Properties of Pseudomonas aeruginosa Phage K4 and Its Applications in Food Preservation
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摘要: 目的：为研究噬菌体在控制细菌污染方面的应用，本文对铜绿假单胞菌噬菌体K4的生物学性质及抑菌活性进行了探究。方法：包括一步生长曲线、稳定性研究、基因组测序、比较基因组学分析以及抑菌曲线等方法。结果：K4潜伏期约为15 min，释放量约为85 PFU/infection center，具有较强的感染性；在不同感染复数（MOI）下，噬菌体K4对宿主菌均有明显的抑制效果；基因组分析显示，K4基因组长度为50358 bp，编码77个蛋白和1个tRNA-Arg；比较基因组学分析发现，噬菌体K4与Paundecimvirus属的Pseudomonas virus PA11基因组序列的一致性达95.08%，证实噬菌体K4是该属的新成员。在应用实验中，噬菌体K4能够显著抑制牛奶和午餐肉等样品中宿主菌的生长，同时噬菌体的数量也有显著增加。本研究结果显示，噬菌体K4生长速度快，具有较强的杀菌活性，基因组不携带整合酶、抗性以及毒力因子等编码基因。结论：噬菌体K4可以用于控制食品中铜绿假单胞菌的污染。Abstract: Objective: To study phage applications in the control of bacteria contaminations, Pseudomonas aeruginosa phage K4 was characterized for its biological characteristics and inhibition effects of bacterial growth. Methods: One-step growth curve, phage stability, genome sequencing, comparative genomics analysis, and growth inhibition curve were conducted in this work. Results: One-step growth curve showed that phage K4 had a latent phase of 15 min and a burst size of about 85 PFU/infection center, displaying a strong infectivity. Under different MOIs (multiplicity of infection), phage K4 efficiently inhibited the growth of the host cells. Genomic analysis revealed that phage K4 had a genome of 50358 bp with 77 coding sequences and 1 tRNA-Arg gene. Comparative genomics showed that the genome of phage K4 shared an identity of 95.08% with Pseudomonas virus PA11 which belongs to the Paundecimvirus genus of the Zobellviridae family, suggesting that phage K4 might be a new member of the Paundecimvirus genus. In application assays, phage K4 could significantly control the growth of the host cells in sterilized milk and ready-to-eat beef samples along with obvious reproductions of phage K4. In conclusion, the data suggested that phage K4 was a lytic virus that replicated rapidly with relatively high bactericidal activity. Conclusion: The genome of phage K4 did not carry genes for integration, antibiotic resistance, and virulence, appropriately to be selected as a biocontrol agent in the control and prevention of P. aeruginosa contaminations in foods.
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Keywords:
- Pseudomonas aeruginosa /
- phage /
- inhibitory activity /
- genome annotation /
- application
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会致病菌，可引起人类一系列感染疾病[1]。在某些环境中，铜绿假单胞菌可污染食物，引起食源性疾病[2]。目前在食品、医疗领域中常用使用抗生素以达到对其的治疗和预防作用，然而在临床分离菌株中，约90%的铜绿假单胞菌对单一抗生素产生了耐药性，这极大威胁到了人类的公共健康、食品安全及畜禽饲料安全，因此具有宿主特异性的噬菌体疗法应被重视。
