄入大量的油炸肉制品会对人类的身体健康产生一定的影响。有流行病学研究报告表明，过量食用油炸肉制品会增加人体患结肠癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等的风险[5-7]。因此，如何控制肉制品热加工过程中HAAs的形成具有十分重要的意义。香辛料富含多酚、黄酮类、生物碱类和萜类等抗氧化性成分，并广泛应用于肉制品加工中以改善风味，同时也被证明对HAAs的形成有显著影响[8-9]。姚瑶等[10]研究了丁香、桂皮、良姜、红花椒和香叶5种香辛料对酱牛肉中HAAs生成的影响，结果表明：丁香、桂皮、良姜、红花椒可以抑制HAAs的生成，而香叶会促进HAAs的生成。吕美[11]考察了高良姜、麻椒、花椒、香叶、桂皮和陈皮6种香辛料对煎烤牛肉饼中HAAs生成的影响，结果表明：高良姜、麻椒、花椒、香叶可以显著抑制煎烤牛肉饼中HAAs的生成，并且对PhIP的抑制率均为100%。添加3%的高良姜对总HAAs的抑制效果最好，抑制率为78.32%，其次是香叶、花椒和麻椒。然而桂皮和陈皮对HAAs的抑制效果较弱，桂皮会促进PhIP的生成，陈皮会促进Norharman的生成。KILIC等[12]研究了不同添加比例（0.5%和1%）的姜黄粉在150、200和250 ℃下对鸡肉丸中HAAs形成的影响，结果表明与空白对照组相比，姜黄粉的添加降低了鸡肉丸中HAAs的水平，并且在200 ℃下添加0.5%姜黄对鸡肉丸中HAAs的抑制效果最强，抑制率为72%。
由于香辛料本身成分的复杂性，添加不同种类或比例的香辛料对HAAs生成影响的研究结果不尽相同。花椒、辣椒、黑胡椒、生姜、大蒜和洋葱是我国传统香辛料，但国内对于生姜、大蒜和洋葱对肉制品中HAAs抑制作用的报道相对较少，并且这6种传统香辛料对肉制品中HAAs生成的影响还没有被同时比较过。本文以油炸牛肉饼为研究对象，建立并验证了固相萃取-液相色谱-三重四极杆串联质谱法检测8种HAAs的方法，并通过分别添加不同比例的6种传统香辛料（花椒、辣椒、黑胡椒、生姜、大蒜和洋葱）来研究其对HAAs生成的影响，以期为肉制品热加工过程中HAAs的控制提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜牛霖肉、花椒粉、辣椒粉、黑胡椒粉、生姜粉、大蒜、洋葱、菜籽油 购于江西省南昌市天虹超市；8种HAAs标准品：2-氨基-1,6-二甲基咪唑并[4,5-b]吡啶（2-amino-1,6-dimethylimidazo[4,5-f]pyridine, DMIP）、2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑并[4,5-b]吡啶（2-amino-1,5,6-trimethylimidazo[4,5-f]pyridine, 1,5,6-TMIP）、PhIP、IQ、MeIQ、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3-methy-limidazo[4,5-f]quinoxaline, IQx）MeIQx、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethyl-imidazo[4,5-f]quinoxaline, 4,8-DiMeIQx） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；Oasis MCX固相萃取小柱（150 mg，6 mL） 美国Waters公司；甲醇、甲酸 色谱纯，德国Merk试剂公司；盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、氨水（25%~28%） 分析纯，国药集团化学试剂上海有限公司。
1290/6460A液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 美国Agilent公司；Milli-Q Gradient超纯水器 美国Millipore公司；SK7200BT超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；XS分析电子天平、FiveEasy Plus pH计 瑞士Mettler Toledo公司；Voetex Mixer QL-866涡旋仪 海门其林贝尔仪器制造有限公司；3K15冷冻离心机 扬州曦玛离心机有限公司；JRJ300-1高速匀质机 上海索映仪器设备有限公司；Fotector-04HT全自动固相萃取仪、AutoEVA-20L氮吹仪 厦门睿科集团股份有限公司；KMG-W1811绞肉机 佛山康佳集团股份有限公司；JYL-C010料理机 济南九阳股份有限公司；EF-101V油炸锅 广州拓普电器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 牛肉饼的制作
1.2.1.1 对照组牛肉饼的制作
