基于生物基质碳点构建荧光探针用于腌腊肉制品中亚硝酸盐的检测

黄杨; 高田毅; 朱宏星; 孙冲; 韩婷婷; 王道营; 徐为民

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2021110113

基于生物基质碳点构建荧光探针用于腌腊肉制品中亚硝酸盐的检测

黄杨^{1, 2,},
高田毅³,
朱宏星²,
孙冲^2, ,,
韩婷婷²,
王道营²,
徐为民^2, ,

1.
南京师范大学食品与制药工程学院，江苏南京 210023
2.
江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014
3.
苏州工业园区生物产业发展有限公司，江苏苏州 215123

基金项目: 江苏省农业科技自主创新基金项目（CX（21）3042）。

详细信息

作者简介:
黄杨（1997−），女，硕士研究生，研究方向：食品安全控制，E-mail：huangyang_17sz@163.com

通讯作者:
孙冲（1981−），女，博士，副研究员，研究方向：肉品加工与质量控制，E-mail：sunchong0106@163.com

徐为民（1969−），男，博士，研究员，研究方向：肉品加工与质量控制，E-mail：weiminxu2002@aliyun.com

中图分类号: TB383.1；O657.3
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出版历程
- 收稿日期: 2021-11-11
- 网络出版日期: 2022-05-07
- 刊出日期: 2022-07-14

A Fluorescent Probe Based on Biological Matrix Carbon Dots for the Detection of Nitrite in Cured Meat Products

1.
School of Food Science and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China
2.
Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
3.
Suzhou Industrial Park Biotech Development Co., Ltd., Suzhou 215123, China

摘要

摘要: 为建立一种快速检测食品中亚硝酸盐含量的方法，以生物基质鸡爪外皮为碳源，采用一步水热法合成绿色碳量子点（carbon quantum dots, CQDs）。通过高分辨率透射电子显微镜、紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱仪、X射线光电子能谱、荧光光谱仪对其形貌、结构及光学性质进行表征。结果表明：所制备的鸡爪外皮CQDs尺寸均匀，分散性良好，表面富含羟基、羧基、羰基等多种官能团；在365 nm紫外光照射下发射出蓝色荧光，荧光激发峰与发射峰呈现狭窄对称特征，具有良好的发光特性。在酸性溶液中，亚硝酸盐（NO₂⁻）具有很强的氧化性，能将Fe²⁺转化为Fe³⁺，Fe³⁺可与CQDs表面的含氧官能团形成配位键从而导致CQDs荧光信号被猝灭，从而可实现NO₂⁻的间接检测。基于此原理构建CQDs-Fe²⁺荧光探针，对CQDs的激发波长、缓冲液pH、反应时间进行优化。在实验优化条件下，CQDs-Fe²⁺体系荧光猝灭值与NO₂⁻浓度在1~500 μmol/L范围内呈现良好的线性关系（R²=0.9979），检出限为0.61 μmol/L，且具备良好的抗干扰能力。将该方法应用于三种不同腌腊肉制品中亚硝酸盐的测定，结果显示回收率为98.61%~100.95%，与离子色谱检测所得的结果相接近，表明制备的CQDs-Fe²⁺荧光探针可用于实际样品中NO₂⁻的检测。综上所述，基于生物基质碳点构建的荧光探针绿色安全，制备简单，可实现对腌腊肉制品中亚硝酸盐含量的检测，具有良好的实际应用前景。
- 生物基质 /
- 碳量子点（CQDs） /
- 荧光探针 /
- 亚硝酸盐（NO₂⁻） /
- 检测
Abstract: In order to establish a rapid method for detecting the content of nitrite in food, green carbon quantum dots (CQDs) originating from chicken paw skin were synthesized by the one-step hydrothermal method. The morphology, structure and optical properties of CQDs were characterized systematically by high resolution transmission electron microscopy (HRTEM), UV-Vis absorption spectroscopy (UV-Vis), Fourier transforms infrared spectroscopy (FTIR), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and fluorescence spectroscopy (FS) technologies. The prepared CQDs were distributed uniformly with a regular size, and the surface of the CQDs was rich in functional groups including hydroxyl, carboxyl, and carbonyl, et al. In addition, the CQDs emitted intense blue fluorescence under the excitation of a 365 nm UV light lamp. And the excitation spectrum and emission spectrum of CQDs were narrow and symmetrical, indicating CQDs had good luminescence properties. In the presence of Fe³⁺, the fluorescence of CQDs was quenched due to the formation of coordination bonds between Fe³⁺ and the oxygen-containing functional groups on the surface of CQDs. Based on that, a simple fluorescent probe was designed to detect indirectly nitrite (NO₂⁻) by CQDs for nitrite possesses strong oxidation in acidic solution and was capable to transform iron (II) into iron (III) ions. The parameters including the excitation wavelength of CQDs, buffer pH value and reaction time were studied. Under the optimized conditions, the fluorescence quenching intensity of CQDs-Fe²⁺ fluorescent probe increased linearly with the NO₂⁻ concentration in the range of 1~500 μmol/L (R²=0.9979) with a low detection limit of 0.61 μmol/L, and the probe had a good anti-interference ability. The method was applied to the determination of NO₂⁻ in three marinate meat and satisfactory recoveries of 98.61%~100.95% and consistent data compared with ion chromatography were obtained. The results indicated that the CQDs-Fe²⁺ fluorescent probe could be used for the detection of NO₂⁻ in real samples. In summary, the fluorescent probe constructed based on the carbon dots of the biological matrix is green and safe, simple to prepare, can detect the content of nitrite in cured meat products, indicating a good practical application prospect.
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- carbon quantum dots (CQDs) /
- fluorescent probe /
- nitrite (NO₂⁻) /
- detection

