Screening and Verification of Key Genes for Isomaltulose Reducing Liver Fat Accumulation in Mice
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摘要: 为筛选和验证异麦芽酮糖减少小鼠肝脏脂肪堆积的关键基因，本研究利用Limma软件包对异麦芽酮糖和蔗糖饲喂22周的雄性小鼠肝脏转录组数据进行差异表达分析（GSE54723，n=14），共筛选出49个DEGs，通过Metascape软件对DEGs进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析，使用Cytoscape软件和WGCNA软件包构建基因共表达网络，取重叠基因搜寻关键节点基因，挖掘得到10个关键节点基因Pnliprp1、Prss2、Clps、Tff2、Pnlip、Ctrl、Cpa1、Cel、Dmbt1、Vil1，基因功能分析表明Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps与脂质代谢相关。qPCR结果显示，异麦芽酮糖组肝脏组织中这4个与脂质代谢相关基因的表达量显著高于蔗糖组，通过比较正常人和非酒精性脂肪肝患者肝脏组织转录组数据中上述基因的表达量（GSE163211，n=318），发现正常人Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps基因表达量亦显著（P<0.05） 高于病例组。本研究揭示了异麦芽酮糖通过上调Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps的合成促进脂肪分解从而降低肝脏脂质的积累，为异麦芽酮糖影响肝脏脂质代谢的分子机制研究提供了理论支撑。Abstract: In order to screen and verify the key genes that isomaltulose reduces liver fat accumulation in mice, in this study, the Limma package was used to analyze the liver transcriptome data of male mice fed with isomaltose and sucrose for 22 weeks (GSE54723, n=14). A total of 49 DEGs were screened out, and then were analyzed by Metascape software for GO functional enrichment analysis and KEGG signaling pathways analysis. Cytoscape and WGCNA software were used to construct gene co-expression network, overlapping genes were picked up for searching for key node genes, and 10 key node genes Pnliprp1, Prss2, Clps, Tff2, Pnlip, Ctrl, Cpa1, Cel, Dmbt1, Vil1 were screened out, gene functional analysis showed Pnlip, Pnliprp1, Cel, Clps were related to lipid metabolism. The qPCR results showed that the expression of these four genes related to lipid metabolism in liver tissue of isomaltulose group was significantly (P<0.05) higher than that of sucrose group, by comparing the expression of the above genes in the liver transcriptome data of normal people and NAFLD patients (GSE163211, n=318), Pnlip, Pnliprp1, Cel and Clps were also expressed significantly higher in normal people than in NAFLD patients. This study revealed that isomaltulose promoted lipolysis by up regulating the synthesis of Pnlip, Pnliprp1, Cel and Clps, so as to reduce the accumulation of liver lipids, which would provide a theoretical support for the study of the molecular mechanism of isomaltulose affecting liver lipid metabolism.
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Keywords:
- isomaltulose /
- sucrose /
- transcriptome data /
- node genes /
- lipid metabolism
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蔗糖的过量摄取与高血糖、高血脂、非酒精性脂肪肝（Non-alcohol Fatty Liver Disease，NAFLD）等慢性疾病的发生发展密切相关[1]。持续的高蔗糖饮食会促进脂肪生成，引发脂肪沉积于肝脏，导致肝脏白细胞浸润和促炎细胞因子溢出，显著增加了非酒精性脂肪肝病的发病风险[2]。非酒精性脂肪肝病又使得机体对葡萄糖的代谢能力下降、肝糖原合成减少，从而引发高血糖和高胰岛素血症，胰岛素敏感性降低，加速以胰岛素抵抗为特征的II型糖尿病的发展，促使脂肪酸的从头合成和甘油三酯合成，导致血脂水平升高[3-4]。随着现代社会糖尿病和高血脂患者的不断增加，人们不断探索新型的甜味剂，以期在满足日常需要的同时还可降低因过量摄入引发的健康风险。