噬菌体（phage）是细菌病毒，能够特异性地杀死宿主菌，是一种具有抑菌活性的天然抗菌剂并具有一定的防腐能力[3-5]。噬菌体可特异性裂解多重耐药性菌株，菌株的耐药性与噬菌体感染过程无关，且噬菌体在感染宿主菌的过程中数量不仅不会减少，反而会在宿主菌内增多，有较好的抑菌效果[6-8]。目前已分离鉴定多株铜绿假单胞菌噬菌体，其中部分铜绿假单胞菌噬菌体的受体已被发现，如噬菌体MPK7[9]和D3112[10]的受体为Type IV菌毛，噬菌体K8[11]、C11[12]、O4[13]、K5[14]、FIZ15[15]、PaP1[16]、PaP3[17]、JG024[18]的受体为LPS。噬菌体具有宿主特异性，很多铜绿假单胞菌噬菌体的受体是脂多糖（LPS），铜绿假单胞菌的LPS结构比较复杂，血清型较多，噬菌体识别LPS特异性较强，因此宿主范围较窄。为了满足噬菌体应用需求，尽可能多的分离鉴定噬菌体，分析噬菌体受体、基因组功能注释，此举将为制备不同噬菌体制剂提供实验材料[19]。
本实验室在之前的工作中以P. aeruginosa PAK为指示菌，从公园污泥中分离得到了一株铜绿假单胞菌噬菌体K4[20]。透射电镜显示噬菌体K4具有正二十面体的头部和可伸缩的尾部。本研究以噬菌体K4为研究对象，分别对其生物学特性、基因组学、比较基因组学以及在牛奶和午餐肉中的抑菌效率进行分析，探讨噬菌体K4在食品安全[10]等领域中控制铜绿假单胞菌污染的可能性。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
铜绿假单胞菌菌株、噬菌体、质粒等 如表1所示；牛奶、午餐肉 购自超市；蛋白胨、酵母浸粉 北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、氢氧化钠（分析纯） 天津市津东天正精细化学试剂厂；硫酸庆大霉素（纯度≥590 mcg/mg） 北京博奥拓达科技有限公司；氨苄青霉素钠（纯度≥85%） 北京索莱宝科技有限公司。
表 1 本研究中所用菌株、噬菌体和质粒Table 1. Strains, phages and plasmids used in this study菌株、噬菌体、质粒 描述 菌株、质粒、噬菌体来源 P. aeruginosa PAK Laboratory strain, serotype O6 [21] M4 wbpR::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M19 wzy::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M25 wzy::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M30 wzy::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M39 wbpL::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] RC11-2 BN889_05221:: GmR mutant of PAK, resistant to phage C11 [12] SK45 wbpR::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] SK16 wbpV::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] SK75 Y880_RS05480 ::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] SK98 ssg::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] Plasmid pZM1504 wbpR gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [13] pLLY1501 wzy gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [13] pZM1502 wbpL gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [13] pXL1502 BN889_05221 gene driven by Plac promoter cloned in pUCP18, ApR [12] pXL1503 wbpR gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [11] pFJ1501 wbpV gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [11] pLY1201 Y880_RS05480 gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [11] pXW1501 ssg gene driven by Plac cloned in pUCP18, ApR [11] Phage K4 lytic phage specific to the strain PAK [20] K5 lytic phage specific to the strain PAK [14] K8 lytic phage specific to the strain PAK [11] O4 lytic phage specific to the strain PAO1 [13] C11 lytic phage specific to the strain TJC422 [12] HZQ-X100恒温振荡培养箱 苏州市培英实验设备有限公司；TG16-W微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；LRH-250S恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司；Infinite F50 ELISA酶标仪 瑞士TECAN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 噬菌体K4悬液的制备
培养100 mL铜绿假单胞菌PAK至对数生长期（OD600=0.4），加入109 PFU/mL噬菌体K4，于37 ℃条件下振荡培养4 h，裂解液12000 r/min离心10 min，上清液再用0.22 μm滤膜过滤除菌制得噬菌体K4悬液。
1.2.2 噬菌体K4的氯仿稳定性实验