HTML全文

亚硝酸盐（NO₂⁻）是一种常见的食品添加剂，在腌肉制品、果酱、乳制品、肉脯等食品加工中具有广泛的应用^[1]。亚硝酸盐作为肉制品护色剂，可与肉品中的肌红蛋白反应生成亚硝基肌红蛋白，从而赋予肉制品良好的色泽，同时增进肉的风味，还可抑制肉毒芽孢杆菌生长^[2]。然而，长期过量摄入亚硝酸盐会对人体健康造成损害，增加患高铁血红蛋白症、胃癌、食管癌等疾病的风险^[3]。目前，对于NO₂⁻检测分析的常见方法有离子色谱法^[4]、高效液相色谱法^[5]、毛细管电泳法^[6]和分光光度法^[7]等，但这些方法存在前处理复杂、设备昂贵、检测时间长、需要专业的技术人员操作、不适用大量现场分析的问题。因此，开发绿色环保、成本低廉、操作简单且灵敏度高的新方法，对实际产业中检测亚硝酸盐具有重要意义。

近年来，纳米材料因其拥有稳定的物理化学性能、优良的尺寸效应和制备方法多样性等优点^[8]，在生物学、食品、医学和环境检测^[9-11]等诸多领域展现出良好的应用前景。碳量子点（Carbon quantum dots，CQDs）是一种尺寸小于10 nm的新型纳米材料，具有粒径小、水溶性良好、光学性质稳定和生物相容性优良等特点，因此CQDs被认为是荧光探针的潜在替代材料^[12-14]。生物基质作为一种低成本、绿色无污染、可再生的自然资源，在CQDs制备中已得到广泛研究和应用。

荧光分析法是一种新兴的检测方法。与传统的检测方法相比，荧光探针具有简单方便，成本低，特异性好，灵敏度高等特点^[15-16]。Li等^[17]基于柠檬酸/乙二胺碳纳米点开发荧光猝灭毛细管分析方法，实现了对食品和自然水中的亚硝酸盐的检测。Wang等^[18]通过沉淀法制备1-氨基芘纳米颗粒，基于纳米颗粒与亚硝酸盐的重氮化反应构建荧光探针，并将其应用水样中亚硝酸盐的分析，表现出良好的选择性和稳定性。尽管目前已报道多种荧光检测亚硝酸盐的分析方法，但大多来源于有机染料及化学原料，且合成过程较为繁琐，因此开发绿色经济、简单高效的荧光探针仍然是一个巨大的挑战。