将新鲜牛霖肉去除可见脂肪并用绞肉机绞碎后，称取40 g肉糜，用模具制成直径7 cm、厚1 cm的圆形肉饼，每个样品4个重复，置于油炸锅中200 ℃油炸10 min。为避免其它调味料的影响，所有的牛肉饼都未添加盐、味精等调味料。将油炸好的牛肉饼冷却至室温，用料理机粉碎后于-20 ℃下冷冻、备用[13-14]。
1.2.1.2 实验组牛肉饼的制作
将大蒜和洋葱绞碎，备用。称取40 g肉糜，分别添加质量为0.5%、1.0%和1.5%肉重的花椒粉、辣椒粉和黑胡椒粉，质量为1%、2%和3%肉重的生姜粉，质量为1%、3%和5%肉重的大蒜浆和质量为3%、6%和9%肉重的洋葱浆。为避免其它调味料的影响，所有的牛肉饼都未添加盐、味精等调味料。实验组牛肉饼的制作方法与对照组相同，每个样品4个重复[15-17]。
1.2.2 前处理方法
HAAs的前处理方法参考YAN等[18]的盐酸提取方法并适当修改。向4 g样品中加入25 mL 0.1 mol/L HCl，采用高速匀质机均质1 min并在室温下超声提取15 min（350 W）后，涡旋混匀，离心取上清液（9000×g，15 min，4 ℃），残渣再用HCl提取一次，合并离心后的上清液，加入1.6 mL质量浓度为30%的三氯乙酸溶液，涡旋混匀，静置15 min后离心除去蛋白质沉淀（9000×g，15 min，4 ℃）。收集上清液。加入4 mol/L NaOH溶液调节上述提取液的pH至3.0左右。采用固相萃取法对上述提取液进行净化。先将Oasis MCX固相萃取小柱依次用6 mL甲醇、6 mL水、6 mL 0.1 mol/L HCl活化。上样5 mL提取液后，分别采用6 mL 0.1 mol/L HCl和6 mL甲醇淋洗，最后用6 mL甲醇-氨水（95:5，V/V）将固相萃取小柱中的HAAs洗脱下来。氮气45 ℃下将洗脱液吹至近干后，加入500 μL甲醇复溶，涡旋，并采用0.22 μm尼龙针孔滤器过滤。进行液相色谱-三重四极杆串联质谱法（LC-MS/MS）检测。
1.2.3 LC-MS/MS分析
1.2.3.1 色谱条件
色谱柱：Hydro-RP 80 Å柱（2×150 mm，4 μm）；柱温30 ℃。流动相：A相为甲醇，B相为体积分数0.1%甲酸水，流速0.25 mL/min，梯度洗脱程序为：0~1 min，20% A；1~1.01 min，20%~60% A；1.01~3 min，60% A；3~3.01 min，60%~100% A；3.01~5 min，100% A；5~6 min，100%~20% A；6~10 min，20% A。进样量1 μL。
1.2.3.2 质谱条件
电喷雾离子源（ESI）；正离子模式；扫描方式：多反应监测模式（MRM模式）；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；喷雾器压力25 Psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流速9 L/min；毛细管电压3500 V；喷嘴电压400 V。8种HAAs的MRM参数如表1所示。
表 1 8种HAAs的MRM参数Table 1. MRM parameters for 8 HAAsHAAs 母离子
（m/z）特征离子
（m/z）锥孔电压
（V）碰撞能量
（eV）驻留时间
（ms）DMIP 163 148*，
105.170 30 13 1,5,6-TMIP 177 162.1*，
14773 25 13 PhIP 225 210*，
182.91100 30 13 IQ 199 184.2*，
15775 30 13 MeIQ 213 198.1*，
170.1100 25 13 IQx 200 185.1*，
131.280 25 13 MeIQx 214 199*，
13185 25 13 4,8-DiMeIQx 228 213*，
159.995 30 13 注：*表示定量离子。 1.2.3.3 定性、定量方法
采用外标法对油炸牛肉饼中的HAAs进行定量分析。以目标物的浓度为横坐标，相应的响应值为纵坐标，绘制线性标准曲线，从而计算样品中HAAs的含量。
1.2.4 香辛料对HAAs抑制率的计算
1.2.5 HAAs的方法学考察
分别从线性范围、检测限（limits of detection，LODs）和定量限（limits of quantification，LOQs）、精密度、加标回收率4个方面对上述8种HAAs的检测方法进行方法学考察。
线性范围：分别测定浓度为0.5、1、2、5、10、20、40 ng/mL的混合标准品溶液，以标准品的浓度为横坐标，HAAs的峰面积为纵坐标，绘制线性标准曲线，进行线性回归分析。
LODs和LOQs：将8种HAAs的混合标准品溶液分别稀释至信噪比（S/N）为3和10时，所对应的标准品浓度即为该方法对各HAAs检测限和定量限，单位为ng/g。
精密度：向空白牛肉饼样品中加入一定量的配制好的混合标准品溶液后，制成待测样品。在同一天内，将样品连续进样6次，所得HAAs含量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），即为精密度。