取500 μL噬菌体悬液与500 μL氯仿充分振荡后静置1 h，12000 r/min离心10 min，10-4~10-8系列稀释的样品分别与指示菌混合倒双层平板，37 ℃过夜培养后噬菌斑计数，计算培养液中噬菌体的浓度，测定上清液中噬菌体滴度。
1.2.3 噬菌体K4的热稳定性实验
分别取1 mL滴度为3.84×1010 PFU/mL噬菌体K4悬液分装于1.5 mL EP管中，分别置于30、40、50、60、70、80 ℃的水浴锅中处理1 h，10−1~10−7梯度稀释处理后的样品，测定噬菌体滴度，计算噬菌体在各个温度下的存活率。将30 ℃处理的样品设置为对照组。
1.2.4 噬菌体K4宿主范围的确定
选择铜绿假单胞菌野生型PAK和多株插入突变株（表1），确定宿主范围。挑取单菌落于LB培养基中过夜培养，制备双层平板，稀释噬菌体悬液至108 PFU/mL取1 µL噬菌体稀释液点板，进行spotting实验，所用噬菌体K4[20]、K5[14]、K8[11]、O4[13]、C11[12]。
1.2.5 噬菌体K4基因组的提取及测序
按照文献[22]提供的方法提取噬菌体基因组，具体为：培养宿主菌PAK至OD600=0.6，加入噬菌体K4裂解液，振荡培养4~5 h，扩增噬菌体。
向裂解液中加入氯化钠，终浓度为0.1 mol/L冰浴1 h后，12000 r/min离心去除沉淀。上清液中加入DNase I和RNase A至终浓度均为10 μg/mL，37 ℃静置1 h，去除宿主菌的DNA和RNA。上清液中加入聚乙二醇6000（PEG 6000）至终浓度为10%（w/v）充分溶解，4 ℃静置过夜。
12000 r/min离心保留沉淀，用2 mL TM溶液（0.05 mol/L Tris-HCl与0.2% MgSO4·7H2O混合，pH调至7.0）重悬噬菌体，分别加入DNase I和RNase A至终浓度为10 μg/mL，37 ℃静置1 h。分别加入SDS和蛋白酶K，终浓度分别为0.5%和50 μg/mL，56 ℃水浴4 h。加入与重悬液等体积的氯仿/异戊醇（24:1），振荡30 s，12000 r/min离心10 min，收集上层水相，去除PEG 6000，再用等体积的苯酚-氯仿抽提至无蛋白膜后用氯仿抽提一次，加入2.5倍体积的95%乙醇，−20 ℃静置2 h，12000 r/min离心10 min，用70%乙醇洗涤，干燥后用ddH2O重悬噬菌体基因组DNA。
将K4基因组DNA送至金唯智公司（www.genewiz.com）进行测序，测序平台为Illumina Hiseq2500。将测序结果使用Trimmomatic（v0.30）软件去除低质量及接头序列获得Clean Data，有4229838条reads，共计419367181 bp。使用软件Velvet_v1.12.10进行组装拼接，获得1条组装基因组序列，共计50284 bp。并将该序列保存在NCBI的GenBank中，登录号为MW929175。
1.2.6 噬菌体K4基因组的功能注释
使用在线网站RAST Server（https://rast.nmpdr.org/）[23]和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）对噬菌体K4的基因组进行蛋白功能注释。推定铜绿假单胞菌噬菌体K4基因组上的编码基因，将基因编码的蛋白在NCBI数据库中进行分析比对，推测其蛋白的功能[24]。使用在线软件CGview Server（http://cgview.ca/）绘制基因组功能注释图[25]。
1.2.7 噬菌体K4的比较基因组分析与分类
利用NCBI数据库对K4基因组序列进行同源性搜索，获得与噬菌体K4同源的噬菌体基因组序列，利用在线软件Circoletto分析基因组间的同源性（http://tools.bat.infspire.org/circoletto/）。另一方面，利用在线软件CoreGenes5.0（https://coregenes.ngrok.io/），分别分析噬菌体K4与其它噬菌体蛋白质组相似的程度。对病毒蛋白编码基因碱基序列的相似性，其E-value小于1e-5的且覆盖率大于或等于75%，则判断为相似。两个噬菌体蛋白质组中，超过40%的噬菌体蛋白相似，则将两个噬菌体分类为同一属[26-27]。
1.2.8 噬菌体K4的一步生长曲线
宿主菌培养至OD600=0.6，5000 r/min离心5 min，收集的宿主菌细胞重悬于500 μL液体LB培养基中，加入等体积噬菌体悬液，使得MOI约为0.0001，混匀后静置吸附1 min，12000 r/min离心30 s，去除上清液，将沉淀重悬于100 mL新鲜LB液体培养基中。每隔5 min取样100 μL，测定噬菌体滴度。
1.2.9 噬菌体K4的抑菌活性分析
将300 µL宿主菌PAK以3%转接量转接至含有100 mL液体LB培养基中，将噬菌体K4（滴度约为3.384×1010 PFU/mL）分别控制MOI在10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001；按照不同MOI，使指示菌与噬菌体混合，取上述混合培养液200 µL至无菌96孔板中，每个MOI设置6个平行。并加入200 µL液体LB培养基作为对照组。将96孔板置于37 ℃摇床中，160 r/min振荡培养12 h，每隔30 min测量96孔板中培养物的OD600数值，测定细菌浓度，绘制噬菌体抑菌曲线。
1.2.10 噬菌体对牛奶中细菌的影响
取20 mL规格为1×250 mL的无菌牛奶与20 µL 109 CFU/mL的宿主菌PAK混匀后，取1.8 mL混合液分装于4 mL无菌EP管中。将用0.22 μm滤膜过滤处理两次的噬菌体裂解液系列稀释，取200 μL稀释液与1.8 mL牛奶样品混匀，使得最终MOI为1和10，样品分别于4和25 ℃静置培养24 h。取样系列稀释后涂布LB平板，37 ℃过夜培养后菌落计数，计算培养液中的细菌浓度。系列稀释的样品分别与指示菌混合倒双层平板，37 ℃培养过夜培养后噬菌斑计数，计算培养液中噬菌体的浓度。只加噬菌体K4和只加宿主菌的样品作为空白对照，每组设立三个平行。
1.2.11 噬菌体对午餐肉中细菌的影响