针对这种不足，本文以肉鸡加工废弃物鸡爪外皮作为生物基质碳源，采用一步水热法制备了具有蓝色荧光特性的CQDs，从而建立了一种绿色、安全、快速检测亚硝酸盐的新技术，同时为畜禽加工废旧生物资源利用提供新的途径。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验所用鸡爪外皮　收集于江苏南京市孝陵卫农贸市场；腌肉制品（腊肠、腊肉及腊排）　购买于南京市孝陵卫苏果超市；亚硝酸钠（NaNO₂）、硝酸钠（NaNO₃）、磷酸钠（Na₃PO₄）、硫酸钠（Na₂SO₄）、碳酸氢钠（NaHCO₃）、乙酸钠（CH₃COONa）、草酸钠（Na₂C₂O₄）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）、四硼酸钠（Na₂B₄O₇）　均为分析纯，西陇化工股份有限公司；焦磷酸钠（Na₄P₂O₇）、钨酸钠（Na₂WO₄）、碳酸钠（Na₂CO₃）、氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、氯化铵（NH₄Cl）、氯化铜（CuCl₂·2H₂O）、氯化钡（BaCl₂·2H₂O）、氯化铝（AlCl₃·6H₂O）、氯化镁（MgCl₂·6H₂O）、氯化铁（FeCl₂·4H₂O）、氯化锂（LiCl）、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）、氯化锶（SrCl₂·6H₂O）、氯化钴（CoCl₂）均为分析纯　国药集团试剂有限公司；实验用水　为超纯水，电阻率18.5 MΩ·cm⁻¹。

JEM-2100F场发射透射电子显微镜　日本电子株式会社；Cary 5000紫外可见吸收光谱仪　美国Varian公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪　美国Thermo公司；ESCALAB 250Xi X射线光电子能谱仪、ICS1100离子色谱仪　美国赛默飞世尔科技公司；LS 55荧光分光光度计　珀金埃尔默股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CQDs的制备

参照Wang等^[19]的方法制备CQDs，略作修改。以鸡爪外皮为碳源，采用一步水热合成碳量子点荧光材料。具体步骤如下：鸡爪外皮经洗净烘干后，用食品粉碎机打磨成粉末。称取2.0 g鸡爪外皮粉置于200 mL的聚四氟乙烯反应釜中，加入100 mL超纯水，混匀后于200 ℃下水热反应10 h。待反应釜冷却至室温，将反应后得到的混合溶液转移至离心管，在10000 r/min下离心10 min，吸取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后置于1000 Da的透析袋内，室温透析24 h。收集透析袋内溶液冻干，将冻干后的絮状物研磨得到的CQDs粉末放置于干燥皿中保存。

1.2.2 CQDs的表征

1.2.2.1 微观结构观察

通过透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）和高分辨率透射电子显微镜（High resolution transmission electron microscopy，HR-TEM）观察CQDs形貌。将制备的CQDs粉末超声溶解，使纳米颗粒均匀分散到超纯水中，取稀释好的样品液滴至超薄碳膜网上，室温下干燥后于场发射透射电子显微镜上观察其形貌及晶格结构。

1.2.2.2 紫外可见吸收光谱分析

称取CQDs粉末100 mg，用蒸馏水溶解定容至100 mL，获得1 mg/mL 的CQDs水溶液作为样品溶液。采用紫外可见吸收光谱仪（Ultraviolet-visible absorption spectroscopy，UV-vis）对CQDs溶液进行扫描。以去离子水作为空白对照，扫描波长范围为200~700 nm，扫描速度为600 nm/min。

1.2.2.3 傅里叶变换红外光谱分析

采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析CQDs表面基团。使用KBr压片法制备样品，扫描范围为500~4000 cm⁻¹，分辨率为4.00 cm⁻¹。

1.2.2.4 X-射线光电子能谱分析

采用X-射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）确定CQDs表面元素组成、含量和化学键状态。将CQDs粉末固定到样品台上，使用单色X射线源Al Kα作为激发源，激发电压为1487 eV，以测得结合能284 eV的C 1s进行校准。

1.2.2.5 荧光光谱分析

采用荧光光谱仪（Fluorescence Spectrometer）对CQDs的荧光性质进行分析。以1 mg/mL CQDs水溶液作为样品溶液，设定激发和发射狭缝宽度均为5 nm。固定激发波长370 nm，发射波长范围380~600 nm得到CQDs的荧光发射光谱；固定发射波长450 nm，激发波长范围280~430 nm得到CQDs的荧光激发光谱。

1.2.3 CQDs荧光量子产率测定

荧光量子产量根据参比法^[20]测定。以硫酸奎宁（荧光量子产率为0.54）作为参比标准物质，测定CQDs与硫酸奎宁在同一激发波长下的荧光发射峰面积及同一波长处的吸光度。代入下式：

