Study on Extraction Optimization of Anti-oxidants from Roots of Angiopteris fokiensis Hieron.
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摘要: 为评价福建观音座莲根茎的抗氧化能力，并明确其抗氧化成分，本研究以VC当量抗氧化能力（VCEAC）为指标，通过单因素实验并结合正交试验，优化并确定抗氧化活性成分的最佳提取工艺；以DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法，进一步评价样品的抗氧化能力；以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法和福林酚显色法分别测定样品中总黄酮和总酚的含量，采用Pearson法分析2种成分与VCEAC值的相关性。结果表明，福建观音座莲根茎中抗氧化活性成分的提取工艺为：选取过3号筛的样品，60 ℃下，料液比为1:40 g/mL，以50%甲醇水浴加热提取1 h，此条件下可从1 g干燥的福建观音座莲根茎中提取得到相当于24.44 mg VC的抗氧化活性物质。11个不同批次福建观音座莲根茎的抗氧化能力存在较大的差异：VCEAC值介于9.41~29.32 mg/g之间；IC50值（DPPH法）介于0.85~3.03 mg/mL之间；IC50值（ABTS法）介于1.02~3.81 mg/mL之间。不同批次福建观音座莲根茎所含总黄酮和总酚含量分别介于8.75~30.18 mg/g和5.19~17.84 mg/g之间，均与VCEAC值呈显著相关（P<0.05）。因此，福建观音座莲根茎中所含的总黄酮和总酚是其主要的抗氧化活性成分，具有进一步开发的潜力。Abstract: This study was performed to clarify the antioxidant capacity and components of roots of Angiopteris fokiensis. With Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) as the index, single factor experiments combined with orthogonal tests were carried out to optimize the extraction process of antioxidant components. The antioxidant capacity was also evaluated based on DPPH and ABTS radical scavenging assays. The chromogenic method of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH and Folin-phenol was employed separately to determine the content of total flavonoids and total phenols, of which the correlation with VCEAC values was then analyzed based on Pearson method. The results demonstrated that the optimal extraction conditions were as follows: No.3 sieve, feed liquid ratio was 1:40 g/mL, volume fraction was 50%, extraction temperature was 60 ℃. Under these conditions, the sample was extracted with antioxidant capacity equivalent to 24.44 mg VC. The antioxidant capacity differed significantly between 11 batches of A. fokiensis: VCEAC values ranged from 9.41 to 29.32 mg/g; IC50 values ranged from 0.85 to 3.03 mg/mL determined by DPPH assay, and from 1.02 to 3.81 mg/mL determined by ABTS assay. The content of total flavonoids and total phenols ranged from 8.75 to 30.18 mg/g, and from 5.19 to 17.84 mg/g, respectively. The pearson analysis indicated that the content of total flavonoids or total phenols was correlated significantly with the VCEAC values of A. fokiensis (P<0.05). In conclusion, total flavonoids and total phenols in A. fokiensis were determined as the main antioxidant components with potential for further development.