异麦芽酮糖（Isomaltulose）又称帕拉金糖，是由D-果糖和D-葡萄糖通过α-1,6糖苷键连接的天然二糖，其味道和外观均与蔗糖类似，在工业上于1954年首次以蔗糖为原料实现转化。目前，我国列入食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB 2760-2014）的食糖替代品有异麦芽酮糖、麦芽糖醇、山梨醇、木糖醇等。其中只有异麦芽酮糖的最大使用量不受限制，其它糖醇超过一定摄入量会出现不同程度的助泻现象[5]。Keyhani-Nejad等[6]报道，与蔗糖相比，异麦芽酮糖能够维持葡萄糖稳态，降低餐后葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰岛素的释放，有助于预防非酒精性脂肪肝。Hwang等[7]研究发现异麦芽酮糖具有比蔗糖更慢的消化速率，可以减少肝脏中脂肪堆积和提高葡萄糖耐量，摄入异麦芽酮糖的的小鼠肝脏切片与正常小鼠无异。Jang等[8]在14名志愿者的临床研究中发现，异麦芽酮糖组餐后1 h的血糖水平明显低于蔗糖组，这一研究表明异麦芽酮糖缓慢水解的特性可使血糖保持平稳，不会引起胰岛素水平显著升高，能有效地改善胰岛素敏感性。Lee等[9]使用蔗糖-异麦芽酮糖混合物（palatinose-sucrose mixtures）饲喂小鼠，结果显示相比于饲喂含有30%异麦芽酮糖的混合物组的小鼠，饲喂含有50%异麦芽酮糖的混合物组小鼠血糖水平较低，HMGCR、CYP7A1和PPARγ基因表达量更低。
目前关于异麦芽酮糖的研究主要集中在其对血糖的影响上，而对它如何参与脂质代谢的分子机制研究尚不深入。本研究比较异麦芽酮糖和蔗糖影响肝脏组织基因转录的差异，筛选和验证其减少肝脏脂肪堆积的关键基因，为进一步研究异麦芽酮糖影响肝脏脂质代谢的分子机制提供理论支撑。此外，中国广西是蔗糖的主产区，目前已具备将蔗糖转化为异麦芽酮糖的成熟工艺，本研究积极探索异麦芽酮糖的作用机制，对异麦芽酮糖的推广和生产实践也具有一定的积极意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级10周龄雄性昆明小鼠（25~30 g） 21只，北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证号：SCXK（京）2021-0006）；小鼠日粮（含40.5%碳水化合物，41.5%脂肪和18%蛋白质） 北京科澳协力饲料有限公司；异麦芽酮糖（Cas号：13718-94-0，BR级）、蔗糖（Cas号：57-50-1，BR级） 上海麦克林生化科技有限公司；乙醇、二甲苯 西陇化工股份有限公司；GeneJET RNA Purification Kit RNA提取试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix Thermo Fisher；逆转录试剂PrimeScript RT Master Mix Takara公司；引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司。
RM2235轮转切片机 德国徕卡生物系统公司； ABI7900实时荧光定量PCR仪 美国应用生物系统公司。
1.2 实验方法
1.2.1 异麦芽酮糖与蔗糖饲喂实验
21只雄性昆明小鼠随机分为三个组：空白组、蔗糖组、异麦芽酮糖组，每组7只，每笼3只。为比较小鼠在相对自然的状态下摄入异麦芽酮糖和蔗糖对其肝脏脂质代谢的影响，避免短期大剂量饲喂对小鼠应激和免疫方面的影响[10]。本实验采用长期间隔的饲喂方式，具体方法如下：500 mg蔗糖/异麦芽酮糖溶解于小鼠饮用水，配制成1%水剂，给与小鼠自由饮用，防止频繁的抓取进行灌胃可能划伤小鼠食道或气管，影响小鼠的正常生长。每隔4 d饲喂一次，饲喂前一晚禁食不禁水。除此外日粮为普通标准日粮，动物正常摄食和饮水，连续饲喂22周，模拟人类长期少量的饮食摄入方式。实验期间每天观察小鼠的一般状况，通过计量每次饲喂前后水瓶中的水量记录小鼠的饮用量、称量实验前后小鼠的体重计算小鼠的平均日增重，饲喂结束后采用颈椎脱臼法处死小鼠。饲养环境温度18～25 ℃，相对湿度30%～60%。
1.2.2 肝脏组织切片和脂质代谢相关基因的实验验证
取处死后小鼠的肝脏组织经福尔马林固定，酒精脱水，二甲苯透明后，进行石蜡包埋切片（30 μm），经脱蜡后进行苏木精—伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，使用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对细胞形态和数目进行观察和计算。取小块小鼠肝脏提取RNA，取1 μg总RNA逆转录后利用Premier Bank设计引物（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）。经预实验验证了引物（表1）的有效性和特异性后，以β-actin为内参，反应体系为cDNA 1 μL、前引物0.5 μL、后引物0.5 μL、2× Green qPCR mix 5 μL、DEPC ddH2O 3 μL；反应程序为94 ℃预变性2 min、94 ℃变性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40 个循环，使用标准曲线法进行实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），以β-actin表达量对各基因进行标准校正。
表 1 本研究中所用的引物列表Table 1. List of primers used in this study序号 引物名称 引物序列 扩增基因名称 扩增片段（bp） 退火温度（℃） 1 Pnlip-F CTGGGAGCAGTAGCTGGAAG Pnlip 133 61 Pnlip-R AGCGGGTGTTGATCTGTGC 2 Pnliprp1-F GGAAGACTCGGTTCATCATCCA Pnliprp 174 61 Pnliprp1-R CACCCACTACTCGCACATTGT 3 Clps-F GAACAGTATGCAGTGTAAGAGCA Clps 208 61 Clps-R GCAGATGCCATAGTTGGTGTTG 4 Cel-F CGCCTGGAGGTTCTATTTCTTG Cel 95 61 Cel-R TCCACGAAACCGCCTTCTG 5 Actb-F GGCTGTATTCCCCTCCATCG β-actin 154 61 Actb-R CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 1.3 数据处理