加标回收率：准确称取4 g样品，向其中分别加入低、中、高三个浓度水平（n=6）的HAAs混合标准品溶液后，对HAAs进行提取和净化，测定HAAs含量。计算加标回收率和RSD值。
1.3 数据处理
采用IBM SPSS Statistics 23.0进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan法，P˂0.05定义为显著水平，用Origin 8软件作图。
2. 结果与分析
2.1 HAAs检测方法的方法学评价
2.1.1 线性范围、LODs、LOQs和精密度
采用1.2.2方法对油炸牛肉饼中HAAs进行前处理和含量分析。如表2所示，DMIP、1,5,6-TMIP、IQ、MeIQ、IQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs在0.5~20 ng/mL范围内，PhIP和MeIQx这2种HAAs在1.0~40 ng/mL范围内线性关系良好，LODs为0.047~0.102 ng/g，LOQs为0.127~0.336 ng/g。精密度在1.2%~10.9%之间。满足对HAAs进行定量分析的要求。
表 2 8种HAAs的线性范围、线性方程、决定系数（R2）、LOD、LOQ和精密度Table 2. Linear range, regression equation, determination coefficient, LOD, LOQ and precision of 8 HAAsHAAs 线性范围
（ng/mL）线性方程 R2 LOD
（ng/g）LOQ
（ng/g）精密度
（%）DMIP 0.5~20 y=129.71x−50.709 0.9998 0.075 0.217 10.9 1,5,6-TMIP 0.5~20 y=128.19x+1.0017 0.9992 0.071 0.204 2.5 PhIP 1.0~40 y=90.038x−20.019 0.9999 0.102 0.336 4.3 IQ 0.5~20 y=119.6x−39.091 0.9994 0.050 0.128 2.6 MeIQ 0.5~20 y=100.47x−112.99 0.9993 0.053 0.180 2.5 IQx 0.5~20 y=68.572x−0.3152 0.9995 0.065 0.127 10.0 MeIQx 1.0~40 y=54.813x−10.651 0.9998 0.090 0.226 3.3 4,8-DiMeIQx 0.5~20 y=55.049x−9.7496 0.9998 0.047 0.163 1.2 2.1.2 加标回收率
如表3所示，8种HAAs的加标回收率在54.0%~109.4%之间，RSD在1.4%~8.9%之间。表明回收率是在可接受的范围内。
表 3 8种HAAs的回收率Table 3. Recoveries of 8 HAAsHAAs 加标量（ng/g） 回收率（%） RSD（%） DMIP 1.25 64.3 2.9 2.50 81.5 3.7 3.75 74.7 1.4 1,5,6-TMIP 1.25 61.3 4.0 2.50 73.1 3.9 3.75 85.1 3.3 PhIP 2.50 72.8 2.8 5.00 80.6 5.0 10.00 109.4 3.0 IQ 1.25 54.0 3.5 2.50 61.8 6. 5 3.75 57.5 5.4 MeIQ 1.25 66.6 3.8 2.50 76.6 3.3 3.75 81.4 3.0 IQx 1.25 74.4 6.6 2.50 82.8 6.3 3.75 86.3 3.6 MeIQx 2.50 83.4 1.7 5.00 92.7 8.9 10.00 107.4 8.3 4,8-DiMeIQx 1.25 72.4 3.8 2.50 87.9 7.1 3.75 85.3 4.7 2.2 6种传统香辛料对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
本实验研究了不同添加量的6种香辛料（花椒、辣椒、黑胡椒、生姜、大蒜和洋葱）对油炸牛肉饼中8种HAAs生成的影响。结果表明，在不添加香辛料的对照组中检测到了DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、MeIQ、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这7种HAAs，IQ未检测到。HAAs的总量为37.5 ng/g，其中MeIQx含量最高（15.3 ng/g），其次为PhIP（7.5 ng/g），4,8-DiMeIQx（4.7 ng/g），DMIP（4.5 ng/g），1,5,6-TMIP（3.2 ng/g），MeIQ（1.2 ng/g），IQx（1.1 ng/g）。在添加香辛料的实验组中均检测到了DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs，IQ和MeIQ未检测到。6种香辛料对油炸牛肉饼中HAAs的抑制率如表4所示。
