Establishment of HPLC-MS/MS Method for Determination of Nine Diarrhoeal Shellfish Toxins
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摘要: 建立一种同时测定贝类产品中9种腹泻性贝类毒素的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法。本文通过优化色谱条件、质谱条件、前处理等步骤，最终确定以80%乙腈水溶液对样品进行提取，利用QuEChERS和分散固相萃取技术进行净化，以C18色谱柱进行分离，5 mmoL/L乙酸铵（加0.1%甲酸）缓冲液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，质谱采用多反应监测模式（MRM），外标法定量。9种腹泻性贝类毒素在质量浓度0.5～50 ng/mL的范围内线性关系良好，其线性相关系数均在0.996以上，检出限为1～10 μg/kg，回收率为87.2%～111.2%，相对偏差（n=6）为2.8%～9.2%。结果表明，该方法前处理简便快捷，准确性高、灵敏度较高、重现性好，而且节约成本，适合大批量检验，满足实际检测要求。
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关键词:
- 腹泻性贝类毒素 /
- 高效液相色谱-串联质谱 /
- 贝类 /
- 检测
Abstract: A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was developed for simultaneous determination of nine diarrhoeal shellfish toxins in shellfish products. In this paper, through optimizing the chromatographic conditions, mass spectrometry conditions, pretreatment methods and other steps, it was finally determined that 80% acetonitrile aqueous solution was used to extract the sample, QuEChERS and dispersed solid-phase extraction technology were used to purify the sample, C18 chromatographic column was used for separation, 5 mmol/L ammonium acetate (plus 0.1% formic acid) buffer and acetonitrile were used as mobile phase for gradient elution, and mass spectrometry was quantified by multiple reaction monitoring mode (MRM) and external standard method. The 9 kinds of diarrhoeal shellfish toxins had a good linear relationship within the mass concentration range of 0.5~50 ng/mL. The linear determination coefficient were above 0.996. The limits of detection were 1~10 μg/kg. The recoveries were 87.2%~111.2%. The relative deviation (n=6) of the measured values was 2.8%~9.2%. The results showed that the method is simple and quick, with high accuracy, sensitivity, reproducibility and cost saving. It was suitable for mass inspection and meets the requirements of practical testing.-
Keywords:
- diarrhetic shellfish poisoning (DSP) /
- UPLC-MS/MS /
- shellfish /
- detection
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海洋生物毒素是一类存在于海洋生物体内的特殊高活性代谢产物，多存在于贝类及西甲鱼类中，其生物结构为生物碱和多肽，按其毒素毒性作用机制可分为麻痹性贝类毒素、腹泻性贝类毒素、失忆性贝类毒素及神经性贝类毒素。其中腹泻性贝类毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是一类大环内酯或聚醚的脂溶性化合物，主要是由原甲藻类和鳍藻等藻类产生[1-4]。DSP毒素包括：米氏裸甲藻毒素（Gymnodimine，GYM）、螺环内酯毒（Spirolides，SPXs）、软海棉酸毒素（Okadaic acid，OA）及其衍生物鳍藻毒素（Dinophys-istoxin，DTX毒素）、聚醚类毒素，如原多甲藻酸（Azaspir acid，AZAs），蛤毒素（Pectonotoxin，PTXs）和虾夷扇贝毒素[5-6]。贝类等虑食性动物通过滤食有毒藻类而使得DSP在体内富集，危害食用者健康。当人们误食染毒的贝类后就会造成中毒，症状主要表现为腹泻，与一些普通腹泻症状相似，所以往往被人们忽视[7-8]。DSP在全球沿岸海域均有分布，是世界范围内具有最严重威胁的赤潮藻毒素之一。由于腹泻性贝类中毒现象普遍存在，且分布较广、致毒性强，故被列为世界食品卫生学重要问题之一。
目前贝类毒素检测方法有小鼠生物测定法（MBA法）、酶联免疫吸附测定（ELASA）法、高效液相色谱-荧光法、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）等[9-14]。虽然MBA法是腹泻性贝类毒素最普遍的检测方法，但该方法需大量使用小鼠，不符合“3R”的要求[15]，而且灵敏度低、准确性和重现性差，具有易出现假阳性和无法确定毒素的成分、结构和含量等缺点；ELASA试剂盒虽灵敏度高、操作简单，但其试剂盒昂贵，也有因类似物干扰作用，出现假阳性的情况[16]，不适合日常监测使用；高效液相色谱-荧光法是国内外目前常用的贝类毒素检测方法，但是分析过程中使用的柱衍生试剂如ADAM价格昂贵[17]，背景干扰对试验结果影响大，操作繁琐，重复性差，因此其应用受到一定的限制；HPLC-MS/MS测定是近年兴起的一种检测技术，比其他方法重复性好，不会出现假阳性，是一种能够准确定性定量，并能够提供准确的分子结构信息的新型分离技术[18]。在众多的分析测试方法中，HPLC-MS/MS以其同时具备高特异性和高灵敏度的特点而被广泛应用于生物毒素研究领域。