1.3.1 肝脏转录组数据的获取
从GEO（Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库[11]中筛选出饲喂异麦芽酮糖和蔗糖的小鼠肝脏组织转录组数据GSE54723（n=14，其中异麦芽酮糖饲喂7例，蔗糖饲喂7例）。人类非酒精性脂肪肝转录组数据来自GEO数据库GSE163211（n=318，其中正常人肝脏组织9例，NAFLD病人309例），使用Graphpad软件中的ROUT函数（Q=1%）去除离群值后用于后续正常肝脏组织与NAFLD之间的差异表达基因筛选[12]。
1.3.2 差异表达基因的筛选和基因通路分析
采用Limma软件包筛选基因芯片中饲喂异麦芽酮糖和蔗糖的小鼠肝脏组织以及正常人肝脏组织与NAFLD病人之间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），筛选条件为P<0.05，差异倍数|log2FC|≥1[13]。将筛选出的log2FC≥1的基因定为上调基因，log2FC≤−1的基因定为下调基因。利用GeneCards（https://www.genecards.org）和Rat Genome Database（https://rgd.mcw.edu/rgdweb/homepage/）进行基因功能查询，Metascape（http://metascape.org/）进行差异表达基因通路富集分析[14]，利用imageGP网站绘制差异基因火山图和基因通路图（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/）。
1.3.3 基因网络构建和关键节点基因的筛选
使用String网站（https://string-db.org/）分析DEGs之间蛋白质的相互作用关系[15]，设定筛选条件为combined score>0.4构建蛋白互作网络（protein protein interaction network，PPI）。将String所得的PPI导入到Cytoscape3.6.1（http://www.cytoscape.org/）中，Centiscape是Cytoscape中一个可以一次计算多个中心值的插件，它基于拓扑和生物学属性可搜寻最为显著差异的基因。其中参数“度”（Degree）可评估网络节点基因的调控性，用于衡量某蛋白与其它蛋白的相关性。Degree值最大的基因即为核心基因，位于PPI网络图的中心位置[16]。本研究利用Centiscape插件计算网络图各节点的Degree值，得到关键节点基因，并从Cytoscape软件中导出节点基因互作图。使用R软件包“WGCNA”将基因表达量作为矩阵进行加权基因共表达网络分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA），计算关键模块。该方法是一种多样本基因表达模式的分析方法，可进行具有生物学意义的聚类分析，筛选tom值排名前20的模块[17]，处于调控网络中心的基因为核心基因，通常是具有关键作用的调控因子，并通过R语言软件（www.r-project.org/）导出核心基因。本研究采用两种计算方法，取重叠的基因作为高可信度的节点基因，避免了单一算法出现偏好的情况。
1.3.4 显著性检验
采用Student's t-test对数据进行显著性检验，P>0.05为不显著；P<0.05为显著，用*表示；P<0.01为极显著，用**表示。
2. 结果与分析
2.1 异麦芽酮糖组与蔗糖组小鼠肝脏组织差异基因表达分析
从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中下载饲喂异麦芽酮糖（n=7）和蔗糖（n=7）的小鼠肝脏组织转录组数据GSE54723，使用Limma软件包以P<0.05且差异倍数|log2FC|≥1为筛选条件，共筛选出49个DEGs，其中包含上调基因35个，下调基因14个（图1A和图1C），差异基因的详细功能和P值见表2。
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图 1 异麦芽酮糖与蔗糖处理组的差异基因表达火山图（A）、通路富集图（B）和柱状图（C）注：A：红色圆点代表上调基因，绿色三角形代表下调基因；B：绿色圆点代表基因富集的生物学过程；C：粉红色柱状图代表上调基因和差异倍数，绿色斜线柱状图代表下调基因和差异倍数。Figure 1. Volcano plot (A), pathway enrichment plot (B) and histogram (C) of differentially expressed genes between isomaltulose and sucrose treatment groups表 2 异麦芽酮糖和蔗糖饲喂组间小鼠肝脏组织差异表达的基因及其功能Table 2. Differentially expressed genes and their functions in liver tissue of mice fed with isomaltulose and sucrose基因英文简称 基因英文全称 基因中文名 基因功能 P值 Reg1 Regenerating Family Member 1α 再生家族成员1α 与胰岛细胞的再生和糖尿病的发生有关 1.24×10−6 Zg16 Zymogen Granule Protein 16 酶原颗粒蛋白16 运输蛋白质 2.05×10−6 Prap1 Proline Rich Acidic Protein 1 富含脯氨酸的酸性
蛋白质1脂质结合蛋白，通过促进MTTP介导的脂质转移
（主要是甘油三酯和磷脂）和MTTP介导的apoB