表 4 6种传统香辛料对油炸牛肉饼中HAAs的抑制率（%）Table 4. Inhibition rates of 6 traditional spices on the contents of heterocyclic aromatic amines in fried beef patties (%)香辛料 HAAs 总抑制率 DMIP 1,5,6-TMIP PhIP IQ MeIQ IQx MeIQx 4,8-DiMeIQx 0.5%花椒 74.3±1.6 58.4±2.6 69.1±0.7 — — 42.3±4.2 66.3±2.8 57.7±6.7 67.4±1.7 1.0%花椒 79.0±0.5 67.1±7.1 71.3±1.3 — — 53.2±3.4 73.6±1.7 67.9±1.1 72.8±1.5 1.5%花椒 82.9±0.7 69.4±1.8 77.3±1.3 — — 59.5±5.5 79.8±1.4 75.4±1.5 77.3±0.4 0.5%辣椒 26.0±3.6 51.1±3.4 62.9±3.3 — — 43.0±5.7 53.8±2.7 48.5±2.0 53.6±3.7 1.0%辣椒 35.5±1.5 51.7±1.9 71.6±1.2 — — 56.5±6.3 61.5±1.3 60.2±1.8 60.5±0.7 1.5%辣椒 46.2±2.0 58.0±1.8 77.4±1.7 — — 70.8±0.5 67.5±1.2 69.1±3.0 67.4±1.1 0.5%黑胡椒 51.5±2.2 72.2±1.4 78.7±1.6 — — 54.1±3.7 62.5±3.2 52.7±5.8 65.0±1.1 1.0%黑胡椒 42.6±4.4 64.7±2.5 71.7±2.4 — — 43.9±3.5 65.8±3.3 61.5±2.3 62.9±0.8 1.5%黑胡椒 29.5±3.7 49.0±3.9 60.6±6.5 — — 31.2±3.1 69.3±1.1 64.9±5.9 60.4±1.4 1%生姜 46.8±4.7 65.8±2.2 75.6±0.9 — — 48.4±5.4 66.7±0.8 61.2±3.5 67.1±2.6 2%生姜 35.3±6.8 56.9±1.1 65.7±1.9 — — 43.7±4.0 61.3±1.6 57.3±3.5 58.9±2.0 3%生姜 17.8±3.4 51.7±2.1 59.8±2.7 — — 31.5±4.8 67.8±2.5 61.2±1.5 58.0±1.9 1%大蒜 11.3±2.6 35.7±4.2 41.0±2.9 — — 20.5±3.3 34.7±3.9 18.6±6.0 32.9±2.3 3%大蒜 33.1±1.6 42.0±5.5 56.5±2.5 — — 38.3±2.8 51.8±1.3 44.4±1.7 49.9±1.6 5%大蒜 45.5±2.3 44.0±3.2 65.8±1.1 — — 59.0±1.9 62.3±0.6 67.7±2.4 61.2±0.9 3%洋葱 −3.8±4.3 −10.1±2.1 27.4±3.9 — — −7.7±6.5 1.6±1.6 1.6±3.1 8.0±2.0 6%洋葱 4.5±3.8 25.1±1.6 56.9±2.9 — — 21.7±1.8 15.5±2.9 9.6±1.4 25.4±2.2 9%洋葱 26.4±4.6 42.3±1.9 80.8±1.9 — — 46.1±3.7 40.2±4.5 32.3±1.7 47.9±1.4 注：抑制率数据以平均值±标准偏差表示；—表示未检测出。 2.2.1 花椒对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
由图1和表4可知，花椒对HAAs的抑制效果非常显著，且HAAs的含量随着花椒添加量的增加而显著降低（P˂0.05）。在3个添加量下，花椒对DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs的最大抑制率分别为82.9%、69.4%、77.3%、59.5%、79.8%、75.4%。从HAAs总量的角度分析，当花椒添加量为0.5%、1.0%和1.5%时，HAAs总量均下降至12.2、10.2和8.5 ng/g，其对HAAs总量的抑制率分别为67.4%、72.8%和77.3%。因此，在油炸牛肉饼中添加花椒可有效抑制体系中HAAs的生成，并且当花椒添加量为1.5%时，抑制效果最好。张梦茹[19]研究发现，将0.5%、1.0%和1.5%花椒添加到烤牛肉饼可显著降低PhIP、4,8-DiMeIQx、IQx和MeIQx这4种HAAs的形成（P˂0.05），并且对IQx的抑制率可达100%。ZENG等[20]报道，在烤牛肉饼中加入0.5%、1.0%和1.5%花椒可以显著降低HAAs的生成（P˂0.05），并且花椒对HAAs的抑制作用呈剂量依赖性。