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Keywords:
- Angiopteris fokiensis /
- antioxidant /
- VCEAC /
- total flavonoids /
- total phenols
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福建观音座莲（Angiopteris fokiensis），别名马蹄蕨，马蹄风，是观音座莲科观音座莲属植物，分布于我国福建、贵州、浙江、广东和广西等地[1]。作为药食同源植物，福建观音座莲的根茎可取淀粉，为山区一种食粮的来源[1]。同时，福建观音座莲作为常见民族药，常以根茎入药，具有清热凉血、疏风散淤、凉血止血之功效，主治风湿关节炎、腮腺炎、乳腺炎和跌打损伤等炎症相关疾病[2-3]。研究表明，福建观音座莲含有有机酸、黄酮、甾体、内酯、多糖和变型二肽等多样的成分类型[4-7]。其中，变型二肽金色酰胺醇酯和内酯类成分紫其内酯苷更是被证实具有抗炎活性[8-9]。但整体而言，福建观音座莲的抗炎活性缺乏有效的现代药理学数据支撑；抗炎作用机制尚不明确；抗炎活性物质基础有待系统阐明。
大量研究表明，因机体内自由基的产生与消除失衡而造成的氧化应激（Oxidative stress）[10-11]，是包括炎症在内的多种疾病的发病和进展机制[12-13]。因此，抗氧化治疗（Antioxidant therapy）逐渐成为治疗炎症相关疾病的有效策略[14-15]。目前，已有研究证实，福建观音座莲的叶和粗黄酮提取物均表现出较好的抗氧化活性[16-17]。这表明，福建观音座莲的抗炎功效或与其抗氧化能力相关。然而，关于福建观音座莲根茎抗氧化成分的提取工艺尚未见报道。因此，本项目以福建观音座莲的根茎为研究对象，以VC当量抗氧化能力为指标，在优化其抗氧化活性成分提取工艺的基础上，进一步评价了不同批次福建观音座莲的抗氧化活性，并测定了与抗氧化活性相关的总酚和总黄酮含量。旨在为福建观音座莲根茎的抗炎机制阐明以及进一步的开发与利用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
福建观音座莲根茎 2020年10月采自贵州省赤水市和三都县（详见表1）；DPPH和ABTS（98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；过硫酸钾（99.5%） 上海麦克林生化科技有限公司；芦丁对照品（99.5%）、没食子酸对照品（99%） 成都曼斯特生物科技有限公司；硝酸铝（99%） 天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚试剂（2N） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氢氧化钠（96%） 重庆川东化工集团有限公司；亚硝酸钠（99%） 天津市致远化学试剂有限公司；所有溶剂均为国产分析纯。
表 1 11批福建观音座莲药材的来源信息Table 1. Sources of 11 batches of A. fokiensis Hieron批次 产地 批次 产地 GY-1 贵州省三都县来楼村 GY-2 贵州省三都县拉缆村 GY-3 贵州省三都县中坝村 GY-4 贵州省三都县岩涝村 GY-5 贵州省赤水市葫市镇葫市村 GY-6 贵州省赤水市葫市镇葫市村 GY-7 贵州省赤水市葫市镇葫市村 GY-8 贵州省赤水市金沙村 GY-9 贵州省赤水市金沙村 GY-10 贵州省赤水市金沙村 GY-11 贵州省赤水市黄坭村 Synergy2荧光吸收光酶标仪 美国BioTek有限公司；KQ-400KDB超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；ME204分析天平 瑞士梅特勒-托利多国际有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 上海梅香仪器有限公司；UV-5900紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 抗氧化活性成分提取
采集福建观音座莲的根茎，洗净去泥，切片，自然阴干后粉碎备用。取0.5 g样品粉末，精密称定，于100 mL圆底烧瓶中，再加入适量溶剂后，加热提取一定时间。完毕，冷却后补重，过滤，收集续滤液，并用对应溶剂稀释10倍，即得抗氧化活性成分样品液。样品液置于4 ℃下保存备用，24 h内完成其VC当量抗氧化能力评价。
1.2.2 抗氧化活性成分的提取工艺优化
1.2.2.1 VC当量抗氧化能力的测定
称取VC粉末10 mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至10 mL，即得VC对照品溶液储备液。使用时，分别取VC储备液400、600、800、1000、1200 μL，用蒸馏水定容至10 mL，即得不同浓度的VC对照品工作液。