脂蛋白的组装和分泌来促进脂质吸收2.63×10−6 Pnliprp1 Pancreatic Lipase Related Protein 1 胰脂肪酶相关蛋白1 参与甘油三酯的消化，脂蛋白代谢和新陈代谢 8.62×10−6 Ela2 Elastase 弹性蛋白酶 激活丝氨酸型内肽酶活性，作用于多个过程的上游或内部，包括对抗原刺激的急性炎症反应以及对脂多糖的反应 1.25×10−5 Pnlip Pancreatic Lipase 胰三酰甘油脂肪酶 在脂肪代谢中起重要作用 4.48×10−5 Clps Colipase 脂肪酶 胰腺脂肪酶的一个辅助因子，使脂肪酶能够将自己锚定在脂质-水界面上，发挥消化脂质功能 6.40×10−5 Ly64 Lymphocyte Antigen 64 淋巴细胞抗原64 催化蛋白质同源二聚化活性，参与胃肠上皮的维持 1.74×10−4 Tff2 Trefoil Factor 2 三叶因子2 抑制胃肠道蠕动和胃酸分泌 2.30×10−4 Rnase1 Ribonuclease A Family Member 1 核糖核酸酶A
家族成员1催化裂解嘧啶核苷酸3'侧的RNA的内切酶 2.90×10−4 Sis Simian Sarcoma 猿猴肉瘤 与血小板衍生生长因子B亚单位同源，在胚胎发育、细胞增殖、细胞迁移、存活和趋化性的调节中起重要作用 4.01×10−4 Vil1 Villin 1 绒毛蛋白1 肌动蛋白修饰蛋白，调节微绒毛肌动蛋白丝的重组 4.20×10−4 Socs2 Suppressor of Cytokine Signaling 2 细胞因子信号转导抑制因子2 调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分 5.73×10−4 Cpa1 Carboxypeptidase A1 羧肽酶A1 催化C端氨基酸释放，催化白三烯C4通过
酰胺键的水解转化为白三烯F45.74×10−4 Try10 Trypsin 10 胰蛋白酶10 预测能够激活丝氨酸型内肽酶活性，参与蛋白质水解 7.94×10−4 Try4 Trypsin 4 胰蛋白酶4 能够激活钙离子结合活性和丝氨酸型内肽酶
活性，参与蛋白质水解1.36×10−3 Sycn Syncollin 微管成束蛋白 在胰岛细胞的外分泌中起作用，调节酶原颗粒的相互融合 1.51×10−3 Ctrl Chymotrypsin Like 胰凝乳蛋白酶样
蛋白酶属于肽酶S1家族，在胰腺中特异性表达，
作为一种消化酶发挥作用1.84×10−3 Guca2b Guanylate Cyclase Activator 2B 鸟苷酸环化酶
激活剂2B肠道鸟苷酸环化酶的内源性激活剂 1.90×10−3 Phgr1 Proline, Histidine and Glycine Rich 1 富含脯氨酸、组氨酸和甘氨酸1 富含脯氨酸、组氨酸和甘氨酸 2.01×10−3 Prss2 Serine Protease 2 丝氨酸蛋白酶2 属于丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族，编码阴离子胰蛋白酶原 2.48×10−3 Ckmt1 Creatine Kinase, Mitochondrial 1A 肌酸激酶，线粒体1A 可逆地催化磷酸在ATP和各种磷酸原
（如磷酸肌酸）之间的转移2.82×10−3 Dmbt1 Deleted In Malignant Brain Tumors 1 恶性脑瘤缺失基因1 在粘膜防御系统和细胞免疫防御中发挥作用 3.62×10−3 Ela3b Chymotrypsin Like Elastase 3B 胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶3 具有丙氨酸特异性的高效蛋白酶，但仅有
很弱的弹性蛋白分解活性3.68×10−3 Try10l Try10-like trypsinogen Try10样胰蛋白酶原 胰蛋白酶原 4.14×10−3 Ms4a10 Membrane Spanning 4-Domains A10 跨膜4结构域A10 可能作为多聚体受体复合物的一个组成部分参与信号转导 4.28×10−3 Cel Carboxyl Ester Lipase 胆盐活化脂肪酶 促进脂肪和维生素的消化吸收 4.41×10−3 Eg436523 Eg436523 胰蛋白酶原12 能够激活丝氨酸型内肽酶活性，参与蛋白质水解，与人类PRSS3同源 4.81×10−3 Ai747448 Ai747448 钙激活氯通道 能够激活细胞内钙激活的氯离子通道活性，是质膜不可分割的组成部分，与人类CLCA4同源 5.58×10−3 Tyr5 Tyrosinase 5 酪氨酸酶5 催化酪氨酸氧化为多巴醌，参与色素形成 6.12×10−3 Cpb1 Carboxypeptidase B1 羧肽酶B1 参与肽类激素代谢和蛋白质代谢 6.79×10−3 Clra C-type lectin domain family 2,
member eC型凝集素结构域家族2，成员e 能激活自然杀伤细胞凝集素样受体结合活性，与人类CLEC2D（C型凝集素结构域家族2成员D）同源 7.02×10−3 Vdr Vitamin D Receptor 维生素D受体 脂质代谢中的核受体，维生素D3的活性形式 7.27×10−3 Gal3st2 Galactose-3-O-Sulfotransferase 2 半乳糖-3-O-磺基
转移酶2将硫酸基团转移到非还原β-半乳糖残基的
C-3位羟基上来催化磺化7.37×10−3 Tm4sf5 Transmembrane 4 L Six Family Member 5 跨膜4 L六家族成员5 在细胞增殖中起作用，其过度表达可能与
肿瘤细胞不受控制的生长有关9.14×10−3 Krtdap Keratinocyte Differentiation Associated Protein 角质细胞分化
相关蛋白角质细胞分化的可溶性调节剂,调节角质
细胞分化和维持复层上皮9.00×10−5 Myh8 Myosin Heavy Chain 8 肌球蛋白重链8 在骨骼肌收缩中起作用 2.08×10−4 Lor Loricrin Cornified Envelope Precursor Protein 洛立克林角质化包膜前体蛋白 参与角质化和发育生物学通路 7.43×10−4 Mzb1 Marginal Zone B And B1 Cell Specific Protein 边缘区B和B1细胞特异性蛋白 胰岛素抵抗的发生中起作用，作为一种
激素调节的脂肪因子/促炎细胞因子7.64×10−4 Krt113 Keratin 113 角蛋白113 属于角蛋白基因家族 9.22×10−4 Myh4 Myosin Heavy Chain 4 肌球蛋白重链4 与肌肉收缩相关 2.25×10−3 Myl3 Myosin Light Chain 3 肌球蛋白轻链3 参与导向信号、生长锥运动和cAMP依赖性