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2.2.2 辣椒对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
由图2和表4可知，辣椒对HAAs的抑制效果与花椒类似。HAAs的含量随着辣椒添加量的增加而显著降低（P˂0.05）。在3个添加量下，辣椒对DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs的最大抑制率分别为46.2%、58.0%、77.4%、70.8%、67.5%、69.1%。从HAAs总量的角度分析，当辣椒添加量为0.5%、1.0%和1.5%时，HAAs总量下降至17.4、14.8和12.2 ng/g，其对HAAs总量的抑制率分别为53.6%、60.5%和67.4%。因此，在油炸牛肉饼中添加辣椒可有效抑制体系中HAAs的生成，并且当辣椒添加量为1.5%时，抑制效果最好。OZ等[21]研究发现，在175、200和225 ℃的油炸牛排中加入了1%的辣椒，HAAs总量分别被抑制94%、100%和75%。并且在3个实验油炸温度下，对PhIP的抑制率均为100%。ZENG等[22]探讨了0.5%、1.0%、1.5%的辣椒对烤牛肉饼中HAAs生成的影响，结果表明：不同添加量的辣椒对HAAs总量有显著的抑制作用（P˂0.05），抑制率分别为46%、35%和24%。
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图 2 辣椒对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响Figure 2. Effect of chili pepper on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties2.2.3 黑胡椒对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
由图3和表4可知，黑胡椒对HAAs有一定的抑制效果，黑胡椒对DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs的最大抑制率分别为51.5%、72.2%、78.7%、54.1%、69.3%、64.9%和0.5%添加量相比，1.0%和1.5%黑胡椒添加促进了DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx这4种HAAs的生成，HAAs抑制率有所下降。从HAAs总量的角度分析，当黑胡椒添加量为0.5%、1.0%和1.5%时，HAAs总量均下降至13.1、13.9和14.9 ng/g，其对HAAs总量的抑制率分别为65.0%、62.9%和60.4%。因此，在油炸牛肉饼中添加黑胡椒可有效抑制体系中HAAs的生成，并且当黑胡椒添加量为0.5%时，抑制效果最好。OZ等[23]研究了1.0%黑胡椒在175、200和225 °C下对油炸牛肉丸中HAAs生成的影响，结果表明：在3个油炸温度下，1.0%黑胡椒对肉丸中的4,8-DiMeIQx和PhIP的抑制率均为100%。对IQ和MeIQ的抑制率分别为33.6%、11.2%、100.0%；100.0%、25.0%、100.0%，对HAAs总量的抑制率在11.8%~100.0%之间。
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图 3 黑胡椒对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响Figure 3. Effect of black pepper on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties2.2.4 生姜对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
由图4和表4可知，当生姜添加量为1%、2%和3%时，HAAs总量均下降至12.3、15.4和15.8 ng/g。1.0%生姜对牛肉饼中HAAs总量的抑制作用最强，抑制率高达67.1%。2.0%和3.0%生姜对HAAs总量的抑制作用没有显著区别（P>0.05），抑制率分别为58.9%和58.0%。生姜对DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs的最大抑制率分别为46.8%、65.8%、75.6%、48.4%、66.7%、61.2%。PUANGSOMBAT等[24]研究发现，添加0.2%的高良姜和姜黄可以使油炸牛肉饼中HAAs的含量分别降低18.4%和39.2%。JINAP等[25]报道，生姜可以有效的降低烤牛肉中HAAs的含量，并且当生姜添加量为10%时，对HAAs的抑制效果最好。