$\rm {Q}_{1}={Q}_{2}\left(\frac{{S}_{1}}{{S}_{2}}\right)\left(\frac{{A}_{2}}{{A}_{1}}\right){\left(\frac{{\mathrm{\eta }}_{1}}{{\mathrm{\eta }}_{2}}\right)}^{2}$

式中：下标1和2分别代表待测样品和标准物质；Q表示荧光量子产率（%）；S表示荧光发射积分面积；A为吸光度；η为溶剂的折射率（蒸馏水为1.33）。

1.2.4 CQDs-Fe²⁺荧光探针检测NO₂⁻

配制浓度为1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μmol/L的NO₂⁻溶液，取400 μL不同浓度的NO₂⁻溶液和相同体积的1 mmol/L Fe²⁺溶液加入到1 mL的1 mg/mL CQDs溶液中，加入1.5 mL PBS（0.1 mol/L，pH3.0），100 W超声30 min使其混合均匀，记录荧光发射光谱。每个浓度梯度设置5次平行实验。参数设置为：固定激发波长为370 nm，发射波长范围为380~600 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm。通过分析体系荧光猝灭值△F与NO₂⁻浓度之间的变化关系，得出线性方程和相关系数。

1.2.5 实际样品分析

参照GB 5009.33-2016对购买的腌腊肉制品进行前处理^[21]。具体步骤如下：将腌腊肉制品用食品粉粹机制成匀浆，称取试样匀浆1 g，置于100 mL离心管中，加入40 mL水，超声提取30 min，每隔5 min振摇一次。于75 ℃水浴中放置5 min后取出，冷却至室温后转移至50 mL容量瓶中定容。溶液经滤纸过滤后，于1000 r/min下离心15 min，将上清液经0.22 μm滤膜过滤后作为样品原液。每组样品制备三组平行试样，分别采用离子色谱法和CQDs-Fe²⁺荧光探针进行检测，结果取平均值。向腌腊肉制品样品原液中添加100 μmol/L的NO₂⁻，计算实际样本中NO₂⁻的加标回收率。

1.3 数据处理

每组实验重复3~5次取平均值，采用IBM SPSS Statistics 25进行单因素方差分析，结果采用 $\overline{\rm{X}}$ ±SD表示。使用Origin8.5软件（OriginLab公司）对数据进行图谱绘制。

2. 结果与分析

2.1 CQDs的表征

采用场发射透射电子显微镜对CQDs形貌进行观察，如图1所示，CQDs为球形纳米颗粒，尺寸均一，且具有良好的分散性。插图HR-TEM图像显示，CQDs的面间距为0.22 nm，这属于石墨的（100）衍射面，表明CQDs对应于sp²型石墨碳纳米晶芯^[22]。图2为紫外可见吸收光谱及荧光光谱图。由图2中可知，在263 nm处CQDs有明显紫外吸收峰，这是芳香（C-C） sp²杂化轨道典型的π→π*跃迁产生的^[23]。CQDs的荧光激发峰与发射峰呈现狭窄对称的特征，说明CQDs粒径尺寸均匀且分散性良好^[24]。插图表明合成的CQDs水溶液在自然光下呈现淡黄色或接近无色（左），在365 nm紫外灯照射下发射出强烈的蓝色荧光（右）。以硫酸奎宁作为标准物测得CQDs荧光量子产率为8.23%，说明其具有良好的荧光性能。

图 1 CQDs的透射电子显微镜图

Figure 1. TEM image of CQDs

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图 2 CQDs的紫外可见吸收光谱及荧光光谱图

注：Abs为CQDs紫外可见吸收光谱；Ex为CQDs荧光激发光谱；Em为CQDs荧光发射光谱。

Figure 2. UV-vis absorption and fluorescence spectra of the CQDs

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采用傅里叶变换红外光谱表征CQDs，结果如图3所示，3285 cm⁻¹处吸收峰归因于O-H和N-H基团的伸缩振动，2921和2868 cm⁻¹处是C-H对称伸缩振动^[25]。1627、1519、1451、1242和1087 cm⁻¹附近的峰对应着C=O、C=C、C-N-C、C-OH和C-O-C^[26-28]。这些官能团使得CQDs具有良好的水溶性，有望进一步扩展其应用领域。