PKA的激活通路2.58×10−3 Pvalb Parvalbumin 副白蛋白 与肌肉松弛有关 3.85×10−3 Ly6d Lymphocyte Antigen 6 Family
Member D淋巴细胞抗原6家族成员D 参与翻译后修饰GPI锚定蛋白的合成和
蛋白质的代谢4.31×10−3 Rptn Repetin 重复蛋白 参与角质化细胞包膜的形成 6.05×10−3 Asprv1 Aspartic Peptidase Retroviral Like 1 天冬氨酸肽酶逆转录病毒样1 负责丝聚蛋白加工的蛋白酶，对维持
正常表皮组织至关重要7.52×10−3 Lce1c Late Cornified Envelope 1C 晚期角质化外壳1C 与角质化和发育生物学相关 8.16×10−3 Crct1 Cysteine Rich C-Terminal 1 富含半胱氨酸的C端1 表达于左肺和右肺，与人CRCT1基因同源 8.20×10−3 Lgals7 Galectin 7 半乳糖凝集素7 参与正常生长控制所必需的细胞-细胞和细胞-基质相互作用 9.55×10−3 将49个差异表达基因导入Metascape进行基因通路富集分析[14]，结果显示，这些DEGs主要富集于4条信号通路，包括胰腺分泌、蛋白质消化吸收、脂肪消化吸收、甘油酯的新陈代谢信号通路（图1B，表3）。说明同属二糖的两者在脂质代谢方面确存在差异。
表 3 差异基因富集的信号通路Table 3. Biological pathways of differential gene enrichment通路编号 富集的通路 基因 P值 mmu04972 Pancreatic secretion Pnliprp1, Cpa1, Cpb1, Ctrl, Cel, Try10, Prss2, Pnlip, Try4 1.36×10-11 mmu04974 Protein digestion and absorption Cpa1, Cpb1, Ctrl, Try10, Prss2, Try4 9.71×10-7 mmu04975 Fat digestion and absorption Pnliprp1, Clps, Cel, Pnlip 7.22×10-5 mmu00561 Glycerolipid metabolism Pnliprp1, Cel, Pnlip 7.00×10-3 2.2 差异基因网络分析和关键节点基因的筛选
为筛选异麦芽酮糖影响肝脏基因表达的关键节点基因，本研究采用Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络[16]（图2A）并利用WGCNA进行加权基因共表达网络分析[17]（图2B）共筛选到20个节点基因。进一步取两种算法中的重叠基因，最终得到10个关键节点基因：Pnliprp1，Pnlip，Prss2，Clps，Tff2，Ctrl，Cpa1，Cel，Dmbt1，Vil1。基因功能如表4所示，Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps这4个基因与脂肪消化吸收相关。
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图 2 异麦芽酮糖与蔗糖组的差异基因互作网络图注：A：使用Cytoscape软件构建的蛋白质互作网络图；B：使用WGCNA软件构建的基因互作网络图。Figure 2. Differential gene interaction network of isomaltulose and sucrose groups表 4 关键节点基因的功能分析Table 4. Functional analysis of key node genes序号 基因名称 基因全称 基因功能 1 Pnliprp1 胰脂肪酶相关蛋白1 参与甘油三酯消化 2 Pnlip 胰三酰甘油脂肪酶 在脂肪代谢中起重要作用 3 Prss2 丝氨酸蛋白酶2 属于丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族，编码阴离子胰蛋白酶原 4 Clps 脂肪酶 使脂肪酶将自身锚定在脂水界面上，发挥消化脂质功能 5 Tff2 三叶因子2 抑制胃肠蠕动和胃酸分泌 6 Ctrl 胰凝乳蛋白酶样蛋白酶 属于肽酶S1家族 7 Cpa1 羧肽酶A1 催化C端氨基酸的释放 8 Cel 胆盐活化脂肪酶 促进脂肪和维生素的消化吸收 9 Dmbt1 恶性脑瘤缺失基因1 在粘膜防御系统和细胞免疫防御中发挥作用 10 Vil1 绒毛蛋白1 肌动蛋白修饰蛋白，调节微绒毛肌动蛋白丝的重组 2.3 异麦芽酮糖减少小鼠肝脏脂肪堆积的关键基因的验证
构建关键节点基因的网络互作图，发现Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps这4个与脂质代谢相关基因之间存在相互作用，并且富集于脂肪消化这一通路，最终确定Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps为影响小鼠肝脏脂质代谢的关键基因（图3A）。为验证这一结果，本研究提取空白组、异麦芽酮糖组和蔗糖组的小鼠肝脏组织RNA，逆转录后进行qPCR，结果证实了在异麦芽酮糖组中这4个与脂肪消化相关基因的表达量均高于蔗糖组（图3B），空白组与异麦芽酮糖组之间则没有显著差异。这提示异麦芽酮糖可能通过Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps这4个基因的上调促进了脂肪的分解，从而减少脂肪堆积于肝脏。通过肝脏组织切片HE染色显示空白组（图3C）和异麦芽酮糖组（图3D）肝细胞核形态正常，细胞质均匀。蔗糖组（图3E）肝脏细胞内出现脂肪变性，可见大小不一的脂肪空泡。应用Motic Med6.0图像软件计数每200个肝细胞（5个视野下）内脂肪变性细胞数目，结果显示空白组/异麦芽酮糖组/蔗糖组中脂肪变性细胞数目占比分别为4%、11%和35%。每只小鼠每日平均饲喂量为蔗糖组4.72±3.37 mL，异麦芽酮糖组4.62±2.98 mL，空白对照组4.46±2.53 mL；三组没有显著性差异（P>0.05）。三组小鼠实验期内平均日增重分别为0.282±0.036，0.234±0.058和0.213±0.022 g，蔗糖组小鼠平均日增重显著高于异麦芽酮糖组和空白组（P<0.05），异麦芽酮糖组和空白组间平均日增重无显著差异（P>0.05），与上述肝脏切片结果相一致，表明异麦芽酮糖相比蔗糖减少了的脂肪合成。