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图 4 生姜对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响Figure 4. Effect of ginger on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties2.2.5 大蒜对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
由图5和表4可知，HAAs的含量随着大蒜添加量的增加而显著降低（P˂0.05）。在3个添加量下，大蒜对DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs的最大抑制率分别为45.5%、44.0%、65.8%、59.0%、62.3%、67.7%。从HAAs总量的角度分析，当大蒜添加量为1%、3%和5%时，HAAs总量均下降至25.2、18.8和14.5 ng/g，其对HAAs总量的抑制率分别高达32.9%、49.9%和61.2%。因此，当大蒜添加量为5%时，对牛肉饼中的HAAs抑制效果最好。SHIN等[26]报道，在油炸牛肉饼中添加5%~20%的大蒜可以显著抑制油炸牛肉饼中HAAs的生成，并且HAAs的含量随着大蒜的增加而显著降低（P˂0.05），抑制率在28%~68%之间。JUNG等[27]研究发现，在100 g牛肉饼中分别添加5.0、10.0和15.0 g大蒜可显著降低HAAs的含量（P˂0.05），降低比例在14%~100%之间。
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图 5 大蒜对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响Figure 5. Effect of garlic on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties2.2.6 洋葱对油炸牛肉饼中HAAs生成的影响
由图6和表4可知，洋葱对HAAs的抑制效果相比于上述5种调味料较弱，与对照组相比，3%洋葱促进了DMIP、1,5,6-TMIP和IQx这3种HAAs的生成，此时牛肉饼中HAAs总量为34.5 ng/g，对HAAs的抑制率仅为8%，当洋葱添加量增加至6%和9%时，HAAs总量下降至28.0和19.5 ng/g，其对HAAs总量的抑制率分别为25.4%和47.9%。在3个添加量下，洋葱对DMIP、1,5,6-TMIP、PhIP、IQx、MeIQx和4,8-DiMeIQx这6种HAAs的最大抑制率分别为26.4%、42.3%、80.8%、46.1%、40.2%、32.3%。因此，当洋葱添加量为9%时，对HAAs抑制效果最好。JANOSZKA等[28]报道，在炸猪排中添加3%洋葱能显著抑制HAAs的生成（P˂0.05），抑制率为49.5%。郭海涛[16]研究发现，将3%、6%和9%洋葱添加到烤牛肉饼中可以显著降低样品中极性HAAs的生成（P˂0.05），抑制率分别为23.8%、32.9%和54.0%。LU等[29]将0.5%大蒜、洋葱、红辣椒、辣椒粉、生姜和黑胡椒添加到180 °C油炸的牛肉丸中，结果表明，所有香辛料的添加都减少了总HAAs的生成，生姜与其它香辛料相比具有最高的抑制率。6种香辛料对HAAs总量的抑制率分别为47.58%、42.99%、53.79%、46.28%、78.50%、64.65%。
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图 6 洋葱对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响Figure 6. Effect of onion on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties许多研究表明，香辛料的抗氧化性主要与其富含的酚类、黄酮类、酰胺类等抗氧化性成分有关[30]。花椒富含酚类和酰胺类化合物[31]，辣椒富含黄酮类、萜类和酰胺类化合物[32]，黑胡椒富含酰胺类化合物[33]，生姜富含黄酮类化合物[34]，大蒜富含有机硫化物[35]，洋葱富含酚类化合物[36]，在油炸牛肉饼中添加适宜剂量的上述6种香辛料均可抑制HAAs的形成。目前，关于香辛料对HAAs的抑制作用主要有两种观点：第一种观点认为香辛料富含的抗氧化成分可以清除美拉德反应中产生的吡啶和吡嗪自由基，从而阻断HAAs的形成[37-38]；第二种观点认为抗氧化剂可以与形成HAAs的中间体结合形成加合产物从而减少HAAs的生成。CHENG等[39]报道抗氧化剂可以与形成PhIP的一个重要中间体-苯乙醛反应形成加合物，从而抑制了PhIP的形成。由于香辛料成分的复杂性且不同的HAAs的形成机制不尽相同，其对HAAs的其它抑制途径有待进一步的研究。
3. 结论