称取2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）粉末96 mg与过硫酸钾16 mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至25 mL，避光反应16 h后，即为ABTS+储备液，4 ℃保存备用。使用时，取此液用80%乙醇稀释20倍，即得ABTS+工作液，即配即用[18]。
参照文献[19]的方法并稍加改动，评价样品的VC当量抗氧化能力（Vitamin C equivalent antioxidant capacity，VCEAC）。具体操作如下：向96孔板中分别加入不同浓度的VC对照品工作液10 μL后，再依次加入ABTS+工作液250 μL。室温下避光反应6 min后，于734 nm处用多功能读数仪测定反应液的吸收值，即可建立ABTS+溶液吸光度降低值（ΔA）与VC浓度之间的标准曲线：Y734 nm=4.2144X−0.0338，R2=0.9986。
同样方法测定福建观音座莲根茎抗氧化活性成分样品液相对应的ABTS+溶液吸光度降低值，即测定福建观音座莲根茎的VCEAC值（mg VC/g样品），计算公式如下：
VCEAC(mg/g)=Y+0.03884.2144×20×V 式中：Y为对应的ABTS+溶液吸光度降低值；20为按1 g样品进行提取时的稀释系数；V为加入的提取溶剂体积，mL。
1.2.2.2 单因素实验
取批次为GY-1的样品，参照1.2.1的样品制备方法，分别考察提取溶剂种类、样品粒度、甲醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比6个因素对福建观音座莲根茎VCEAC值的影响。
提取溶剂种类：取过2号筛样品0.5 g，精密称定，70 ℃下，料液比为1:20 g/mL，分别以甲醇、乙醇、水溶液作为提取溶剂，水浴加热提取1 h。完毕，按照1.2.1进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值，以确定最佳溶剂。
样品粒度：分别取过2号筛（24目）、3号筛（50目）、4号筛（65目）的样品0.5 g，精密称定，70 ℃下，以甲醇为提取溶剂，料液比为1:20 g/mL，水浴加热提取1 h。完毕，按照1.2.1项进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值，以确定最佳样品粒度。
甲醇体积分数：取过3号筛样品0.5 g，精密称定，70 ℃下，料液比为1:20 g/mL，以不同体积分数的甲醇水溶液（0、30%、50%、70%、90%、100%；v/v，下同）水浴加热提取1 h。完毕，按照1.2.1项进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值，以确定最佳甲醇体积分数。
提取温度：取过3号筛样品0.5 g，精密称定，以50%甲醇为溶剂，料液比为1:20 g/mL，以不同温度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）水浴加热提取1 h。完毕，按照1.2.1项进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值，以确定最佳提取温度。
提取时间：取过3号筛样品0.5 g，精密称定，以50%甲醇为溶剂，料液比为1:20 g/mL，60 ℃下，以不同时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）水浴加热提取。完毕，按照1.2.1项进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值，以确定最佳提取时间。
料液比：取过3号筛样品0.5 g，精密称定，以50%甲醇为溶剂，以不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）在60 ℃下，水浴加热提取1 h。完毕，按照1.2.1项进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值，以确定最佳料液比。
1.2.2.3 正交试验
基于单因素实验结果，以甲醇体积分数（A）、料液比（B）和提取温度（C）为考察因素，VCEAC值为评价指标，进一步通过正交试验优化福建观音座莲根茎抗氧化活性成分的提取工艺，因素水平设计见表2。
表 2 正交试验因素水平设计Table 2. Factors and levels of the orthogonal test水平 因素 A甲醇体积分数（%） B料液比（g/mL） C提取温度（℃） 1 50 1:20 40 2 70 1:30 50 3 90 1:40 60 1.2.3 不同批次样品的VCEAC值测定