图 3 CQDs的傅里叶变换红外光谱图

Figure 3. FTIR spectrum of the CQDs

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通过XPS表征CQDs的元素组成、化合状态和分子结构。图4A为CQDs的XPS全扫描谱图，图中分布284、398和531 eV三个主要峰，对应C、N和O三个元素。根据峰面积计算CQDs中C、N和O三个元素的相对含量，分别为63.82%、16.06%、20.12%。通过XPSPEAK软件进一步分析CQDs表面基团信息。图4B表示CQDs的C 1s谱图，284.3 eV处的峰归属于石墨碳^[29]，284.8 eV处的峰表示C-N/C-O键，285.8 eV处的峰对应C=N或者C=O键，287.6 eV处的峰则对应于HO-C=O键^[30]。N 1s谱图（图4C）存在398.9和399.8 eV两个峰，分别对应C-N-C键和N-H官能团中的氮原子^[31]。O 1s谱图如图4D所示，图中530.9、531.7、532.6 eV三个特征峰对应C=O、C-O-C、C-OH键^[32]。XPS分析结果证明CQDs中存在羟基、羧基和烷基等多种基团，与傅里叶变换红外光谱结果一致。

图 4 CQDs的X-射线光电子能谱

注：A：XPS全扫描谱图；B：XPS C 1s谱图；C：XPS N 1s谱图；D：XPS O 1s谱图。

Figure 4. XPS spectra of the CQDs

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2.2 CQDs-Fe²⁺探针检测NO₂⁻机理研究

本实验研究了CQDs荧光探针对Fe³⁺、Na⁺、Cu²⁺、K⁺、NH₄⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Li⁺、Ca²⁺、Sr²⁺和Co²⁺ 13种常见金属阳离子的特异选择性。根据相对荧光强度值F/F₀（F为添加1 mmol/L不同金属离子后荧光值，F₀为未添加其他离子的荧光值）评价荧光探针选择性。测试三次取平均值，由SPSS软件进行数据处理分析。由图5可知，与其他金属离子相比，添加Fe³⁺后的相对荧光强度为25.69%，而其他离子相对荧光强度在85.55%~101.66%范围间。与空白组相比，仅有Fe³⁺与其具有显著性差异（P<0.05），说明Fe³⁺对CQDs具有明显的荧光猝灭作用。

图 5 CQDs对常见金属离子的选择性

注：“*”表示金属离子组与对照组存在显著差异（P<0.05）。

Figure 5. Selectivity of CQDs toward common metal ions

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如图6所示，当仅存在NO₂⁻或Fe²⁺时，CQDs的荧光基本无变化。在NO₂⁻和Fe²⁺同时存在时，Fe²⁺因NO₂⁻的氧化作用转化为Fe³⁺，Fe³⁺与CQDs表面的羟基、羧基等形成铁-羟基或铁-羧基复合物从而导致CQDs荧光猝灭^[33]。检测机制如图7所示，CQDs与Fe²⁺混合后在370 nm激发波长下仍然发出强烈的蓝色荧光，加入NO₂⁻后，Fe²⁺转化为Fe³⁺使得CQDs荧光强度值降低，由此可构建CQDs-Fe²⁺探针实现对NO₂⁻的间接检测。

图 6 CQDs与Fe²⁺、NO₂⁻、Fe²⁺/NO₂⁻的荧光发射光谱

Figure 6. Fluorescence spectra of CQDs with Fe²⁺, NO₂⁻ and Fe²⁺/NO₂⁻

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图 7 CQDs-Fe²⁺检测NO₂⁻的机制

Figure 7. Mechanism of NO₂⁻ detection by CQDs-Fe²⁺

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2.3 CQDs-Fe²⁺探针参数优化

为了更好地优化CQDs-Fe²⁺探针对NO₂⁻的检测性能，对CQDs的激发波长、缓冲液pH、反应时间进行研究。图8A为CQDs溶液在不同激发波长下的荧光发射光谱，由图中可知，最大激发波长位于370 nm左右。随着激发波长的增加，最大发射峰荧光强度逐渐增强，当激发波长超过370 nm后，荧光强度开始下降。图8B为荧光强度归一化后的荧光发射光谱，由图中可以看出，在300~450 nm的激发波长范围内，CQDs的荧光发射光谱表现出明显的红移现象。这种现象是由CQDs的费米能级附近不同表面缺陷态的光学选择引起的^[34]。在不同的激发波长下，CQDs表面相应的发色基团将占据主导地位，产生依赖于激发波长的荧光^[35]。说明该CQDs具有激发波长的依赖性。当激发波长为370 nm CQDs荧光强度最强，最大发射波长在450 nm处。故后续实验所选激发波长为370 nm。