本文研究了不同添加量的6种传统香辛料（花椒、辣椒、黑胡椒、生姜、大蒜和洋葱）对油炸牛肉饼中8种HAAs生成的影响。结果表明，在油炸牛肉饼中添加6种香辛料均可显著抑制总HAAs的生成（P<0.05）。总体而言，1.5%花椒、1.5%辣椒、0.5%黑胡椒、1%生姜、5%大蒜和9%洋葱分别对油炸牛肉饼中总HAAs的抑制效果最好。本研究结果可以为油炸牛肉饼中HAAs的抑制提供理论参考。
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图 2 辣椒对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响
Figure 2. Effect of chili pepper on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties
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图 3 黑胡椒对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响
Figure 3. Effect of black pepper on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties
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图 4 生姜对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响
Figure 4. Effect of ginger on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties
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图 5 大蒜对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响
Figure 5. Effect of garlic on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties
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图 6 洋葱对油炸牛肉饼中8种HAAs（A）和总HAAs（B）生成的影响
Figure 6. Effect of onion on the formation of 8 HAAs (A) and total HAAs (B) in fried beef patties
表 1 8种HAAs的MRM参数
Table 1 MRM parameters for 8 HAAs
HAAs 母离子
（m/z）特征离子
（m/z）锥孔电压
（V）碰撞能量
（eV）驻留时间
（ms）DMIP 163 148*，
105.170 30 13 1,5,6-TMIP 177 162.1*，
14773 25 13 PhIP 225 210*，
182.91100 30 13 IQ 199 184.2*，
15775 30 13 MeIQ 213 198.1*，
170.1100 25 13 IQx 200 185.1*，
131.280 25 13 MeIQx 214 199*，
13185 25 13 4,8-DiMeIQx 228 213*，
159.995 30 13 注：*表示定量离子。 
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表 2 8种HAAs的线性范围、线性方程、决定系数（R2）、LOD、LOQ和精密度
Table 2 Linear range, regression equation, determination coefficient, LOD, LOQ and precision of 8 HAAs
HAAs 线性范围
（ng/mL）线性方程 R2 LOD
（ng/g）LOQ
（ng/g）精密度
（%）DMIP 0.5~20 y=129.71x−50.709 0.9998 0.075 0.217 10.9 1,5,6-TMIP 0.5~20 y=128.19x+1.0017 0.9992 0.071 0.204 2.5 PhIP 1.0~40 y=90.038x−20.019 0.9999 0.102 0.336 4.3 IQ 0.5~20 y=119.6x−39.091 0.9994 0.050 0.128 2.6 MeIQ 0.5~20 y=100.47x−112.99 0.9993 0.053 0.180 2.5 IQx 0.5~20 y=68.572x−0.3152 0.9995 0.065 0.127 10.0 MeIQx 1.0~40 y=54.813x−10.651 0.9998 0.090 0.226 3.3 4,8-DiMeIQx 0.5~20 y=55.049x−9.7496 0.9998 0.047 0.163 1.2