11个批次的样品粉碎后过3号筛，分别取0.5 g，精密称定，按确定的最优条件进行提取。完毕，按照1.2.1进行后处理，并按1.2.2.1方法进行测定，即可得11个批次样品的VCEAC值。
1.2.4 不同批次样品的抗氧化活性
1.2.4.1 样品的制备
11个批次的样品粉碎后过3号筛，分别取0.5 g，精密称定，按确定的最优条件进行提取。完毕，过滤，收集滤液，在水浴锅上挥干溶剂后进行恒重，得总浸膏。用50%甲醇进行溶解，稀释并定容，即得到质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的抗氧化活性样品液。
1.2.4.2 DPPH自由基清除活性
样品的DPPH自由基清除活性测定参照文献方法并稍加修改[20]：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）粉末58 mg，精密称定，用无水乙醇溶解并定容至100 mL，即得DPPH储备液，4 ℃保存备用。临用前，取该储备液4.5 mL，用无水乙醇稀释并定容至100 mL，即得DPPH工作液，现配现用。空白组：50%甲醇100 μL+DPPH工作液2.9 mL；样品组：不同质量浓度的抗氧化活性样品液各100 μL+DPPH工作液2.9 mL；对照组：不同质量浓度的抗氧化活性样品液各100 μL+无水乙醇2.9 mL。上述混合液在具塞试管中摇匀后室温下避光反应20 min。完毕，以空白溶剂为参比，于517 nm波长处分别测定其吸光度，并依次记录吸光度值：A0（空白组）；A1（样品组）；A2（对照组）。按下式计算自由基清除率：
自由基清除率(%)=A0−（A1−A2）A0×100 1.2.4.3 ABTS自由基清除活性
ABTS+工作液参照1.2.2.1方法进行配制。样品的ABTS自由基清除活性测定参照文献方法并稍加修改[18]：空白组：50%甲醇50 μL+ABTS+工作液3.0 mL（空白组）；样品组：不同质量浓度的抗氧化活性样品液各50 μL+ABTS+工作液3.0 mL；对照组：不同质量浓度的抗氧化活性样品液各50 μL+80%乙醇3.0 mL。上述混合液在具塞试管中摇匀后，室温下避光反应6 min。完毕，于734 nm波长处分别测定其吸光度，并依次记录吸光度值：A0（空白组）；A1（样品组）和A2（对照组）。按1.2.4.2计算ABTS自由基的清除率。
1.2.5 不同批次样品的总黄酮与总酚含量测定
1.2.5.1 总黄酮含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定样品的总黄酮含量[21]。称取芦丁对照品10 mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至10 mL，即为芦丁对照品工作液。分别取不同体积（200、300、400、500、600、700、800 μL）的芦丁对照品工作液于10 mL容量瓶中，加入300 μL 5% NaNO2，摇匀后静置5 min，加入300 μL 10% Al（NO3）3混匀后静置6 min，再加入2 mL 4% NaOH并用蒸馏水定容至刻度。将反应液混匀，静置15 min后，取250 μL上述反应液置于96孔板中，于510 nm下用多功能读数仪测定吸收值。以空白试剂为参比，即可建立吸光度值与芦丁对照品浓度之间的标准曲线，回归方程为：Y510 nm=8.0344X−0.0124，R2=0.9991。
11个批次的样品粉碎后过3号筛，分别取0.5 g，精密称定，按确定的最优条件进行提取，过滤即得福建观音座莲根茎抗氧化活性成分样品液。取样品液1 mL于10 mL容量瓶中，按上述操作进行显色反应。完毕，取250 μL反应液置于96孔板中，于510 nm下用多功能读数仪测定吸收值，即可得被测样品液的总黄酮含量（mg/g福建观音座莲根茎样品），计算公式如下：
总黄酮含量（mg/g）=Y+0.01248.0344×10×40 式中：Y为1 mL福建观音座莲根茎抗氧化活性成分样品液相应的酶标仪的吸收值；10为样品液显色的稀释倍数；40为按照1 g样品提取时加入的溶剂体积，mL。
1.2.5.2 总酚含量的测定
以没食子酸为对照品，采用福林酚显色法测定样品中总酚的含量[22]。取没食子酸对照品1 mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至10 mL，即为没食子酸对照品工作液。分别取不同体积（200、400、600、800、1000 μL）的没食子酸对照品工作液于10 mL容量瓶中，加入1 mL稀释10倍的福林酚试剂，混匀后室温下避光反应5 min，再加入2 mL 15% Na2CO3溶液，混匀，用蒸馏水定容至刻度。将此反应液置于室温下避光反应2 h后，取250 μL上述反应液置于96孔板中，于760 nm下用多功能读数仪测定吸收值。以空白试剂为参比，即可建立吸光度与没食子酸对照品浓度之间的标准曲线，回归方程为：Y760 nm=60.587X+0.0229，R2=0.9992。