图 8 不同激发波长下CQDs的荧光发射光谱（A）和归一化发射光谱（B）

Figure 8. Fluorescence emission spectra (A) and emission normalized spectra of CQDs (B) in different excitation wavelengths

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图9A显示了在不同pH的缓冲液中NO₂⁻添加前后CQDs-Fe²⁺体系的荧光强度。结果表明，当缓冲液pH在1~7范围内变化时，随着pH逐渐增加，CQDs-Fe²⁺与CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻两者荧光强度逐渐增高，当pH在4~7变化时，体系荧光基本保持稳定，这是因为过酸环境会导致CQDs的表面基团发生质子化从而引起体系荧光强度减弱。通过分析NO₂⁻添加前后CQDs-Fe²⁺体系荧光猝灭程度（图9B），可以发现，当pH为2和3时，体系荧光猝灭程度最大，考虑到CQDs-Fe²⁺在pH为3时荧光强度远大于pH为2时，因此选择pH3作为体系反应的最佳缓冲条件。

图 9 pH对体系荧光强度（A）和猝灭程度（B）的影响

Figure 9. Influence of pH on the fluorescence intensity (A) and the quenching rates (B)

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图10是CQDs-Fe²⁺与NO₂⁻反应时间（0~75 min）的优化。从图中可以看出，随着反应时间的增加，体系荧光强度值逐渐降低并趋于稳定，结合时间在40 min后，荧光强度保持恒定，表明NO₂⁻和Fe²⁺之间的氧化还原反应以及产生的Fe³⁺对荧光的猝灭作用在40 min内达到动态平衡。因此在后续实验中选择40 min作为NO₂⁻加入CQDs-Fe²⁺体系的反应时间。

图 10 反应时间对CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻体系荧光强度的影响

Figure 10. Influence of reaction time on the fluorescence intensity of CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻

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2.4 CQDs-Fe²⁺探针线性检测NO₂⁻

由图11的荧光光谱图可以看出，在CQDs-Fe²⁺中加入NO₂⁻后，体系荧光强度随着NO₂⁻浓度增加逐渐降低。以NO₂⁻浓度为横坐标，450 nm处CQDs荧光猝灭值（△F=F₀–F，F₀为空白对照组荧光值，F为待测组荧光值）为纵坐标，在1~500 μmol/L范围内，两者呈现良好的线性关系，回归方程为△F=0.60c+1.01（R²=0.9979），检出限为0.61 μmol/L。与表1中已报道的NO₂⁻检测方法相比，本方法建立的荧光探针具有较宽的线性范围和较低的检测限。

图 11 不同浓度NO₂⁻的CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻荧光光谱图

Figure 11. Fluorescence spectra of CQDs-Fe²⁺ with different concentrations of NO₂⁻

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表 1 不同方法检测NO₂⁻的比较

Table 1. Comparison of methods for the NO₂⁻ detection

检测方法	线性范围（μmol/L）	检出限（μmol/L）	参考文献
比色法	1~75	0.73	[36]
表面增强拉曼散射法	10.87~369.57	4.57	[37]
离子色谱法	9.91~77.61	1.74	[38]
荧光法	0~10	0.1	[39]
荧光法（CQDs）	1~500	0.61	本研究

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2.5 CQDs-Fe²⁺探针抗干扰分析

为考察CQDs荧光探针在检测NO₂⁻时的抗干扰性，在相同实验条件下，选择500 μmol/L的NO₂⁻、HPO₄²⁻、H₂PO₄⁻、PO₄³⁻、HCO₃⁻、C₂O₄²⁻、CH₃COO⁻、CO₃²⁻、SO₄²⁻、S₂O₃²⁻、NO₃⁻、WO₄²⁻、P₂O₇⁴⁻等阴离子对CQDs-Fe²⁺荧光探针的抗干扰性能进行测试。如图12所示，与空白组相比，NO₂⁻对CQDs-Fe²⁺体系的荧光猝灭效果明显，而其他相同浓度的阴离子则对CQDs的荧光猝灭效应较小，证明其他阴离子在该荧光探针用于检测NO₂⁻时的影响很小，即CQDs-Fe²⁺荧光探针在检测NO₂⁻时具有良好的抗干扰能力。