将340 g/罐的无菌午餐肉罐头切成1.5 cm×1.5 cm的小方块，然后放于30×40 mm，体积为20 mL的无菌取样瓶中。取10 μL宿主菌PAK滴加到午餐肉切块表面（菌浓为106 CFU/mL）。分别取10 μL噬菌体裂解液（滴度约为3.38×108和3.38×109 PFU/mL），以MOI为1和10滴加到午餐肉表面，样品分别于4和25 ℃静置培养24 h。取样系列稀释后涂布LB平板，37 ℃培养过夜培养后菌落计数，计算培养液中的细菌浓度。系列稀释的样品分别与指示菌混合倒双层平板，37 ℃过夜培养后噬菌斑计数，计算培养液中噬菌体的浓度。只加噬菌体K4和只加宿主菌的样品作为空白对照，每组设立三个平行。
1.3 数据处理
实验中每组数据均为3次重复，利用Student t-test进行组间数据分析，采用Excel 2016软件作图。
2. 结果与分析
2.1 噬菌体K4的稳定性分析
噬菌体在氯仿中的稳定性实验表明：在滴度为3.84×1010 PFU/mL的噬菌体K4裂解液中加入氯仿，结果如图1A所示，噬菌体滴度降至1.6×1010 PFU/mL，存活率为42%，其氯仿的耐受程度高于噬菌体PA-27-1[28]、PaP6[29]、PHW2[30]等铜绿假单胞菌噬菌体。
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图 1 噬菌体K4的稳定性分析注：A：噬菌体K4的氯仿稳定性；B：噬菌体K4的热稳定性；***：P<0.001。Figure 1. Stability analysis of phage K4噬菌体在不同温度下的稳定性实验表明：滴度为3.84×1010 PFU/mL的噬菌体K4分别在30、40、50、60、70、80 ℃培养1 h后，测定噬菌体滴度变化如图1B所示。在32~50 ℃噬菌体滴度轻微下降，50 ℃时存活率为74.12%，60 ℃时存活率为28.10%，70 ℃时存活率仅为1.10%，80 ℃几乎检测不到噬菌体，噬菌体K4与噬菌体D204[31]、PaP3[32]、PA-YS35[33]的温度敏感性相似，即在30~60 ℃温度范围内较稳定，60 ℃以上噬菌体数量急剧下降。综上所述，该噬菌体易于制备、储存及运输，为在食品中应用提供了实验材料[34]。
2.2 噬菌体K4的宿主范围
为了进一步确定噬菌体K4的受体是否与LPS相关。本研究分别测定了噬菌体K4[20]作用于噬菌体K8[11]、C11[12]、K5[14]、O4[13]完全耐受突变株M4、SK45（阻断基因为wbpR），M19（阻断基因为wbpT），M25、M30、SK75（阻断基因为wzy），M39、SK16（阻断基因为wbpV），RC11-2（阻断基因为BN889_05221），SK98（阻断基因为ssg）及回复株的敏感性实验。结果如表2所示，噬菌体K4、K5、O4在除RC11-2突变株外，均无透明区域形成，K8、C11在10株突变株上均能形成透明区域；上述噬菌体在10株突变株的互补株上均出现透明区域。上述基因均为生物合成O-specific antigen（OSA）的相关基因，因此本研究推测OSA为噬菌体K4的受体。
表 2 噬菌体K4的宿主范围分析Table 2. Host range of phage K4K4 K5 K8 C11 O4 M4 − − − − − M4/pZM1504 + + + + + M19 − − − − − M19/pLLY1501 + + + + + M25 − − − − − M25/pLLY1501 + + + + + M30 − − − − − M30/pLLY1501 + + + + + M39 − − − − − M39/pZM1502 + + + + + RC11-2 + + − − + RC11-2/pXL1502 + + + + + SK16 − − − − − SK16/pFJ1501 + + + + + SK45 − − − − − SK45/pXL1503 + + + + + SK75 − − − − − SK75/Ply1201 + + + + + SK98 − − − − − SK98/pXW1501 + + + + + 2.3 基因组末端的确定
通过Illumina Hiseq2500对噬菌体K4进行测序，测序结果显示组装基因组大小为50284 bp。将测序结果在NCBI中进行BlastN比对，噬菌体K4与噬菌体O4有96%同源性，且均为铜绿假单胞菌噬菌体。噬菌体O4为线性双链DNA，推测噬菌体K4也为线状。噬菌体O4基因组末端存在74 bp的正向末端重复序列，比对分析发现，噬菌体K4基因组序列的6436~6509 bp与噬菌体O4的末端74 bp的重复序列具有100%同源性，推测其可能为噬菌体K4的正向末端重复序列。为了验证噬菌体K4重组基因组结果的正确性，本研究提取噬菌体K4基因组，进行补平连接和扩增，测序后发现发现扩增产物中有两个74 bp的相同序列，为该基因组的真实末端序列。本文将噬菌体K4基因组结构进行重新调整，在基因组3'端加上一个74 bp的拷贝，修订后的噬菌体K4实际基因组大小为50358 bp。
2.4 基因组功能注释
噬菌体K4基因组分别通过RAST Server、CGview Server在线软件和NCBI蛋白数据库进行比对分析，选取最优匹配结果作为注释信息。外环表正义链和负义链上的基因，次外环表示为GC Skew，计算公式为（G-C）/（G+C），绿色代表（G-C）/（G+C）>0，紫色代表（G-C）/（G+C）<0，内环表示基因组G+C含量的分布。噬菌体K4基因组的GC含量为44.61%，与其他假单胞菌噬菌体相近，其中K8基因组[11]和K5基因组[14]的GC含量为49.35%，O4基因组[13]的GC含量为44.55%，而PAK菌株的GC含量为66.25%（图2）。K4基因组长度为50358 bp，编码46个假定蛋白、31个具有假定功能的蛋白以及1个tRNA-Arg基因。噬菌体K4基因组中蛋白编码基因包含参与复制、转录、DNA修复蛋白、磷代谢的蛋白以及假定蛋白；有22个基因位于负义链上，56个基因位于正义链上。除gp01、gp10、gp45基因仅存在于K4噬菌体基因组外，其余基因均与其他噬菌体有不同程度的相似性（表3）。