11个批次的样品粉碎后过3号筛，分别取0.5 g，精密称定，按确定的最优条件进行提取，过滤即得福建观音座莲根茎抗氧化活性成分样品液。取样品液100 μL，用蒸馏水稀释10倍后置于10 mL容量瓶中，按上述操作进行显色。完毕，取250 μL反应液置于96孔板中，于760 nm下用多功能读数仪测定吸收值，即可得最佳工艺条件下所提取的总酚含量（mg/g福建观音座莲根茎样品），计算公式如下：
总酚含量（mg/g）=Y−0.022960.587×100×40 式中：Y为100 μL福建观音座莲根茎抗氧化活性成分样品液相应的酶标仪的吸收值；100为样品液显色的稀释倍数；40为按照1 g样品提取时加入的溶剂体积，mL。
1.3 数据处理
各试验重复3次，数值均以
¯X ±SD表示；采用Excel 2010和origin 2018软件进行数据处理和绘图；采用SPSS 26.0软件进行显著性和相关性分析，并计算半数清除浓度（IC50）。采用Pearson法分析VCEAC值、IC50值与总酚、总黄酮含量的相关性。2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
分别考察了提取溶剂、样品粒度、甲醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比6个因素对样品VCEAC值的影响，结果如图1所示。其中，提取溶剂方面（图1A），甲醇有利于抗氧化活性成分的提取，对应VCEAC值为11.58 mg/g，并显著优于乙醇和水（P<0.05），故选择甲醇为提取溶剂进行进一步试验；样品粒度方面（图1B），在所考察的范围内，样品粒度对VCEAC的影响并未显示出显著性差异（P>0.05），故选择了3号筛进行进一步试验；甲醇体积分数方面（图1C），显然，甲醇与水的比例对样品抗氧化活性成分的提取影响显著，随着水的比例增加，对应VCEAC值呈现先升后降的趋势，以70%甲醇为最优，对应VCEAC值为17.87 mg/g。张勇等[17]的研究表明，福建观音座莲叶的抗氧化活性成分主要集中于中等极性的乙酸乙酯部位，应是甲醇更有利于提取。一定比例的水有助于抗氧化活性成分的提取，或与降低叶绿素、脂类等非极性物质的提取率有关[23]。提取温度方面（图1D），在30~90 ℃的考察范围内，VCEAC值随提取温度升高，整体呈缓慢上升趋势，90 ℃对应的VCEAC值最优。考虑温度过高可能会导致抗氧化成分因氧化和降解而失活，故选择与90 ℃无显著差异的60 ℃进行进一步试验（P>0.05）。提取时间方面（图1E），在2.5 h以内，提取时间对VCEAC值的影响无显著性差异（P>0.05）；超过2.5 h，样品的VCEAC值显著降低（P<0.05），这或与长时间加热导致抗氧化成分失活有关[24]。综合考虑，最终选择1 h作为提取时间进行进一步试验。料液比方面（图1F），在1:20~1:40 g/mL的范围内，VCEAC值呈显著升高趋势（P<0.05）；料液比超过1:40 g/mL，反而不利于抗氧化活性成分的提取。
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图 1 提取溶剂（A）、样品粒度（B）、甲醇体积分数（C）、提取温度（D）、提取时间（E）、料液比（F）对福建观音座莲根茎VCEAC值的影响注：图中小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。Figure 1. Effects of solvents (A), particle size (B), methanol concentration (C), extraction temperature (D), extraction duration (E), ratio of solid to liquid (F) on VCEAC values of rhizomes of A. fokiensis显然，甲醇体积分数、提取温度和料液比这3个因素对样品的VCEAC值影响最为显著，故选为考察因素用于进一步的正交试验。
2.2 正交试验与验证性试验结果
2.2.1 正交试验
根据单因素实验结果，选取过3号筛样品水浴加热提取1 h，以提取溶剂的甲醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）为考察因素，以VCEAC为评价指标，通过正交试验优化福建观音座莲根茎抗氧化活性成分的提取工艺，结果如表3所示。极差分析结果显示，空列D的R值最小，佐证了正交设计试验数据的可靠性。同时，在所考察的水平范围内，各因素影响福建观音座莲根茎中抗氧化活性成分提取的主次顺序为A>B>C，由此可得出最佳提取工艺为A2B3C3，进一步的方差分析结果显示（表4），因素A和B对VCEAC值的影响具有显著性意义（P<0.05），结合比较因素各水平之间的差异性，发现因素A水平1和水平2之间并无显著差别（表5）；因素B各水平之间差异显著（P<0.05）；因素C各水平间均无显著性差别（P>0.05）。因此，综合考虑，最终确定福建观音座莲根茎抗氧化活性成分的最佳提取工艺为A1B3C3，即选取过3号筛样品，60 ℃下，料液比为1:40 g/mL，以50%甲醇水浴加热提取1 h。