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图 3 异麦芽酮糖减少小鼠肝脏脂肪堆积的关键基因的验证注：10个关键节点基因的互作图（A）；Pnliprp1，Pnlip，Cel，Clps基因在小鼠肝脏中的qPCR验证图（B）；*为P<0.05，**为P<0.01；空白对照组（C）、异麦芽酮糖（D）和蔗糖（E）饲喂组小鼠肝脏组织HE染色图（40×）。Figure 3. Validation of key genes of isomaltulose reducing liver fat accumulation in mice为进一步证实上述4个关键基因与肝脏脂肪堆积的关联，我们对从GEO数据库下载的318个非酒精性脂肪肝病例肝脏转录组数据进行分析，发现正常人肝脏中Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps基因的表达量均显著高于病例组，与预期高度相符（图4）。本研究表明，与摄入等量的蔗糖相比，食用异麦芽酮糖后肝脏中脂肪酶的表达量更高，有利于促进脂肪分解，减少了脂滴堆积于肝细胞。
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图 4 PNLIP、PNLIPRP1、CEL、CLPS基因在正常人和NAFLD患者肝脏组织中的基因表达量图注：*为P＜0.05；**为P＜0.01。Figure 4.PNLIP ，PNLIPRP1，CEL，CLPS gene expression in liver tissues of normal people and NAFLD patients3. 讨论与结论
NAFLD是指除外酒精和其他明确的损肝因素，引起的脂肪过度堆积于肝脏的一类慢性疾病[18]。在全球的患病率达到25%，已成为世界上常见的肝病[19]。研究发现，甜味剂的过量摄入显著提高了NAFLD的发病风险[20-21]，近年来，随着II型糖尿病、肥胖症等慢性病在全球范围内的流行，NAFLD的患病率也呈现出逐年上升的趋势[22]。
Pnlip（胰脂肪酶）是由胰腺腺泡分泌的消化膳食甘油三酯的主要酶[23]，能降解膳食中50%~70%的甘油三酯[24]，当Pnlip的表达上调后，机体对膳食脂肪的消化能力显著增加[25-26]，从而减少肝脏脂肪堆积。先天性胰脂肪酶缺陷是一种罕见的外分泌胰腺衰竭疾病，其主要表现为脂肪泻和消化不良[27]。Pnliprp1（胰脂肪酶相关蛋白1）是胰脂肪酶家族成员，有研究发现Pnliprp1与卵母细胞成熟和卵黄形成相关的脂质代谢中发挥作用[28]。当敲除小鼠体内Pnliprp1基因后，小鼠表现出成熟型肥胖，肝脏内脂肪质量增加，还会产生胰岛素抵抗，提示Pnliprp1基因可能参与脂肪代谢[29]。Cel（羧基酯脂肪酶）也称为胆汁盐依赖或刺激脂肪酶，存在于所有脊椎动物体内[30]，主要在胰腺腺泡细胞和哺乳期乳腺中表达，它是一种能在十二指肠中水解胆固醇酯、脂溶性维生素的分解酶[31]。当Cel基因活性受到抑制时，小鼠表现出脂肪吸收不良[32]，提示Cel在脂质代谢中发挥着重要的作用。Clps（辅脂肪酶）由胰脏产生，成熟的Clps是一种具有最小二级结构的高稳定性10 kDa蛋白[33]。Clps是脂肪酶催化水解膳食脂质类的关键成分，虽然自身缺乏酶活性，但是它对胰腺脂肪酶的活性起促进作用[34]。
本研究通过分析GSE54723中7个饲喂异麦芽酮糖的小鼠肝脏组织转录组数据样本和7个饲喂蔗糖的小鼠肝脏组织转录组数据样本，筛选出49个DEGs，通过计算得到Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps为潜在的减少小鼠肝脏脂肪堆积的关键基因，随后通过qPCR实验和非酒精脂肪肝病人肝脏组织基因表达数据中验证得到Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps这4个脂肪酶确实与肝脏脂肪堆积有关。这些结果表明：与蔗糖相比，食用异麦芽酮糖后，脂肪酶的表达量更高，促进脂肪分解，减少了脂滴堆积于肝细胞。
综上所述，本研究运用生物信息学的方法筛选和验证了Pnlip、Pnliprp1、Cel和Clps为异麦芽酮糖减少小鼠肝脏脂肪堆积的关键基因，为异麦芽酮糖影响肝脏脂质代谢的分子机制研究提供了理论支撑。
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图 1 异麦芽酮糖与蔗糖处理组的差异基因表达火山图（A）、通路富集图（B）和柱状图（C）
注：A：红色圆点代表上调基因，绿色三角形代表下调基因；B：绿色圆点代表基因富集的生物学过程；C：粉红色柱状图代表上调基因和差异倍数，绿色斜线柱状图代表下调基因和差异倍数。
Figure 1. Volcano plot (A), pathway enrichment plot (B) and histogram (C) of differentially expressed genes between isomaltulose and sucrose treatment groups
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图 2 异麦芽酮糖与蔗糖组的差异基因互作网络图
注：A：使用Cytoscape软件构建的蛋白质互作网络图；B：使用WGCNA软件构建的基因互作网络图。
Figure 2. Differential gene interaction network of isomaltulose and sucrose groups
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图 3 异麦芽酮糖减少小鼠肝脏脂肪堆积的关键基因的验证
注：10个关键节点基因的互作图（A）；Pnliprp1，Pnlip，Cel，Clps基因在小鼠肝脏中的qPCR验证图（B）；*为P<0.05，**为P<0.01；空白对照组（C）、异麦芽酮糖（D）和蔗糖（E）饲喂组小鼠肝脏组织HE染色图（40×）。
Figure 3. Validation of key genes of isomaltulose reducing liver fat accumulation in mice
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图 4 PNLIP、PNLIPRP1、CEL、CLPS基因在正常人和NAFLD患者肝脏组织中的基因表达量图
注：*为P＜0.05；**为P＜0.01。
Figure 4.