表 3 噬菌体K4基因组注释Table 3. Annotation of the phage K4 genome基因 起始 终止 基因方向 同源噬菌体 覆盖率（%） 功能 gp09 3371 3871 + vB_PaeM_MIJ3 50.30 possible DNA binding protein gp13 5094 5167 + tRNA-Arg-TCT gp21 7453 8073 + O4 100.00 putative amidotransferase gp24 8905 10176 + O4 100.00 putative amidotransferase gp25 10186 11046 + O4 100.00 putative COOH-NH2 ligase gp27 11594 12544 + O4 100.00 putative amidoligase gp28 12544 13293 + O4 100.00 putative ATP-grasp protein gp31 13830 14129 + O4 90.91 DNA-binding protein gp35 14861 16576 + O4 100.00 DNA primase/helicase, phage-associated gp36 16576 17082 + O4 98.19 RNA polymerase sigma factor gp39 17395 19272 + O4 99.84 Phage DNA polymerase I gp45 20776 21651 + O4 100.00 putative 5'-3' exonuclease gp46 21630 22130 + O4 100.00 putative serine/threonine protein phosphatase gp47 22105 22527 + O4 100.00 putative terminase small subunit gp50 23113 23880 + O4 100.00 putative 3'-5' exonuclease gp51 23882 24109 + TC6 91.30 DUF3310 domain-containing protein gp52 24090 24731 + O4 100.00 putative thymidylate synthase gp54 25253 25900 + O4 100.00 putative PhoH-like protein gp55 25884 26258 + O4 100.00 Phage thioredoxin or glutaredoxin （Nrd） gp56 26242 27210 + O4 100.00 putative ribonucleotide reductase gp57 27204 28898 + O4 100.00 putative ribonucleotide reductase gp58 29251 28973 − PA11 100.00 Phage capsid and scaffold gp61 30197 29760 − O4 100.00 putative endolysin gp62 31962 30184 − IME180 98.99 putative hemagglutinin protein gp65 39780 37465 − O4 100.00 putative head closure protein gp67 40765 39962 − TC6 99.25 putative adaptor protein gp69 41707 41441 − O4 100.00 putative head fiber protein gp71 43028 42087 − O4 100.00 putative capsid protein gp72 43797 43039 − O4 100.00 putative scaffold protein gp74 45909 44155 − O4 100.00 putative portal protein gp75 47529 45922 − GP100 74.48 Phage terminase, large subunit gp77 49483 48089 − O4 99.78 putative pectate lyase 注：identity根据氨基酸水平计算。 噬菌体K4基因组中gp51和gp46分别编码DNA的核酸外切酶，此外噬菌体还携带编码DNA和RNA聚合酶、DNA结合蛋白等基因，在噬菌体复制及裂解宿主菌发挥作用。在K4基因组中，gp01、gp10和gp45等基因编码的蛋白为假定蛋白，在数据库中没有发现同源蛋白，其功能有待于进一步研究。噬菌体K4编码末端酶大亚基具有核酸内切酶活性和拓扑酶活性，在没有小亚基的存在的情况下完成噬菌体基因组的包装[35]。
2.5 比较基因组学分析与分类
利用BLASTN软件，在NCBI的GENBANK数据库进行比对分析，获得8个噬菌体基因组序列，与噬菌体K4基因组序列具有较高的同源性。噬菌体K4与噬菌体O4（NC_031274.1）、IME180（MF788075.1）、TC6（MG676466.1）、PA11（NC_007808.1）、BUCT566（MW748993.1）、MD8（KX198612.1）、LKA5（KC900378.1）和F116（NC-006552.1）的同源性分别为99.53%、98.18%、95.2%、95.08%、71.84%、95.56%、86.27%、86.27%，与之相应的覆盖率分别为96%、94%、85%、82%、1%、0%、0%和0%。分析显示，噬菌体K4与噬菌体O4、IME180、TC6、PA11的同源性较高，而与噬菌体LKA5、F116、BUCT566、MD8覆盖率极低，几乎没有同源性。
如图3，将这些基因组序列导入线上分析软件Circoletto，进一步分析噬菌体K4和8株噬菌体基因组的同源性。圆环内为使用circletto软件将比对的序列不同的色带表示blast生成的数据局部对齐。颜色根据bitscore的宽度和对齐长度划分，相似度不同即丝带的颜色不同，丝带颜色表示为最大的命中值，即蓝色≤25%，绿色≤50%，黄色≤75%，红色>75%。