图 12 CQDs-Fe²⁺检测NO₂⁻的抗干扰性

Figure 12. Anti-interference of CQDs-Fe²⁺ in detection of NO₂⁻

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2.6 实际样品检测

为评估所制备的 CQDs-Fe²⁺荧光探针用于 NO₂⁻检测的实际应用价值，以市售三种腌腊肉制品，腊肠、腊肉、腊排为样品，对其中 NO₂⁻含量进行加标回收试验。测定结果如表 2所示。该荧光探针测得样品中 NO₂⁻的回收率为 98.61%~100.95%，RSD 均小于 5%，且与离子色谱得到的结果基本一致，表明本研究所制备的 CQDs 荧光探针可用于实际样品中NO₂⁻的检测。

表 2 实际样品中NO₂⁻的测定结果

Table 2. Detection of NO₂⁻in actual samples

样品	添加值（μmol/L）	CQDs-Fe²⁺探针			离子色谱
样品	添加值（μmol/L）	初始值（μmol/L）	检出值（μmol/L）	回收率（%）	初始值（μmol/L）	检出值（μmol/L）	回收率（%）
腊肠	100	0	98.61±2.78	98.61	ND	98.63±0.05	98.63
腊肉	100	0	98.98±1.34	98.98	ND	99.66±0.21	99.66
腊排	100	0.81±0.02	101.76±1.19	100.95	ND	101.08±0.29	101.09

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3. 结论

本文以生物基质鸡爪外皮为碳源，采用一步水热法合成具有良好荧光特性的CQDs。基于Fe³⁺对CQDs的荧光猝灭能力和NO₂⁻可将Fe²⁺转化为Fe³⁺的氧化能力，进而构建了CQDs-Fe²⁺荧光探针用于NO₂⁻的检测。在1~500 μmol/L范围内，NO₂⁻浓度与探针荧光猝灭值呈现良好的线性关系，检测限为0.61 μmol/L。将其应用于腌腊肉制品中亚硝酸盐的检测，结果表明，与离子色谱法相比，本方法具有更低的检测限，适用于实际样品中亚硝酸盐的微量分析。

综上，本方法构建的荧光探针在实现禽肉加工废弃物再利用的同时，开发了一种绿色安全、快速、高效检测亚硝酸盐的技术，具有良好的检测性能与实际应用价值。此外，由于基于荧光物质建立的预测模型会因模型选择、人员操作及计量方法的不同存在精度上的差异，因此寻求精度高、稳定性好、适用范围广的亚硝酸盐检测方法有待更深一步的研究。

图 1 CQDs的透射电子显微镜图

Figure 1. TEM image of CQDs

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图 2 CQDs的紫外可见吸收光谱及荧光光谱图

注：Abs为CQDs紫外可见吸收光谱；Ex为CQDs荧光激发光谱；Em为CQDs荧光发射光谱。

Figure 2. UV-vis absorption and fluorescence spectra of the CQDs

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图 3 CQDs的傅里叶变换红外光谱图

Figure 3. FTIR spectrum of the CQDs

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图 4 CQDs的X-射线光电子能谱

注：A：XPS全扫描谱图；B：XPS C 1s谱图；C：XPS N 1s谱图；D：XPS O 1s谱图。

Figure 4. XPS spectra of the CQDs

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图 5 CQDs对常见金属离子的选择性

注：“*”表示金属离子组与对照组存在显著差异（P<0.05）。

Figure 5. Selectivity of CQDs toward common metal ions

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图 6 CQDs与Fe²⁺、NO₂⁻、Fe²⁺/NO₂⁻的荧光发射光谱

Figure 6. Fluorescence spectra of CQDs with Fe²⁺, NO₂⁻ and Fe²⁺/NO₂⁻

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图 7 CQDs-Fe²⁺检测NO₂⁻的机制

Figure 7. Mechanism of NO₂⁻ detection by CQDs-Fe²⁺

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图 8 不同激发波长下CQDs的荧光发射光谱（A）和归一化发射光谱（B）