PNLIP ，PNLIPRP1，CEL，CLPS gene expression in liver tissues of normal people and NAFLD patients表 1 本研究中所用的引物列表
Table 1 List of primers used in this study
序号 引物名称 引物序列 扩增基因名称 扩增片段（bp） 退火温度（℃） 1 Pnlip-F CTGGGAGCAGTAGCTGGAAG Pnlip 133 61 Pnlip-R AGCGGGTGTTGATCTGTGC 2 Pnliprp1-F GGAAGACTCGGTTCATCATCCA Pnliprp 174 61 Pnliprp1-R CACCCACTACTCGCACATTGT 3 Clps-F GAACAGTATGCAGTGTAAGAGCA Clps 208 61 Clps-R GCAGATGCCATAGTTGGTGTTG 4 Cel-F CGCCTGGAGGTTCTATTTCTTG Cel 95 61 Cel-R TCCACGAAACCGCCTTCTG 5 Actb-F GGCTGTATTCCCCTCCATCG β-actin 154 61 Actb-R CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 
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表 2 异麦芽酮糖和蔗糖饲喂组间小鼠肝脏组织差异表达的基因及其功能
Table 2 Differentially expressed genes and their functions in liver tissue of mice fed with isomaltulose and sucrose
基因英文简称 基因英文全称 基因中文名 基因功能 P值 Reg1 Regenerating Family Member 1α 再生家族成员1α 与胰岛细胞的再生和糖尿病的发生有关 1.24×10−6 Zg16 Zymogen Granule Protein 16 酶原颗粒蛋白16 运输蛋白质 2.05×10−6 Prap1 Proline Rich Acidic Protein 1 富含脯氨酸的酸性
蛋白质1脂质结合蛋白，通过促进MTTP介导的脂质转移
（主要是甘油三酯和磷脂）和MTTP介导的apoB
脂蛋白的组装和分泌来促进脂质吸收2.63×10−6 Pnliprp1 Pancreatic Lipase Related Protein 1 胰脂肪酶相关蛋白1 参与甘油三酯的消化，脂蛋白代谢和新陈代谢 8.62×10−6 Ela2 Elastase 弹性蛋白酶 激活丝氨酸型内肽酶活性，作用于多个过程的上游或内部，包括对抗原刺激的急性炎症反应以及对脂多糖的反应 1.25×10−5 Pnlip Pancreatic Lipase 胰三酰甘油脂肪酶 在脂肪代谢中起重要作用 4.48×10−5 Clps Colipase 脂肪酶 胰腺脂肪酶的一个辅助因子，使脂肪酶能够将自己锚定在脂质-水界面上，发挥消化脂质功能 6.40×10−5 Ly64 Lymphocyte Antigen 64 淋巴细胞抗原64 催化蛋白质同源二聚化活性，参与胃肠上皮的维持 1.74×10−4 Tff2 Trefoil Factor 2 三叶因子2 抑制胃肠道蠕动和胃酸分泌 2.30×10−4 Rnase1 Ribonuclease A Family Member 1 核糖核酸酶A
家族成员1催化裂解嘧啶核苷酸3'侧的RNA的内切酶 2.90×10−4 Sis Simian Sarcoma 猿猴肉瘤 与血小板衍生生长因子B亚单位同源，在胚胎发育、细胞增殖、细胞迁移、存活和趋化性的调节中起重要作用 4.01×10−4 Vil1 Villin 1 绒毛蛋白1 肌动蛋白修饰蛋白，调节微绒毛肌动蛋白丝的重组 4.20×10−4 Socs2 Suppressor of Cytokine Signaling 2 细胞因子信号转导抑制因子2 调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分 5.73×10−4 Cpa1 Carboxypeptidase A1 羧肽酶A1 催化C端氨基酸释放，催化白三烯C4通过
酰胺键的水解转化为白三烯F45.74×10−4 Try10 Trypsin 10 胰蛋白酶10 预测能够激活丝氨酸型内肽酶活性，参与蛋白质水解 7.94×10−4 Try4 Trypsin 4 胰蛋白酶4 能够激活钙离子结合活性和丝氨酸型内肽酶
活性，参与蛋白质水解1.36×10−3 Sycn Syncollin 微管成束蛋白 在胰岛细胞的外分泌中起作用，调节酶原颗粒的相互融合 1.51×10−3 Ctrl Chymotrypsin Like 胰凝乳蛋白酶样
蛋白酶属于肽酶S1家族，在胰腺中特异性表达，
作为一种消化酶发挥作用1.84×10−3 Guca2b Guanylate Cyclase Activator 2B 鸟苷酸环化酶
激活剂2B肠道鸟苷酸环化酶的内源性激活剂 1.90×10−3 Phgr1 Proline, Histidine and Glycine Rich 1 富含脯氨酸、组氨酸和甘氨酸1 富含脯氨酸、组氨酸和甘氨酸 2.01×10−3 Prss2 Serine Protease 2 丝氨酸蛋白酶2 属于丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族，编码阴离子胰蛋白酶原 2.48×10−3 Ckmt1 Creatine Kinase, Mitochondrial 1A 肌酸激酶，线粒体1A 可逆地催化磷酸在ATP和各种磷酸原
（如磷酸肌酸）之间的转移2.82×10−3 Dmbt1 Deleted In Malignant Brain Tumors 1 恶性脑瘤缺失基因1 在粘膜防御系统和细胞免疫防御中发挥作用 3.62×10−3 Ela3b Chymotrypsin Like Elastase 3B 胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶3 具有丙氨酸特异性的高效蛋白酶，但仅有