此次研究以可食用新鲜贝类为研究对象，针对其中可能存在脂溶性贝类毒素的污染情况，开发了适用于腹泻性贝类毒素的检测方法，通过快速、高效的QuEChERS和分散固相萃取技术进行净化，建立HPLC-MS/MS法对9种腹泻性贝类毒素进行定性和定量测定，以获得快速、准确的检验数据，为不安全贝类产品及其制品的毒素检测提供依据，为监管部门提供可靠的技术支撑和参考价值，保障广大消费者的生命健康安全。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
菲律宾蛤仔、魁蚶、栉江珧、波纹巴非蛤、华贵栉孔扇贝、裂纹格特蛤、翡翠贻贝、钝缀锦蛤、方斑东方螺、蛏子等，分别于海南省海口市、文昌市、琼海市、三亚市、儋州市、东方市五个取样点进行采样；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷 均为色谱纯，德国默克公司；无水硫酸钠、无水硫酸镁、氯化钠、氢氧化钠、盐酸 均为分析纯，广州化工；甲酸 色谱纯，美国ACS公司；乙酸铵 色谱纯，美国Fisher公司。
标准物质：大田软海绵酸（Okadaic acid, OA）：8.4±0.4 μg/mL，鳍藻毒素1（Dinophys-istoxin, DTX1）：8.5±0.7 μg/mL，鳍藻毒素2（Dinophys-istoxin, DTX2）：3.83±0.25 μg/mL，扇贝毒素2（Pectonotoxin, PTX2）：4.4±0.13 μg/mL，原多甲藻酸贝类毒素1（Azaspir acid, AZA1）：1.3±0.07 μg/mL，原多甲藻酸贝类毒素2（Azaspir acid, AZA2）：1.22±0.06 μg/mL，原多甲藻酸贝类毒素3（Azaspir acid, AZA3）：1.18±0.25 μg/mL，米氏裸甲藻毒素（Gymnodimine, GYM）：2.5±0.13 μg/mL，螺环内酯毒素1（Spirolides, SPX1）：7.25±0.3 μg/mL NRC，加拿大海洋研究中心。
LC 1290-MS 6460液相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司；Multi Reax（EU）涡旋振荡器 德国海道尔夫（Heidolph）公司；MS3 D S025涡旋仪 德国IKA仪器设备有限公司；舒美KQ-50超声仪 昆山仪器；3-18K离心机 德国SIGMA公司；TTL-DCII氮吹仪 同泰公司；MSE125P-CE（感量为0.00001 g）天平 德国Sartorius公司；PL602-L天平（感量为0.01 g） 瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q IQ7000超纯水系统 美国默克密理博公司；Prime HLB固相萃取小柱（6 cc，200 mg）、MCX 混合型阳离子柱（6 cc，200 mg）、C18固相萃取柱（6 cc，200 mg） 美国Waters公司；C18粉 美国Agela公司；腹泻性贝类毒素免疫亲和柱（3 mL） 美正生物。
1.2 标准溶液配制
精确量取一定量标准物质溶液，用乙腈配制成1 μg/mL标准储备液；取1 mL储备液，用乙腈定容至10 mL，得到100 ng/mL标准使用液。称取阴性空白样品，按照前处理过程处理样品，得到空白基质。取一定量标准使用液，用空白基质配制成浓度梯度为0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的标准曲线[19-22]。
1.3 样品制备
样品用清水洗净外部泥沙，去壳取出贝肉，再将贝肉用超纯水清洗干净，沥干水分，将样品剪碎后用均质机均质备用。样品制备完成后，放置−20 ℃冷冻储存，测定前将其室温解冻。
1.4 样品处理方法
样品经80%乙腈水提取，利用QuEChERS和分散固相萃取技术进行净化，具体操作如下：称取2.00 g样品，加入10 mL 80%乙腈水溶液，再加入1 g无水硫酸镁和0.5 g氯化钠，涡旋振荡5 min，5000 r/min离心5 min，取上清液40 ℃氮吹近干，甲醇定容至1 mL，再加入125 μL氢氧化钠溶液（2.5 mol/L），于76 ℃下温育40 min后冷却至室温，再加入125 μL盐酸溶液（2.5 mol/L），所得水解液中加入0.05 g C18粉和0.1 g无水硫酸镁，涡旋振荡，5000 r/min离心5 min，过0.22 µm有机滤膜，上机检测。
1.5 分析条件
1.5.1 液相色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流动相A相为5 mmol/L乙酸铵0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱程序见表1。流速：0.3 mL/min。柱温：30 ℃。进样量：5 µL。
表 1 梯度洗脱程序Table 1. The gradient elution program时间 A(%) B(%) 0.00 95 5 5.00 15 85 11.00 15 85 11.50 95 5 13.00 95 5 1.5.2 质谱条件
离子源：AJS ESI；扫描方式：Positive/Negative；检测方式：多重反应监测（MRM）；毛细管电压：4000 V；雾化器压力：35 psi；离子源温度：300 ℃；氮气作为鞘气和碰撞气，其中鞘气为11.5 L/min，辅助气为1.65 L/min。各组分监测的MRM参数见表2。
表 2 MRM参数Table 2. MRM parameters化合物 母离子
（m/z）子离子
（m/z）去簇电压
（V）碰撞能量
（V）扫描方式 AZA-1 842.5 824.5* 200 40 Positive 806.5 200 55 Positive AZA-2 856.5 838.5* 200 40 Positive 820.5 200 55 Positive AZA-3 828.5 810.5* 200 40 Positive 792.5 200 55 Positive OA 803.46 255.1* 255 55 Negative 113.1 255 79 Negative DTX-1 817.47 255* 265 55 Negative 112.9 265 75 Negative DTX-2 803.49 255* 255 55 Negative 113 255 75 Negative PTX-2 881.5 837* 230 60 Positive 539.3 230 70 Positive GYM 508.3 490.6* 100 23 Positive 174.2 100 38 Positive SPX1 692.5 674.5* 100 23 Positive 444.5 100 34 Positive 注：*为定量离子。 1.6 方法学验证
本研究采用外标法进行定量，根据目标物所建立标准曲线，计算各目标化合物的线性范围、检出限。同时称取空白样品进行样品加标回收实验，每个样品做6个平行样，计算目标物的回收率和精密度。
1.7 数据处理
本文图谱采用安捷伦Qualitative Analysis B.07.00>绘制。数据处理采用安捷伦QQQ Quantitative Analysis软件进行标准曲线建立、实验结果计算、信噪比计算。提取液选择中的回收率的计算、不同净化方法回收率的计算均采用两个平行样品取平均值计算。精密度选择三个浓度梯度，每个浓度梯度取连续采集6针数据的峰面积进行相对标准偏差RSD值的计算。方法检出限按照检出限公式：检出限=3×对照品浓度×样品稀释体积/信噪比/取样量，计算出目标物检出限。