进一步通过CoreGenes5.0在线软件分析发现，噬菌体K4与噬菌体O4（NC_031274.1）、IME180（MF788075.1）、TC6（MG676466.1）、PA11（NC_007808.1）、共享核心基因的比例分别为85.9%、87.1%、70.5%、70.5%，超过了40%的标准，属于同一属的病毒。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）（https://talk.ictvonline.org/）发布的病毒分类清单（ICTV 2020 Master Species List，MSL36）显示，PA11属于Zobellviridae科Paundecimvirus属，因此噬菌体K4可能是该属的新成员[26-27,36-37]。
2.6 噬菌体K4的抑菌活性
在MOI约为10−5时，噬菌体K4一步生长曲线的结果显示，噬菌体K4的潜伏期约为15 min，13~28 min噬菌体滴度急剧增加，此时为噬菌体的爆发期，爆发期后的10 min内噬菌体数量几乎无变化，即此时间段为噬菌体进入稳定期。根据释放量公式：释放量=平台期噬菌体平均滴度/潜伏期噬菌体平均滴度，即此噬菌体释放量约为95.2 PFU/Infection Center，一个感染周期约为35 min（图4A）。
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图 4 噬菌体K4生物学特性注：A：噬菌体K4的一步生长曲线；B：噬菌体K4的抑菌曲线。Figure 4. Biological characteristics of phage K4不同MOI的噬菌体K4与宿主菌铜绿假单胞菌PAK混合培养，测定噬菌体K4作用于PAK的抑菌曲线。结果表明，随着加入的噬菌体效价的增加，宿主菌铜绿假单胞菌生长趋势明显下降，当MOI=10和MOI=1时，宿主菌几乎不生长；当MOI=0.00001和0.0001时，宿主菌0~2 h生长趋势与对照组几乎一致，2~3 h之间菌液生长趋势迅速下降且在3 h后宿主菌PAK不继续生长（图4B）。实验结果表明，噬菌体K4能显著抑制铜绿假单胞菌PAK的生长，噬菌体应用在食品中控制致病菌将成为一个热点和趋势[38]。
2.7 噬菌体K4控制牛奶中细菌的生长
Donovan等将噬菌体phi11应用到牛奶中的实验表明该噬菌可有效控制牛奶中的致病菌[39]。本研究在牛奶中加入铜绿假单胞菌，分析噬菌体K4的杀菌效果。在4 ℃条件下，对照组中的细菌浓度为1.31×108 CFU/mL，实验组细菌浓度分别为8.08×106 CFU/mL（MOI=1）和1.26×108 CFU/mL（MOI=10），杀菌效率分别为93.73%和99.02%，杀菌效果显著。在抑制细菌增长的同时，噬菌体由2.20×107 PFU/mL分别增长到1.59×109 PFU/mL（MOI=1）和4.95×108 PFU/mL（MOI=10），分别增长了约71和22倍。25 ℃条件下，对照组的细菌浓度为6.79×108 CFU/mL，实验组细菌浓度分别为1.41×108 CFU/mL（MOI=1）和7.90×106 CFU/mL，杀菌效率分别为79.29%和98.84%。与此同时，噬菌体浓度由1.47×107 PFU/mL分别增长到2.20×109 PFU/mL（MOI=1）和2.09×109 PFU/mL（MOI=10），噬菌体分别增长了约149和142倍（图5）。结果显示，在牛奶中，噬菌体K4可以有效抑制铜绿假单胞菌的生长。
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图 5 在4和25 °C条件下不同MOI的噬菌体在牛奶中的细菌浓度和噬菌体滴度注：A：在4 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；B：在4 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；C：在25 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；D：在25 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；*：P<0.05；***：P<0.001。Figure 5. Colony forming unit and titer of phage with different MOI in milk at 4 and 25 °C2.8 噬菌体K4控制午餐肉中细菌的生长
在午餐切片上涂布铜绿假单胞菌细胞，分析噬菌体K4的杀菌效果，在4 ℃条件下，对照组的细菌浓度为9.30×104 CFU/mL。MOI=10时，细菌的浓度为3.40×103 CFU/mL杀菌效率为96.34%，噬菌体由3.30×104 PFU/mL增长到1.44×105 PFU/mL，噬菌体增长了约3倍；当MOI=1时，细菌的浓度为1.09×104 CFU/mL，杀菌效率为88.28%，噬菌体由3.30×104 PFU/mL增长到2.26×105 PFU/mL，增长了约6倍。在25 ℃条件下，在MOI分别为1和10时，噬菌体的杀菌效率分别为94.89%和99.15%，均能超过90%，杀菌效果显著，噬菌体分别增长了约33和78倍（图6）。数据显示，在不同条件下，噬菌体K4可以有效抑制铜绿假单胞菌在午餐肉表面的生长[38,40]。
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图 6 在4和25 °C条件下不同MOI的噬菌体在午餐肉中的细菌浓度和噬菌体滴度注：A：在4 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；B：在4 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；C：在25 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；D：在25 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；*：P<0.05；***：P<0.001。Figure 6. Colony forming unit and titer of phage with different MOI in Luncheon meat at 4 and 25 °C3. 结论