表 3 正交试验结果Table 3. Results of orthogonal experiments试验号 因素 VCEAC（mg/g） A B C D* 1 1 1 1 1 17.44±0.04 2 1 2 2 2 19.10±0.12 3 1 3 3 3 22.73±0.11 4 2 1 2 3 17.47±0.95 5 2 2 3 1 19.90±0.95 6 2 3 1 2 21.99±0.59 7 3 1 3 2 12.45±0.56 8 3 2 1 3 13.72±0.13 9 3 3 2 1 16.99±0.11 K1 59.27 47.36 53.15 54.33 K2 59.36 52.72 53.56 53.54 K3 43.16 61.71 55.08 53.92 R 16.20 14.35 1.93 0.79 注：*标注列为空白列，用于估计实验误差。 表 4 方差分析Table 4. Analysis of variance方差分析 平方和 自由度 均方 F值 P值 A 57.998 2 28.999 557.314 0.002* B 35.052 2 17.578 336.827 0.003* C 0.689 2 0.345 6.623 0.131 误差 0.104 2 0.052 总和 93.844 8 注：*代表差异显著（P<0.05）；表5同。 表 5 因素各水平之间差异分析Table 5. Variation analysis between factor levels水平 显著性 A（%） B（g/mL） C（℃） 1 2 0.887 0.011* 0.539 3 0.001* 0.002* 0.075 2 1 0.887 0.011* 0.539 3 0.001* 0.004* 0.113 2.2.2 验证试验
GY-1样品经粉碎后过3号筛，取相应样品粉末0.5 g，精密称定，60 ℃下，用20 mL 50%甲醇水浴加热提取1 h。平行三次。完毕，按照1.2.1项进行后处理，并按1.2.2.1方法测定待测液的VCEAC值。结果显示，三次平行实验确定的VCEAC平均值为24.44 mg/g，是所有实验的最优水平，验证了所建立的最佳提取工艺的合理性。同时，结合RSD=0.5%，进一步证明了最佳提取工艺的稳定性。
2.3 不同批次样品的VCEAC值
VCEAC，即VC当量抗氧化能力，其实质是以VC为参照测定被测样品抗氧化活性成分的含量，被广泛用于抗氧化能力的直观评价[19,25-26]。基于建立的最佳提取工艺，通过测定11个批次的福建观音座莲根茎的VCEAC值，评价其抗氧化能力。由表6可知，福建观音座莲根茎的VCEAC值介于9.41~29.32 mg/g之间，意味着不同批次福建观音座莲根茎的抗氧化能力差异明显。其中，批号为GY-4和GY-5的样品的抗氧化能力最强，VCEAC值分别为29.21 mg/g和29.32 mg/g。
表 6 11个批次福建观音座莲根茎的VCEAC值Table 6. VCEAC values of 11 batches of A. fokiensis批次 VCEAC（mg/g） 批次 VCEAC（mg/g） GY-1 22.49±0.25 GY-2 25.74±1.01 GY-3 9.41±0.70 GY-4 29.21±0.94 GY-5 29.32±0.67 GY-6 21.96±0.69 GY-7 19.26±1.17 GY-8 22.11±0.76 GY-9 9.63±0.46 GY-10 16.05±1.04 GY-11 26.34±2.47 2.4 不同批次样品的抗氧化活性
通过DPPH和ABTS自由基清除试验评价11个批次福建观音座莲根茎的抗氧化活性，结果如图2和图3所示。从图中可以看出，在所考察的浓度范围内，各样品对DPPH和ABTS自由基的清除能力随其质量浓度的升高而增大。进一步运用SPSS 26.0软件计算各样品的抗氧化能力，以半数抑制浓度（IC50，mg/mL）表示。如表7所示，各批次福建观音座莲根茎的自由基清除活性存在明显差异。其中，基于DPPH法测定的IC50值介于0.85~3.03 mg/mL之间，ABTS法测定的IC50值介于1.02~3.81 mg/mL之间。此外，样品对DPPH自由基的清除活性略强于对ABTS自由基的清除活性。
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图 2 11个批次福建观音座莲根茎提取物对DPPH自由基清除作用Figure 2. Scavenging effect of root extract from 11 bathes of A. fokiensis on DPPH radicals![]()