2. 结果与分析
2.1 质谱条件优化
根据9种DSP的分子量以及化学电离性质，分别在正、负离子扫描模式下进行母离子全扫描，筛选相应较高的离子对。对目标物浓度为1 μg/mL标准液进行一级离子扫描，扫描结果显示OA、DTX-1、DTX-2在负离子模式下响应更高，其余化合物在正离子模式下响应更优。在获得分子离子峰后，进行二级质谱扫描，选择多反应监测（MRM）扫描，对Fragmentor电压和碰撞能（Collision Energy）等质谱参数进行优化，最终得到表2的质谱参数。在该仪器条件下对浓度为50 ng/mL的9种DSP混合标准溶液进行测定，单个物质色谱图如图1~图9所示，9种DSP总离子流图如图10所示，所有物质均在9 min前完成出峰，响应值均在103以上。
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图 10 C18柱分离9种DSP混合物总离子流图（50 ng/mL）Figure 10. Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on C18 column（50 ng/mL）2.2 液相条件优化
DSP属于亲脂性海洋生物毒素，在理化性质方面呈现多样性，如其含有羧酸、磺酸、氨基和亚氨基官能团 [23-28]。DSP毒素有一定的复杂性，根据碳骨架结构将这些成分分为酸性成分、中性成分以及碱性成分[29-30]。因此，实验过程中流动相选择、样品前处理和净化洗脱都要考虑到目标物的属性。
2.2.1 色谱柱选择
本实验采用了比较常见的C18反相色谱柱。研究比较了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离效果的差异[31]。比较图10和图11发现，C18分离效果相较T3柱更好，因此选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18的液相色谱柱对其余毒素进行采集分离。实验中发现C18柱不仅对软海棉酸（OA）类毒素的分离效果好，对其他DSP也能够完全分离，没有毛峰，而且灵敏度也较高，满足实验需要。
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图 11 T3柱分离9种DSP混合物总离子流图（50 ng/mL）Figure 11. Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on T3 column（50 ng/mL）2.2.2 流动相的选择
因DSP是一种脂溶性物质，且9种目标物中存在酸性成分、中性成分和碱性成分。根据其不同的性质以及9种目标物在质谱上正、负离子不同扫描模式不同，在流动相中添加甲酸，使得H+浓度增加，增强离子化效率，在正离子扫描模式下提高响应；同时在流动相中添加弱碱性的缓冲盐溶液，增强分离度，提高负离子扫描模式下的响应。所以选择5 mmol/L乙酸铵水溶液（加0.1%甲酸）和乙腈为流动相，通过改变流动相的比例对DSP混合标准溶液进行分离实验，最终采用梯度洗脱方法将9种DSP毒素完全分开，并且灵敏度较高，峰形尖锐平滑对称，最佳的洗脱条件见表1。
2.3 前处理步骤优化
2.3.1 提取液选择
目前常用的提取剂有乙腈、甲醇、丙酮等[32-33]。本实验对比纯甲醇、80%甲醇水溶液、80%乙腈水溶液进行提取。在同一加标水平，三种提取液提取效果见表3。结果显示纯甲醇的总体回收率较差，因甲醇对脂肪具有一定的溶解性，会降低提取效果；80%乙腈水溶液比80%甲醇水溶液总体回收率略高，因乙腈比甲醇使蛋白质变性的能力更强，为降低基质影响，最后选择80%乙腈水溶液作为提取液。
表 3 不同提取液回收率比较Table 3. Comparison of recovery rates of different extracts提取液 回收率（%） AZA-1 AZA-2 AZA-3 OA DTX-1 DTX-2 PTX-2 GYM SPX1 纯甲醇 69.3 72.7 71.2 68.4 65.5 62.7 74.1 66.3 67.2 80%甲醇水 87.9 92.9 86.5 80.1 72.6 75.8 82.0 74.3 76.4 80%乙腈水 93.4 106.6 89.3 85.9 88.1 84.9 104.2 85.7 87.1 2.3.2 酯化态DSP（DTX-3）水解释放
据所查阅资料，对DSP提取方法研究大多数都未涉及到DTX-3。DTX-3是OA、DTX-1、DTX-2的酯化态形式，存在于贝类样品中[33-34]，本身对人体无害，但其在碱性条件下可以水解释放出有毒的OA、DTX-1、DTX-2，致人中毒。因此实验前处理中加入水解一步，这样更能准确定量贝类中DSP的含量。
2.3.3 净化方法的选择
贝类样品基质复杂，富含蛋白质和脂肪等，待测样品净化不足极易污染离子源，导致HPLC-MS/MS的检测易被杂质干扰，从而灵敏度下降，定量偏低，所以净化方法对结果影响很大。为了降低基质效应，应选择适当的净化方法。本实验比较了液液萃取、固相萃取（包括Prime HLB固相萃取小柱、MCX固相萃取小柱、腹泻性贝类毒素免疫亲和柱）和QuECHERS净化方法对DSP的加标回收效果如下表4所示。
表 4 不同净化方法比较Table 4. Comparison of different purification methods净化方法 回收率（%） AZA-1 AZA-2 AZA-3 OA DTX-1 DTX-2 PTX-2 GYM SPX1 液液萃取 72.9 77.4 69.8 73.5 54.5 59.2 78.5 53.7 66.1 固相萃取 Prime HLB固相萃取小柱 73.5 76.2 70.4 83.3 69.1 77.0 79.9 49.8 70.5 MCX固相萃取小柱 107.3 79.7 82.5 85.3 76.2 74.4 72.6 82.4 89.3 DSP免疫亲和柱 103.9 102.5 96.3 98.6 90.2 91.4 92.7 104.4 104.7 C18固相萃取小柱 83.6 87.9 90.2 82.3 70.2 69.3 81.5 63.4 78.8 QuECHERS 111.2 103.1 98.6 95.3 87.2 89.6 90.3 87.7 91.5 液液萃取技术试剂用量大，操作繁杂，并且实验过程中容易产生乳化现象，降低提取效率；Waters Prime HLB固相萃取小柱，无需活化，实验步骤简单易操作，并且净化脂肪、蛋白质等大分子物质能力较强，通用能力较强，但是对毒素吸附性较强，不易洗脱干净，导致大部分毒素回收率偏低至50%以下，对实验准确度影响较大；Waters MCX混合型阳离子交换柱，由于具有磺酸基基团，所以对碱性化合物具有很高的选择性和灵敏度。交换柱对于GYM、SPX、OA、PTX2、AZA-1净化效果尚佳，回收率范围为82.4%～107.3%，但对其他毒素净化效果较差，回收率范围为72.6%～79.7%，整体偏低；腹泻性贝类毒素免疫亲和柱回收率在90.2%～104.7%间，回收效果很好，但操作复杂，成本非常昂贵，不适合大批量检测。