一步生长曲线结果显示，该噬菌体具有潜伏期较短、释放量大的特点，具有较高的感染性。另一方面，噬菌体K4在抑菌曲线等实验中，显示了较强的杀菌活性。其基因组不携带重组酶、抗性及毒力因子等编码基因，具有安全性，能够有效地控制牛奶和午餐肉等食品中铜绿假单胞菌的生长。因此，噬菌体K4可以用于食品等行业控制铜绿假单胞菌的污染。
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图 1 噬菌体K4的稳定性分析
注：A：噬菌体K4的氯仿稳定性；B：噬菌体K4的热稳定性；***：P<0.001。
Figure 1. Stability analysis of phage K4
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图 4 噬菌体K4生物学特性
注：A：噬菌体K4的一步生长曲线；B：噬菌体K4的抑菌曲线。
Figure 4. Biological characteristics of phage K4
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图 5 在4和25 °C条件下不同MOI的噬菌体在牛奶中的细菌浓度和噬菌体滴度
注：A：在4 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；B：在4 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；C：在25 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；D：在25 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；*：P<0.05；***：P<0.001。
Figure 5. Colony forming unit and titer of phage with different MOI in milk at 4 and 25 °C
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图 6 在4和25 °C条件下不同MOI的噬菌体在午餐肉中的细菌浓度和噬菌体滴度
注：A：在4 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；B：在4 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；C：在25 °C条件下，在噬菌体作用下宿主菌浓度的变化；D：在25 °C条件下，噬菌体K4效价的变化；*：P<0.05；***：P<0.001。
Figure 6. Colony forming unit and titer of phage with different MOI in Luncheon meat at 4 and 25 °C
表 1 本研究中所用菌株、噬菌体和质粒
Table 1 Strains, phages and plasmids used in this study
菌株、噬菌体、质粒 描述 菌株、质粒、噬菌体来源 P. aeruginosa PAK Laboratory strain, serotype O6 [21] M4 wbpR::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M19 wzy::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M25 wzy::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M30 wzy::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] M39 wbpL::GmR mutant of PAK, resistant to phage O4 [13] RC11-2 BN889_05221:: GmR mutant of PAK, resistant to phage C11 [12] SK45 wbpR::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] SK16 wbpV::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] SK75 Y880_RS05480 ::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] SK98 ssg::GmR mutant of PAK, resistant to phage K8 [11] Plasmid pZM1504 wbpR gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [13] pLLY1501 wzy gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [13] pZM1502 wbpL gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [13] pXL1502 BN889_05221 gene driven by Plac promoter cloned in pUCP18, ApR [12] pXL1503 wbpR gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [11] pFJ1501 wbpV gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [11] pLY1201 Y880_RS05480 gene with its own promoter cloned in pUCP18, ApR [11] pXW1501 ssg gene driven by Plac cloned in pUCP18, ApR [11] Phage K4 lytic phage specific to the strain PAK [20] K5 lytic phage specific to the strain PAK [14] K8 lytic phage specific to the strain PAK [11] O4 lytic phage specific to the strain PAO1 [13] C11 lytic phage specific to the strain TJC422 [12] 