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表 3 8种HAAs的回收率
Table 3 Recoveries of 8 HAAs
HAAs 加标量（ng/g） 回收率（%） RSD（%） DMIP 1.25 64.3 2.9 2.50 81.5 3.7 3.75 74.7 1.4 1,5,6-TMIP 1.25 61.3 4.0 2.50 73.1 3.9 3.75 85.1 3.3 PhIP 2.50 72.8 2.8 5.00 80.6 5.0 10.00 109.4 3.0 IQ 1.25 54.0 3.5 2.50 61.8 6. 5 3.75 57.5 5.4 MeIQ 1.25 66.6 3.8 2.50 76.6 3.3 3.75 81.4 3.0 IQx 1.25 74.4 6.6 2.50 82.8 6.3 3.75 86.3 3.6 MeIQx 2.50 83.4 1.7 5.00 92.7 8.9 10.00 107.4 8.3 4,8-DiMeIQx 1.25 72.4 3.8 2.50 87.9 7.1 3.75 85.3 4.7
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表 4 6种传统香辛料对油炸牛肉饼中HAAs的抑制率（%）
Table 4 Inhibition rates of 6 traditional spices on the contents of heterocyclic aromatic amines in fried beef patties (%)
香辛料 HAAs 总抑制率 DMIP 1,5,6-TMIP PhIP IQ MeIQ IQx MeIQx 4,8-DiMeIQx 0.5%花椒 74.3±1.6 58.4±2.6 69.1±0.7 — — 42.3±4.2 66.3±2.8 57.7±6.7 67.4±1.7 1.0%花椒 79.0±0.5 67.1±7.1 71.3±1.3 — — 53.2±3.4 73.6±1.7 67.9±1.1 72.8±1.5 1.5%花椒 82.9±0.7 69.4±1.8 77.3±1.3 — — 59.5±5.5 79.8±1.4 75.4±1.5 77.3±0.4 0.5%辣椒 26.0±3.6 51.1±3.4 62.9±3.3 — — 43.0±5.7 53.8±2.7 48.5±2.0 53.6±3.7 1.0%辣椒 35.5±1.5 51.7±1.9 71.6±1.2 — — 56.5±6.3 61.5±1.3 60.2±1.8 60.5±0.7 1.5%辣椒 46.2±2.0 58.0±1.8 77.4±1.7 — — 70.8±0.5 67.5±1.2 69.1±3.0 67.4±1.1 0.5%黑胡椒 51.5±2.2 72.2±1.4 78.7±1.6 — — 54.1±3.7 62.5±3.2 52.7±5.8 65.0±1.1 1.0%黑胡椒 42.6±4.4 64.7±2.5 71.7±2.4 — — 43.9±3.5 65.8±3.3 61.5±2.3 62.9±0.8 1.5%黑胡椒 29.5±3.7 49.0±3.9 60.6±6.5 — — 31.2±3.1 69.3±1.1 64.9±5.9 60.4±1.4 1%生姜 46.8±4.7 65.8±2.2 75.6±0.9 — — 48.4±5.4 66.7±0.8 61.2±3.5 67.1±2.6 2%生姜 35.3±6.8 56.9±1.1 65.7±1.9 — — 43.7±4.0 61.3±1.6 57.3±3.5 58.9±2.0 3%生姜 17.8±3.4 51.7±2.1 59.8±2.7 — — 31.5±4.8 67.8±2.5 61.2±1.5 58.0±1.9 1%大蒜 11.3±2.6 35.7±4.2 41.0±2.9 — — 20.5±3.3 34.7±3.9 18.6±6.0 32.9±2.3 3%大蒜 33.1±1.6 42.0±5.5 56.5±2.5 — — 38.3±2.8 51.8±1.3 44.4±1.7 49.9±1.6 5%大蒜 45.5±2.3 44.0±3.2 65.8±1.1 — — 59.0±1.9 62.3±0.6 67.7±2.4 61.2±0.9 3%洋葱 −3.8±4.3 −10.1±2.1 27.4±3.9 — — −7.7±6.5 1.6±1.6 1.6±3.1 8.0±2.0 6%洋葱 4.5±3.8 25.1±1.6 56.9±2.9 — — 21.7±1.8 15.5±2.9 9.6±1.4 25.4±2.2 9%洋葱 26.4±4.6 42.3±1.9 80.8±1.9 — — 46.1±3.7 40.2±4.5 32.3±1.7 47.9±1.4 注：抑制率数据以平均值±标准偏差表示；—表示未检测出。
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