因C18可以有效去除脂类和碳水化合物，所以采用以C18粉和无水硫酸镁的混合物对腹泻性贝类毒素进行净化的QuEChERS方法。但过量使用C18也会降低回收率。多次试验后发现，如果预先加入0.1 g无水硫酸镁，再加入0.05 g净化吸附剂C18，即可获得最高的回收率。9种毒素回收率均在87%～112%的范围为内，净化效果较好。对于基质较为复杂的样品，无需增加额外的处理，即可达到满意的净化效果，同时节省了实验的时间和成本，因此实验前处理选择QuECHERS净化方法。
2.4 方法学验证
2.4.1 方法的线性范围和检出限
为消除基质效应对分析结果的影响，将100 ng/mL标准使用液用空白基质配制成线性范围为0.5～50 ng/mL的标准曲线。以各目标化合物的浓度（ng/mL）为横坐标，响应值的峰面积为纵坐标建立标准曲线。将阴性样品中添加9种腹泻性贝类毒素混合标准使用液，使得上机检测理论浓度为0.5 ng/mL，在优化的色谱条件下进回收试验，经测定信噪比（S/N）均大于3，按照检出限公式：检出限=3×对照品浓度×样品稀释体积/信噪比/取样量，计算出目标物检出限。相应的线性方程、相关系数和检出限见表5。
表 5 标准物质线性方程、相关系数、检出限Table 5. Linear equation of reference material, decision coefficient, detection limit化合物 线性方程 相关系数 检出限
（μg/kg）AZA-1 y=137883.866743x−25234.938994 0.99911033 1 AZA-2 y=102879.550891x−20877.309295 0.99927245 2 AZA-3 y=125805.585830x−22637.529925 0.99965979 3 OA y=1251.790695x−26.700279 0.99782187 2 DTX-1 y=2409.044825x+364.609597 0.99968786 1 DTX-2 y=1531.640029x+290.300430 0.99873070 7 PTX-2 y=2731.258074x−979.308697 0.99836841 3 GYM y=159685.130489x+8024.304167 0.99606143 10 SPX1 y=16759.216394x−1213.049297 0.99893683 1 由表5可知，9种腹泻性贝类毒素标准方程的线性相关系数均在0.996～0.999之间，线性良好，可以满足实验要求。欧盟对于亲脂性海洋生物毒素AZA-1、AZA-2、AZA-3、OA、 DTX-1、DTX-2、PTX-2的限制浓度为160 μg OA当量/kg，GYM 的限制浓度为200 μg OA当量/kg，SPX1的限制浓度为100 μg OA当量/kg[33, 35-37]，本方法的检出限比欧盟管制毒素规定浓度的0.05倍还低，仍可获得大于3的信噪比，说明检测灵敏度良好。
2.4.2 方法的平均回收率和精密度
分别在空白样品中加入不同浓度的9种腹泻性贝类毒素混合标准使用液，按照优化方法条件进行处理和检测，每个目标物添加三个浓度梯度，重复测定6次，计算低、中、高三个浓度梯度的回收率和相对标准偏差，以考察方法的准确度和精密度（RSD）。
由表6数据可知，9种化合物三个浓度梯度的回收率在 87.2%~111.2%之间，相对标准偏差均小于10%，由此可以说明该方法的准确度和精密度均符合实际分析检测的要求。
表 6 回收率和精密度Table 6. Recovery rate and precision化合物 理论浓度
（ng/mL）平均回收率
（%）精密度RSD
（%）AZA-1 0.5 89.2 7.2 2 102.4 5.5 6 93.9 3.7 AZA-2 0.5 89.8 6.9 2 96.1 4.4 6 93.3 4.0 AZA-3 0.5 90.2 7.5 2 104.7 7.1 6 95.1 3.9 OA 0.5 91.4 5.6 2 90.0 3.9 6 87.2 2.8 DTX-1 0.5 108.6 8.1 2 111.2 6.4 6 101.9 3.3 DTX-2 0.5 107.3 7.4 2 105.1 6.0 6 96.5 3.9 PTX-2 0.5 106.2 8.6 2 104.7 5.1 6 96.9 4.2 GYM 0.5 88.2 8.7 2 98.3 7.9 6 92.8 5.3 SPX1 0.5 88.1 9.2 2 95.4 5.5 6 94.5 3.7 2.5 实际贝类样品测定
用本实验建立的方法检测海南省五个城市市售的菲律宾蛤仔、魁蚶、华贵栉孔扇贝等约十个品种的贝类，对检出率和超标率进行分析（表7）。我国大部分沿海海域，如广东沿海、江浙海域均有DSP的污染存在，个别海域超标率竟达77% [38-43]。此次实验发现，海南省近岸海域贝类腹泻性贝类毒素的污染概率较大，但是超标率不高。
表 7 不同海域中DSP的检出率和超标率Table 7. Detection rate and over - standard rate of DSP in different sea areas地区 样品量（份） 检出率（%） 超标率（%） 海口海域 54 13.0 1.9 文昌海域 52 17.3 0 琼海海域 54 1.9 0 三亚海域 53 5.7 0 儋州海域 54 11.1 0 东方海域 55 3.6 0 3. 结论
贝类毒素种类繁多、结构复杂、样本基质较为复杂，为尽量避免或减少假阳性结果出现，研究开发高分辨率质谱测定技术，能够快速、准确进行大批量样品检测，多种毒素同时定性定量的检测技术是非常必要的。本方法可同时检测9种DSP，OA、DTX1、DTX2、PTX2、GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3在质量浓度0.5～50 ng/mL的范围内，其线性相关系数均在0.996以上，检出限为1～10 μg/kg，远远低于欧盟立法机构所确定的限量要求，回收率为87.2%～111.2%，相对标准偏差为2.8%～9.2%。本方法的线性相关系数、检出限、回收率、精密度均能满足腹泻性贝类毒素的日常检测需要，并且一个样品从前处理到上机检测，最多只需要2 h就可以完成。结果表明，在众多方法中HPLC-MS/MS可满足多种毒素同时检测需求，操作简便快捷、特异性高、灵敏度较高、重复性好、准确性高，实验过程中损失较小，稳定性重现性均良好，而且节约成本，适合大批量检验。
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图 10 C18柱分离9种DSP混合物总离子流图（50 ng/mL）
Figure 10. Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on C18 column（50 ng/mL）
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图 11 T3柱分离9种DSP混合物总离子流图（50 ng/mL）
Figure 11. Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on T3 column（50 ng/mL）
表 1 梯度洗脱程序
Table 1 The gradient elution program