Figure 8. Fluorescence emission spectra (A) and emission normalized spectra of CQDs (B) in different excitation wavelengths

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图 9 pH对体系荧光强度（A）和猝灭程度（B）的影响

Figure 9. Influence of pH on the fluorescence intensity (A) and the quenching rates (B)

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图 10 反应时间对CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻体系荧光强度的影响

Figure 10. Influence of reaction time on the fluorescence intensity of CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻

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图 11 不同浓度NO₂⁻的CQDs-Fe²⁺/NO₂⁻荧光光谱图

Figure 11. Fluorescence spectra of CQDs-Fe²⁺ with different concentrations of NO₂⁻

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图 12 CQDs-Fe²⁺检测NO₂⁻的抗干扰性

Figure 12. Anti-interference of CQDs-Fe²⁺ in detection of NO₂⁻

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表 1 不同方法检测NO₂⁻的比较

Table 1 Comparison of methods for the NO₂⁻ detection

检测方法	线性范围（μmol/L）	检出限（μmol/L）	参考文献
比色法	1~75	0.73	[36]
表面增强拉曼散射法	10.87~369.57	4.57	[37]
离子色谱法	9.91~77.61	1.74	[38]
荧光法	0~10	0.1	[39]
荧光法（CQDs）	1~500	0.61	本研究

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表 2 实际样品中NO₂⁻的测定结果

Table 2 Detection of NO₂⁻in actual samples

样品	添加值（μmol/L）	CQDs-Fe²⁺探针			离子色谱
样品	添加值（μmol/L）	初始值（μmol/L）	检出值（μmol/L）	回收率（%）	初始值（μmol/L）	检出值（μmol/L）	回收率（%）
腊肠	100	0	98.61±2.78	98.61	ND	98.63±0.05	98.63
腊肉	100	0	98.98±1.34	98.98	ND	99.66±0.21	99.66
腊排	100	0.81±0.02	101.76±1.19	100.95	ND	101.08±0.29	101.09

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施引文献(1)

期刊类型引用(1)

史文锦，刘仁慧. 山药在糖尿病及其并发症治疗中的作用机制研究进展. 山东医药. 2025(01): 144-149 .

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 CQDs的制备
1.2.2 CQDs的表征
1.2.2.1 微观结构观察
1.2.2.2 紫外可见吸收光谱分析
1.2.2.3 傅里叶变换红外光谱分析
1.2.2.4 X-射线光电子能谱分析
1.2.2.5 荧光光谱分析
1.2.3 CQDs荧光量子产率测定
1.2.4 CQDs-Fe2+荧光探针检测NO2−
1.2.5 实际样品分析
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 CQDs的表征
2.2 CQDs-Fe2+探针检测NO2−机理研究
2.3 CQDs-Fe2+探针参数优化
2.4 CQDs-Fe2+探针线性检测NO2−
2.5 CQDs-Fe2+探针抗干扰分析
2.6 实际样品检测
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 CQDs的制备
1.2.2 CQDs的表征
1.2.2.1 微观结构观察
1.2.2.2 紫外可见吸收光谱分析
1.2.2.3 傅里叶变换红外光谱分析
1.2.2.4 X-射线光电子能谱分析
1.2.2.5 荧光光谱分析
1.2.3 CQDs荧光量子产率测定
1.2.4 CQDs-Fe²⁺荧光探针检测NO₂⁻
1.2.5 实际样品分析
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 CQDs的表征
2.2 CQDs-Fe²⁺探针检测NO₂⁻机理研究
2.3 CQDs-Fe²⁺探针参数优化
2.4 CQDs-Fe²⁺探针线性检测NO₂⁻
2.5 CQDs-Fe²⁺探针抗干扰分析
2.6 实际样品检测
3. 结论

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基于生物基质碳点构建荧光探针用于腌腊肉制品中亚硝酸盐的检测

作者简介: 黄杨（1997−），女，硕士研究生，研究方向：食品安全控制，E-mail：huangyang_17sz@163.com

通讯作者: 孙冲（1981−），女，博士，副研究员，研究方向：肉品加工与质量控制，E-mail：sunchong0106@163.com 徐为民（1969−），男，博士，研究员，研究方向：肉品加工与质量控制，E-mail：weiminxu2002@aliyun.com

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