很弱的弹性蛋白分解活性3.68×10−3 Try10l Try10-like trypsinogen Try10样胰蛋白酶原 胰蛋白酶原 4.14×10−3 Ms4a10 Membrane Spanning 4-Domains A10 跨膜4结构域A10 可能作为多聚体受体复合物的一个组成部分参与信号转导 4.28×10−3 Cel Carboxyl Ester Lipase 胆盐活化脂肪酶 促进脂肪和维生素的消化吸收 4.41×10−3 Eg436523 Eg436523 胰蛋白酶原12 能够激活丝氨酸型内肽酶活性，参与蛋白质水解，与人类PRSS3同源 4.81×10−3 Ai747448 Ai747448 钙激活氯通道 能够激活细胞内钙激活的氯离子通道活性，是质膜不可分割的组成部分，与人类CLCA4同源 5.58×10−3 Tyr5 Tyrosinase 5 酪氨酸酶5 催化酪氨酸氧化为多巴醌，参与色素形成 6.12×10−3 Cpb1 Carboxypeptidase B1 羧肽酶B1 参与肽类激素代谢和蛋白质代谢 6.79×10−3 Clra C-type lectin domain family 2,
member eC型凝集素结构域家族2，成员e 能激活自然杀伤细胞凝集素样受体结合活性，与人类CLEC2D（C型凝集素结构域家族2成员D）同源 7.02×10−3 Vdr Vitamin D Receptor 维生素D受体 脂质代谢中的核受体，维生素D3的活性形式 7.27×10−3 Gal3st2 Galactose-3-O-Sulfotransferase 2 半乳糖-3-O-磺基
转移酶2将硫酸基团转移到非还原β-半乳糖残基的
C-3位羟基上来催化磺化7.37×10−3 Tm4sf5 Transmembrane 4 L Six Family Member 5 跨膜4 L六家族成员5 在细胞增殖中起作用，其过度表达可能与
肿瘤细胞不受控制的生长有关9.14×10−3 Krtdap Keratinocyte Differentiation Associated Protein 角质细胞分化
相关蛋白角质细胞分化的可溶性调节剂,调节角质
细胞分化和维持复层上皮9.00×10−5 Myh8 Myosin Heavy Chain 8 肌球蛋白重链8 在骨骼肌收缩中起作用 2.08×10−4 Lor Loricrin Cornified Envelope Precursor Protein 洛立克林角质化包膜前体蛋白 参与角质化和发育生物学通路 7.43×10−4 Mzb1 Marginal Zone B And B1 Cell Specific Protein 边缘区B和B1细胞特异性蛋白 胰岛素抵抗的发生中起作用，作为一种
激素调节的脂肪因子/促炎细胞因子7.64×10−4 Krt113 Keratin 113 角蛋白113 属于角蛋白基因家族 9.22×10−4 Myh4 Myosin Heavy Chain 4 肌球蛋白重链4 与肌肉收缩相关 2.25×10−3 Myl3 Myosin Light Chain 3 肌球蛋白轻链3 参与导向信号、生长锥运动和cAMP依赖性
PKA的激活通路2.58×10−3 Pvalb Parvalbumin 副白蛋白 与肌肉松弛有关 3.85×10−3 Ly6d Lymphocyte Antigen 6 Family
Member D淋巴细胞抗原6家族成员D 参与翻译后修饰GPI锚定蛋白的合成和
蛋白质的代谢4.31×10−3 Rptn Repetin 重复蛋白 参与角质化细胞包膜的形成 6.05×10−3 Asprv1 Aspartic Peptidase Retroviral Like 1 天冬氨酸肽酶逆转录病毒样1 负责丝聚蛋白加工的蛋白酶，对维持
正常表皮组织至关重要7.52×10−3 Lce1c Late Cornified Envelope 1C 晚期角质化外壳1C 与角质化和发育生物学相关 8.16×10−3 Crct1 Cysteine Rich C-Terminal 1 富含半胱氨酸的C端1 表达于左肺和右肺，与人CRCT1基因同源 8.20×10−3 Lgals7 Galectin 7 半乳糖凝集素7 参与正常生长控制所必需的细胞-细胞和细胞-基质相互作用 9.55×10−3
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表 3 差异基因富集的信号通路
Table 3 Biological pathways of differential gene enrichment
通路编号 富集的通路 基因 P值 mmu04972 Pancreatic secretion Pnliprp1, Cpa1, Cpb1, Ctrl, Cel, Try10, Prss2, Pnlip, Try4 1.36×10-11 mmu04974 Protein digestion and absorption Cpa1, Cpb1, Ctrl, Try10, Prss2, Try4 9.71×10-7 mmu04975 Fat digestion and absorption Pnliprp1, Clps, Cel, Pnlip 7.22×10-5 mmu00561 Glycerolipid metabolism Pnliprp1, Cel, Pnlip 7.00×10-3
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表 4 关键节点基因的功能分析
Table 4 Functional analysis of key node genes
序号 基因名称 基因全称 基因功能 1 Pnliprp1 胰脂肪酶相关蛋白1 参与甘油三酯消化 2 Pnlip 胰三酰甘油脂肪酶 在脂肪代谢中起重要作用 3 Prss2 丝氨酸蛋白酶2 属于丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶家族，编码阴离子胰蛋白酶原 4 Clps 脂肪酶 使脂肪酶将自身锚定在脂水界面上，发挥消化脂质功能 5 Tff2 三叶因子2 抑制胃肠蠕动和胃酸分泌 6 Ctrl 胰凝乳蛋白酶样蛋白酶 属于肽酶S1家族 7 Cpa1 羧肽酶A1 催化C端氨基酸的释放 8 Cel 胆盐活化脂肪酶 促进脂肪和维生素的消化吸收 9 Dmbt1 恶性脑瘤缺失基因1 在粘膜防御系统和细胞免疫防御中发挥作用 10 Vil1 绒毛蛋白1 肌动蛋白修饰蛋白，调节微绒毛肌动蛋白丝的重组
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