时间 A(%) B(%) 0.00 95 5 5.00 15 85 11.00 15 85 11.50 95 5 13.00 95 5 
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表 2 MRM参数
Table 2 MRM parameters
化合物 母离子
（m/z）子离子
（m/z）去簇电压
（V）碰撞能量
（V）扫描方式 AZA-1 842.5 824.5* 200 40 Positive 806.5 200 55 Positive AZA-2 856.5 838.5* 200 40 Positive 820.5 200 55 Positive AZA-3 828.5 810.5* 200 40 Positive 792.5 200 55 Positive OA 803.46 255.1* 255 55 Negative 113.1 255 79 Negative DTX-1 817.47 255* 265 55 Negative 112.9 265 75 Negative DTX-2 803.49 255* 255 55 Negative 113 255 75 Negative PTX-2 881.5 837* 230 60 Positive 539.3 230 70 Positive GYM 508.3 490.6* 100 23 Positive 174.2 100 38 Positive SPX1 692.5 674.5* 100 23 Positive 444.5 100 34 Positive 注：*为定量离子。
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表 3 不同提取液回收率比较
Table 3 Comparison of recovery rates of different extracts
提取液 回收率（%） AZA-1 AZA-2 AZA-3 OA DTX-1 DTX-2 PTX-2 GYM SPX1 纯甲醇 69.3 72.7 71.2 68.4 65.5 62.7 74.1 66.3 67.2 80%甲醇水 87.9 92.9 86.5 80.1 72.6 75.8 82.0 74.3 76.4 80%乙腈水 93.4 106.6 89.3 85.9 88.1 84.9 104.2 85.7 87.1
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表 4 不同净化方法比较
Table 4 Comparison of different purification methods
净化方法 回收率（%） AZA-1 AZA-2 AZA-3 OA DTX-1 DTX-2 PTX-2 GYM SPX1 液液萃取 72.9 77.4 69.8 73.5 54.5 59.2 78.5 53.7 66.1 固相萃取 Prime HLB固相萃取小柱 73.5 76.2 70.4 83.3 69.1 77.0 79.9 49.8 70.5 MCX固相萃取小柱 107.3 79.7 82.5 85.3 76.2 74.4 72.6 82.4 89.3 DSP免疫亲和柱 103.9 102.5 96.3 98.6 90.2 91.4 92.7 104.4 104.7 C18固相萃取小柱 83.6 87.9 90.2 82.3 70.2 69.3 81.5 63.4 78.8 QuECHERS 111.2 103.1 98.6 95.3 87.2 89.6 90.3 87.7 91.5
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表 5 标准物质线性方程、相关系数、检出限
Table 5 Linear equation of reference material, decision coefficient, detection limit
化合物 线性方程 相关系数 检出限
（μg/kg）AZA-1 y=137883.866743x−25234.938994 0.99911033 1 AZA-2 y=102879.550891x−20877.309295 0.99927245 2 AZA-3 y=125805.585830x−22637.529925 0.99965979 3 OA y=1251.790695x−26.700279 0.99782187 2 DTX-1 y=2409.044825x+364.609597 0.99968786 1 DTX-2 y=1531.640029x+290.300430 0.99873070 7 PTX-2 y=2731.258074x−979.308697 0.99836841 3 GYM y=159685.130489x+8024.304167 0.99606143 10 SPX1 y=16759.216394x−1213.049297 0.99893683 1
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表 6 回收率和精密度
Table 6 Recovery rate and precision
化合物 理论浓度
（ng/mL）平均回收率
（%）精密度RSD
（%）AZA-1 0.5 89.2 7.2 2 102.4 5.5 6 93.9 3.7 AZA-2 0.5 89.8 6.9 2 96.1 4.4 6 93.3 4.0 AZA-3 0.5 90.2 7.5 2 104.7 7.1 6 95.1 3.9 OA 0.5 91.4 5.6 2 90.0 3.9 6 87.2 2.8 DTX-1 0.5 108.6 8.1 2 111.2 6.4 6 101.9 3.3 DTX-2 0.5 107.3 7.4 2 105.1 6.0 6 96.5 3.9 PTX-2 0.5 106.2 8.6 2 104.7 5.1 6 96.9 4.2 GYM 0.5 88.2 8.7 2 98.3 7.9 6 92.8 5.3 SPX1 0.5 88.1 9.2 2 95.4 5.5 6 94.5 3.7
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表 7 不同海域中DSP的检出率和超标率
Table 7 Detection rate and over - standard rate of DSP in different sea areas
地区 样品量（份） 检出率（%） 超标率（%） 海口海域 54 13.0 1.9 文昌海域 52 17.3 0 琼海海域 54 1.9 0 三亚海域 53 5.7 0 儋州海域 54 11.1 0 东方海域 55 3.6 0
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[1] LEE J S, YANAGI T, KANNA R, Fluorometric determination of diarrhetic shellfish toxins by high performance liquid chromatography [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1987, 51: 877-881.