图 3 11个批次福建观 音座莲根茎提取物对ABTS自由基清除作用Figure 3. Scavenging effect of root extract from 11 bathes of A. fokiensis on ABTS radicals表 7 DPPH法和ABTS法测定的11批福建观音座莲的IC50值Table 7. IC50 values of 11 batches of A. fokiensis determined by DPPH and ABTS scavenging assay编号 IC50值（mg/mL） 编号 IC50（mg/mL） DPPH法 ABTS法 DPPH法 ABTS法 GY-1 1.59±0.02 1.57±0.02 GY-2 0.85±0.01 1.02±0.02 GY-3 1.77±0.04 1.85±0.03 GY-4 1.08±0.01 1.38±0.01 GY-5 1.18±0.01 1.42±0.02 GY-6 1.54±0.02 1.87±0.02 GY-7 1.89±0.01 2.15±0.02 GY-8 1.25±0.02 1.71±0.04 GY-9 3.03±0.05 3.81±0.13 GY-10 2.29±0.07 2.72±0.03 GY-11 1.66±0.02 2.03±0.01 2.5 不同批次样品的总酚与总黄酮含量
总酚与总黄酮既是公认的与抗氧化活性密切相关的天然组分[27-29]，也是福建观音座莲中已报道的成分类型[16-17]。为进一步明确福建观音座莲根茎抗氧化提取物的有效组分，测定了11个批次福建观音座莲根茎抗氧化提取物的总酚和总黄酮含量。结果表明（表8），各批次福建观音座莲根茎抗氧化提取物的总酚和总黄酮含量差异明显，且明显高于叶提取物中总酚与总黄酮的含量[17]。其中，总酚含量介于5.19~17.84 mg/g之间，总黄酮含量介于8.75~30.18 mg/g之间。此外，样品间总酚和总黄酮的含量差异与对应的VCEAC值和IC50值（DPPH法和ABTS法）均表现出类似的变化趋势，提示我们总酚和总黄酮的含量与福建观音座莲根茎的抗氧化能力密切相关。进一步计算样品的VCEAC值和IC50值与相应总酚和总黄酮含量之间的皮尔逊相关系数，发现福建观音座莲根茎的VCEAC值与其所含总酚或总黄酮均呈极显著正相关，IC50值与其所含总酚或总黄酮均呈显著负相关（表9），表明总酚和总黄酮是福建观音座莲根茎的主要抗氧化活性物质。
表 8 11个批次福建观音座莲根茎抗氧化提取物的总酚和总黄酮含量Table 8. Contents of total phenols and flavonoids of antioxidant extract from 11 batches of A. fokiensis批次 含量（mg/g） 批次 含量（mg/g） 总黄酮 总酚 总黄酮 总酚 GY-1 18.64±1.02 11.31±0.30 GY-2 29.28±0.27 14.70±0.02 GY-3 8.75±0.42 5.19±0.14 GY-4 26.91±1.37 16.28±0.34 GY-5 30.18±0.76 17.84±0.50 GY-6 20.20±1.11 13.21±0.06 GY-7 17.61±0.90 11.34±0.02 GY-8 23.33±1.30 12.88±0.16 GY-9 11.47±0.25 6.43±0.19 GY-10 17.92±0.12 9.08±0.02 GY-11 28.60±0.42 15.55±0.19 表 9 VCEAC值、IC50值与总酚或总黄酮含量的相关系数Table 9. Correlation coefficient between antioxidant capacity and content of total phenols or flavonoids分析指标 总黄酮 总酚 DPPH IC50 −0.733* −0.744** ABTS IC50 −0.631* −0.653* VCEAC 0.948** 0.984** 注：*在0.05级别（双尾），相关性显著；**在0.01级别（双尾），相关性显著。 3. 结论
本实验以VC当量抗氧化能力（VCEAC）为指标，测定福建观音座莲根茎中抗氧化活性成分的量。通过单因素及正交试验，确定福建观音座莲抗氧化活性成分的最佳提取工艺：选取过3号筛的样品，60 ℃下，料液比为1:40 g/mL，以50%甲醇水浴加热提取1 h。此工艺条件下所得样品液的VCEAC值为24.44 mg/g。
为福建观音座莲的品质评价奠定基础，本实验基于构建的最佳提取工艺，以VCEAC值与IC50值（DPPH法和ABTS法）为指标直观地评价不同批次福建观音座莲根茎的抗氧化能力。结果显示，各批次样品的VCEAC值在9.41~29.32 mg/g之间；DPPH法和ABTS法测定的IC50值分别在0.85~3.03 mg/mL和1.02~3.81 mg/mL之间。这表明不同批次的福建观音座莲根茎的抗氧化能力存在明显的差异。福建观音座莲为药食两用资源，以根茎为食用和药用部位。因此，有必要对福建观音座莲开展品质评价研究。