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表 2 噬菌体K4的宿主范围分析
Table 2 Host range of phage K4
K4 K5 K8 C11 O4 M4 − − − − − M4/pZM1504 + + + + + M19 − − − − − M19/pLLY1501 + + + + + M25 − − − − − M25/pLLY1501 + + + + + M30 − − − − − M30/pLLY1501 + + + + + M39 − − − − − M39/pZM1502 + + + + + RC11-2 + + − − + RC11-2/pXL1502 + + + + + SK16 − − − − − SK16/pFJ1501 + + + + + SK45 − − − − − SK45/pXL1503 + + + + + SK75 − − − − − SK75/Ply1201 + + + + + SK98 − − − − − SK98/pXW1501 + + + + +
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表 3 噬菌体K4基因组注释
Table 3 Annotation of the phage K4 genome
基因 起始 终止 基因方向 同源噬菌体 覆盖率（%） 功能 gp09 3371 3871 + vB_PaeM_MIJ3 50.30 possible DNA binding protein gp13 5094 5167 + tRNA-Arg-TCT gp21 7453 8073 + O4 100.00 putative amidotransferase gp24 8905 10176 + O4 100.00 putative amidotransferase gp25 10186 11046 + O4 100.00 putative COOH-NH2 ligase gp27 11594 12544 + O4 100.00 putative amidoligase gp28 12544 13293 + O4 100.00 putative ATP-grasp protein gp31 13830 14129 + O4 90.91 DNA-binding protein gp35 14861 16576 + O4 100.00 DNA primase/helicase, phage-associated gp36 16576 17082 + O4 98.19 RNA polymerase sigma factor gp39 17395 19272 + O4 99.84 Phage DNA polymerase I gp45 20776 21651 + O4 100.00 putative 5'-3' exonuclease gp46 21630 22130 + O4 100.00 putative serine/threonine protein phosphatase gp47 22105 22527 + O4 100.00 putative terminase small subunit gp50 23113 23880 + O4 100.00 putative 3'-5' exonuclease gp51 23882 24109 + TC6 91.30 DUF3310 domain-containing protein gp52 24090 24731 + O4 100.00 putative thymidylate synthase gp54 25253 25900 + O4 100.00 putative PhoH-like protein gp55 25884 26258 + O4 100.00 Phage thioredoxin or glutaredoxin （Nrd） gp56 26242 27210 + O4 100.00 putative ribonucleotide reductase gp57 27204 28898 + O4 100.00 putative ribonucleotide reductase gp58 29251 28973 − PA11 100.00 Phage capsid and scaffold gp61 30197 29760 − O4 100.00 putative endolysin gp62 31962 30184 − IME180 98.99 putative hemagglutinin protein gp65 39780 37465 − O4 100.00 putative head closure protein gp67 40765 39962 − TC6 99.25 putative adaptor protein gp69 41707 41441 − O4 100.00 putative head fiber protein gp71 43028 42087 − O4 100.00 putative capsid protein gp72 43797 43039 − O4 100.00 putative scaffold protein gp74 45909 44155 − O4 100.00 putative portal protein gp75 47529 45922 − GP100 74.48 Phage terminase, large subunit gp77 49483 48089 − O4 99.78 putative pectate lyase 注：identity根据氨基酸水平计算。
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