[2] CHEN Junhui, HAN Tongzhu, LI Xiaotong, et al. Occurrence and distribution of marine natural organic pollutants: Lipophilic marine algal toxins in the Yellow Sea and the Bohai Sea, China[J]. J Science of the Total Environment,2018:931−939.
[3] CHOONSHIK SHIN, HAERIM JANG, HYEJIN JO, et al. Development and validation of an accurate and sensitive LC-ESI-MS/MS method for the simultaneous determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish and tunicate[J]. Food Control,2017:171−178.
[4] 金薇, 姚敬元, 陈文博, 等. 利玛原甲藻中大田软海绵酸和鳍藻毒素-1提取与纯化[J]. 海洋环境科学,2020(5):791−797. [JIN Wei, YAO Jingyuan, CHEN, Wenbo, et al. Extraction and purification of hydrochloric acid and finotoxin-1 from prodinoflagellates Lima[J]. Marine Environmental Science,2020(5):791−797. doi: 10.12111/j.mes.20190149 JIN Wei, YAO Jingyuan, CHEN, Wenbo, et al. Extraction and purification of hydrochloric acid and finotoxin-1 from prodinoflagellates Lima [J]. Marine Environmental Science, 2020(5): 791-797 doi: 10.12111/j.mes.20190149
[5] 杨维东, 彭喜春, 刘洁生, 等. 腹泻性贝毒研究现状[J]. 海洋科学,2005(5):66−72. [YANG Weidong, PENG Xichun, LIU Jiesheng et al. Research status of diarrhea shellfish virus[J]. Marine Science,2005(5):66−72. doi: 10.3969/j.issn.1000-3096.2005.05.013 YANG Weidong, PENG Xichun, LIU Jiesheng et al. Research status of diarrhea shellfish virus [J]. Marine Science, 2005(5): 66-72. doi: 10.3969/j.issn.1000-3096.2005.05.013
[6] 刘仁沿. 我国贝类中赤潮毒素腹泻性贝毒免疫检测技术研究[D]. 大连: 大连海事大学, 2008 LIU Renyan. Study on immunodetection technology of red tide toxin diarrhea shellfish in China[D]. Dalian: Dalian Maritime University, 2008.
[7] JAMES KJ, LEHANE M, MORONEY C, et al. Azaspiracid shellfish poisoning: unusual toxin dynamics in shellfish and the increased risk ofacute human intoxications[J]. Food Additives and Contaminants, 2002
[8] 梁玉波, 李冬梅, 姚敬元, 等. 中国近海藻毒素及有毒微藻产毒原因种调查研究进展[J]. 海洋与湖沼,2019(3):511−524. [LIANG Yubo, LI Dongmei, YAO Jingyuan, et al. Research progress on the causative species of peralgal toxins and toxic microalgae in China[J]. Chinese Journal of Microbiology and Biotechnology,2019(3):511−524. LIANG Yubo, LI Dongmei, YAO Jingyuan, et al. Research progress on the causative species of peralgal toxins and toxic microalgae in China[J]. Chinese Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019(3): 511-524
[9] NONG SOO LEE, TOSHIHIKO YANAGI, RITSUKO KENMA, et al. fluorometric determination of diarrhetic shellfish toxins by high-performance liquid chromatography[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1987(3):877−881.
[10] BERND KROCK, URBAN TILLMANN, UWE JOHN, et al. LC-MS-MS aboard ship: tandem mass spectrometry in the search for phycotoxins and novel toxigenic plankton from the North Sea[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008(5):797−803.
[11] 刘晓玉, 徐静, 黄莲芝, 等. 腹泻性贝类毒素及检测技术研究进展[J]. 食品安全质量检测学报,2015(10):4096−4102. [LIU Xiaoyu, XU Jing, HUANG Lianzhi, et al. Research progress of diarrhea shellfish toxins and detection technology[J]. Journal of Food Safety and Quality,2015(10):4096−4102. LIU Xiaoyu, XU Jing, HUANG Lianzhi, et al. Research progress of diarrhea shellfish toxins and detection technology [J]. Journal of Food Safety and Quality, 2015(10): 4096-4102
[12] 柳俊秀, 胡乐琴, 何培民. 腹泻性贝毒素软海绵酸的昆明系小鼠生物学检测法的建立[J]. 生态毒理学报,2009(3):446−451. [LIU Junxiu, HU Leqin, HE Peimin. Establishment of a biological assay for diarrhea betoxin-soft sponge acid in Kunming mice[J]. Journal of Ecotoxicology,2009(3):446−451. LIU Junxiu, HU Leqin, HE Peimin. Establishment of a biological assay for diarrhea betoxin-soft sponge acid in Kunming mice [J]. Journal of Ecotoxicology, 2009(3): 446-451.
[13] BERND CHRISTIAN, BERND LUCKAS. Determination of marine biotoxins relevant for regulations: from the mouse bioassay to coupled LC-MS methods[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008,391:117−134. doi: 10.1007/s00216-007-1778-x
[14] GERSSEN A, MULDER P, BOER J D. Screening of lipophilic marine toxins in shellfish and algae: Development of a library using liquid chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta,2011,685:175−185.
[15] 方丽媛, 李代宗, 肖勤. 贝类毒素及其检测方法研究进展[J]. 中国渔业质量与标准,2017(1):41−49. [FANG Liyuan, LI Daizong, XIAO Qin. Research progress of shellfish toxin and its detection methods[J]. China Fishery Quality and Standards,2017(1):41−49. FANG Liyuan, LI Daizong, XIAO Qin. Research progress of shellfish toxin and its detection methods[J]. China Fishery Quality and Standards. 2017(1): 41-49
[16] 潘柳波, 黄薇, 王舟, 等. 深圳市市售贝类的腹泻性贝类毒素污染状况分析[J]. 职业与健康,2016,32(1):630−632. [PAN Liubo, HUANG Wei, WANG Zhou, et al. Analysis of diarrhoeal shellfish toxin pollution of shellfish sold in Shenzhen[J]. Occupation and Health,2016,32(1):630−632. PAN Liubo, HUANG Wei, WANG Zhou, et al. Analysis of diarrhoeal shellfish toxin pollution of shellfish sold in Shenzhen [J]. Occupation and Health, 2016, 32(1): 630-632.
[17] 李芳, 李雪梅, 李献刚, 等. 贝类毒素检测方法研究概况[J]. 食品研究与开发,2015,36(23):184−186. [LI Fang, LI Xuemei, LI Xiangang, et al. Overview of shellfish toxin detection methods[J]. Food Research and Development,2015,36(23):184−186. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.048 LI Fang, LI Xuemei, LI Xiangang, et al. Overview of shellfish toxin detection methods[J]. Food Research and Development, 2015, 36(23): 184-186. doi: 10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.048
[18] 郑仁锦, 李榕珊, 黄宏南, 等. 福建省市售水产品中河豚毒素及腹泻性贝类毒素污染状况[J]. 职业与健康,2016,32(17):2367−2370. [ZHENG Renjin, LI Rongshan, HUANG Hongnan, et al. Pollution status of tetrodotoxin and diarrhoeal shellfish toxin in aquatic products sold in Fujian Province[J]. Occupational and Health,2016,32(17):2367−2370. ZHENG Renjin, LI Rongshan, HUANG Hongnan, et al. Pollution status of tetrodotoxin and diarrhoeal shellfish toxin in aquatic products sold in Fujian Province [J]. Occupational and Health, 2016, 32 (17): 2367-2370
[19] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局. GB 5009.212-2016 食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2016 State Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China State Food and Drug Administration. GB 5009.212-2016 National Standard for Food Safety: Determination of diarrhea shellfish toxins in shellfish [S]. Beijing: China Standard Press, 2016.
[20] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局. GB 5009.213-2016 食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2016 State Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China State Food and Drug Administration. GB 5009.213-2016 National Standard for Food Safety: Determination of paralytic shellfish toxins in shellfish [S]. Beijing: China Standard Press, 2016.
[21] 浙江省质量监督局. DB33/T 743-2009 水产品中腹泻性贝类毒素残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S]. Zhejiang Provincial Bureau of Quality Supervision. DB33/T 743-2009 Determination of diarrhea shellfish toxin residues in aquatic products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [S]. [22] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 4251-2015 出口贝类中原多甲藻酸类贝类毒素的测定也想色谱-质谱/质谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2015 General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China. Determination of polydinoic acid shellfish toxins in export shellfish is similar to chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry [S]. Beijing: China Standard Press, 2015.
[23] 柳俊秀, 何培民. 赤潮藻毒素种类与化学结构研究进展[J]. 中国医药生物技术,2009,4(2):144−147. [LIU Junxiu, HE Peimin. Research progress on species and chemical structure of red tide alga toxin[J]. China Medical Biotechnology,2009,4(2):144−147. doi: 10.3969/j.issn.1673-713X.2009.02.013 LIU Junxiu, HE Peimin. Research progress on species and chemical structure of red tide alga toxin [J]. China Medical Biotechnology, 2009, 4(2): 144-147. doi: 10.3969/j.issn.1673-713X.2009.02.013
[24] SATAKE M, OFUJI K, NAOKI H, et al. Azaspiracid, a new marine toxin havingunique spiro ring assemblies, isolated from Irishmussels, Mytilus edulis[J]. Journal of the American Chemical Society,1998,120(38):.9967−9968. doi: 10.1021/ja981413r
[25] VILARI O N, NICOLAOU K C, FREDERICK M O, et al. Irreversible cytoskeletal disarrangement is independent of caspase activation during in vitro azaspiracid toxicity in human neuroblastoma cells[J]. Biochemical Pharmacology,2007,74(2):327−335. doi: 10.1016/j.bcp.2007.04.004
[26] JAMES KJ, MORONEY C, RODEN C, et al. Ubiquitous b' enign ' algae emerges as the cause of shellfish contamination responsible for the human toxic syndrome, Azaspiracid poisoning[J]. Toxicon,2003,41(2):.145−151. doi: 10.1016/S0041-0101(02)00244-1
[27] LIU Lei, WEI Ning, GOU Yuxiao, et al. Seasonal variability of Protoceratium reticulatum and yessotoxins in Japanese scallop Patinopecten yessoensis in northern Yellow Sea of China[J]. Toxicon,2017,139:31−40. doi: 10.1016/j.toxicon.2017.09.015
[28] 李兆新, 孙晓杰, 郭萌萌,等. 腹泻性贝类毒素的检测、制备与预警技术[Z]. 青岛市级科技成果, 2017. LI Zhaoxin, SUN Xiaojie, GUO Mengmeng, et al. Detection, preparation and early warning technology of diarrheal shellfish toxins[Z]. Qingdao Municipal Scientific and Technological Achievements, 2017.
[29] YANG Liu, REN Cheng YU, FAN Zhoukong, et al. Lipophilic marine toxins discovered in the Bohai Sea using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. Chemosphere,2017,180:380−388.
[30] LIU R Y, LIU L, XU Y L, et al. The production, distribution and fate of yessotoxins, taking the Northern Yellow Sea of China for example[J]. Environment and Ecology Research,2016,4(6):322−345. doi: 10.13189/eer.2016.040605
[31] 刘琳琳. 超高效液相色谱-串联质谱法检测织纹螺中多种海洋生物毒素的研究[D]. 福州: 福建医科大学, 2016 LIU Linlin. Studies on detection of multiple marine biotoxins in nassarius by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrome-try[D]. Fuzhou: Fujian Medical University, 2016.
[32] 刘琳琳, 郑仁锦, 李志军, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定织纹螺中腹泻性贝类毒素的实验研究[J]. 中国预防医学杂志,2016(6):414−418. [LIU Linlin, ZHENG Renjin, LI Zhijun, et al. Determination of diarrhoeal shellfish toxins in snails by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Preventive Medicine,2016(6):414−418. LIU Linlin, ZHENG Renjin, LI Zhijun, et al. Determination of diarrhoeal shellfish toxins in snails by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Preventive Medicine. 2016(6): 414-418.
[33] GERSSEN A, MULDER PP, MCELHINNEY MA, et al. Liquid chromatography-andem mass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkaline conditions[J]. J Chromat A,2009,1216(9):1421−1430. doi: 10.1016/j.chroma.2008.12.099
[34] 方兰云, 姚浔平, 王立, 等. 固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定双壳贝类中扇贝毒素和原多甲藻酸[J]. 中国卫生检验杂志,2014(16):2316−2320. [FANG Lanyun, YAO Xunping, WANG Li, et al. Determination of scallop toxin and propolydinoic acid in bivalve shellfish by solid phase extraction/high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Science,2014(16):2316−2320. FANG Lanyun, YAO Xunping, WANG Li, et al. Determination of scallop toxin and propolydinoic acid in bivalve shellfish by solid phase extraction/high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Chinese Journal of Health Laboratory Science. 2014(16): 2316-2320.
[35] 严忠雍, 张小军, 李奇富, 等. 免疫亲和净化-液相色谱-串联质谱法测定贝类中腹泻性贝类毒素[J]. 食品科学, 28(18): 304−309 YAN Zhongyong, ZHANG Xiaojun, LI Qifu, et al. Determination of diarrhea toxin in shellfish by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Food Science, 28(18): 304−309.
[36] EU-Harmonised Standard Operating Procedure for determination of lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS[S]. Version 5. European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins (EU-RL-MB), 2015.
[37] 刘丽, 刘磊, 赵芮, 等. 酶联免疫吸附分析检测鳍藻毒素DTX1和DTX2[J]. 分析科学学报,2016(4):557−560. [LIU Li, LIU Lei, ZHAO Rui, et al. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect DTX1 and DTX2[J]. Journal of Analytical Science,2016(4):557−560. LIU Li, LIU Lei, ZHAO Rui, et al. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect DTX1 and DTX2[J]. Journal of Analytical Science. 2016(4): 557-560.
[38] 吴施卫, 张纯超, 卢楚谦, 等. 南海近岸海域腹泻性贝类毒素分析[J]. 海洋环境科学, 2005, 24(4): 48−51. WU Shiwei, ZHANG Chunchao, LU Chuqian, et al. Marine Environmental Science, 2005, 24(4): 48−51.
[39] 吴施卫, 曾淼, 卢大鹏, 等. 广东近岸海域2005年春季的腹泻性贝毒素特征分析[J]. 海洋环境科学, 2008, 27(2): 165−168. WU Shiwei, ZENG Miao, LU Dapeng, et al. Marine Environmental Science, 2008, 27(2): 165−168.
[40] 徐志斌, 吴施卫, 陈凯彪, 等. 广东省近岸海域贝类腹泻性毒素含量与胃含物的分析[J]. 海洋通报,2010,29(4):444−449. [XU Zhibin, WU Shiwei, CHEN Kaibiao, et al. Analysis of contents of diarrheal toxins and stomach contents in shellfish in coastal waters of Guangdong Province[J]. Marine Science Bulletin,2010,29(4):444−449. XU Zhibin, WU Shiwei, CHEN Kaibiao, et al. Analysis of contents of diarrheal toxins and stomach contents in shellfish in coastal waters of Guangdong Province [J]. Marine Science Bulletin, 2010, 29(4): 444-449.
[41] 戴红, 李奶姜, 陈国斌. 福建三都湾赤潮监控区的麻痹性贝毒和腹泻性贝毒研究[J]. 海洋环境科学,2005,24(1):44−47. [DAI Hong, LI Naijiang, CHEN Guobin. Study on paralytic shellfish toxicity and diarrhea shellfish toxicity in Sandu Bay red tide monitoring area[J]. Marine Environmental Science,2005,24(1):44−47. DAI Hong, LI Naijiang, CHEN Guobin. Study on paralytic shellfish toxicity and diarrhea shellfish toxicity in Sandu Bay red tide monitoring area [J]. Marine Environmental Science, 2005, 24(1): 44-47.
[42] 张树刚, 邹清, 陈雷, 等. 浙南海域腹泻性贝毒分析[J]. 海洋科学, 2011, 35(1): 44−47. ZHANG Shugang, ZOU Qing, Chen Lei, et al. Marine Science, 2011, 35(1): 44−47.
[43] WU J Y, ZHENG L, WANG J H. Contamination of shellfish from Shanghai seafood markets with paralytic shellfish poisoning and diarrhetic shellfish poisoning toxins determined by mouse bioassay and HPLC[J]. Food Additives and Contaminants,2005,22(7):647−651.
-
期刊类型引用(1)
1. 白俊露，曾军杰，何鹏飞，李佩佩. QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法同时检测水产品中11种四环素类药物. 浙江海洋大学学报(自然科学版). 2024(04): 335-345 . 
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