为阐明福建观音座莲的抗氧化活性组分，本实验对各批次样品的VCEAC值和IC50值与其所含总酚和总黄酮的含量进行了相关分析。结果显示福建观音座莲根茎的VCEAC值与其所含总酚或总黄酮均呈极显著正相关（P<0.01），IC50值与其所含总酚或总黄酮均呈显著负相关（P<0.05），表明总酚和总黄酮是福建观音座莲根茎中主要的抗氧化活性组分，这与张勇等[17]等的研究结论一致：总酚与总黄酮是福建观音座莲叶提取物的主要抗氧化活性组分。本实验11个批次福建观音座莲根茎中总酚和总黄酮的含量均显著高于叶中总酚和总黄酮的含量[17]，根茎较叶应表现出更强的抗氧化能力。但通过数据分析发现，就DPPH自由基清除活性而言，仅有GY-2样品的根茎与叶活性相当（0.85 vs 0.80 mg/mL）；就ABTS自由基清除活性而言，GY-9和GY-10样品根茎的活性显著弱于叶。这提示福建观音座莲的抗氧化作用并非是仅仅依靠总酚或总黄酮，而是多种成分共同作用的复杂过程[30]。
随着抗氧化疗法的兴起，天然抗氧化剂逐渐得到了人民的青睐。作为药食两用植物资源，福建观音座莲表现出良好的抗氧化潜力。进一步筛选抗氧化活性部位、阐明具体活性单体成分、明确抗氧化活性与抗炎活性的相关性，有助于提升福建观音座莲的科技内涵，并促进资源高效合理利用。
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图 1 提取溶剂（A）、样品粒度（B）、甲醇体积分数（C）、提取温度（D）、提取时间（E）、料液比（F）对福建观音座莲根茎VCEAC值的影响
注：图中小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Effects of solvents (A), particle size (B), methanol concentration (C), extraction temperature (D), extraction duration (E), ratio of solid to liquid (F) on VCEAC values of rhizomes of A. fokiensis
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图 2 11个批次福建观音座莲根茎提取物对DPPH自由基清除作用
Figure 2. Scavenging effect of root extract from 11 bathes of A. fokiensis on DPPH radicals
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图 3 11个批次福建观 音座莲根茎提取物对ABTS自由基清除作用
Figure 3. Scavenging effect of root extract from 11 bathes of A. fokiensis on ABTS radicals
表 1 11批福建观音座莲药材的来源信息
Table 1 Sources of 11 batches of A. fokiensis Hieron
批次 产地 批次 产地 GY-1 贵州省三都县来楼村 GY-2 贵州省三都县拉缆村 GY-3 贵州省三都县中坝村 GY-4 贵州省三都县岩涝村 GY-5 贵州省赤水市葫市镇葫市村 GY-6 贵州省赤水市葫市镇葫市村 GY-7 贵州省赤水市葫市镇葫市村 GY-8 贵州省赤水市金沙村 GY-9 贵州省赤水市金沙村 GY-10 贵州省赤水市金沙村 GY-11 贵州省赤水市黄坭村 
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表 2 正交试验因素水平设计
Table 2 Factors and levels of the orthogonal test
水平 因素 A甲醇体积分数（%） B料液比（g/mL） C提取温度（℃） 1 50 1:20 40 2 70 1:30 50 3 90 1:40 60
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表 3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal experiments
试验号 因素 VCEAC（mg/g） A B C D* 1 1 1 1 1 17.44±0.04 2 1 2 2 2 19.10±0.12 3 1 3 3 3 22.73±0.11 4 2 1 2 3 17.47±0.95 5 2 2 3 1 19.90±0.95 6 2 3 1 2 21.99±0.59 7 3 1 3 2 12.45±0.56 8 3 2 1 3 13.72±0.13 9 3 3 2 1 16.99±0.11 K1 59.27 47.36 53.15 54.33 K2 59.36 52.72 53.56 53.54 K3 43.16 61.71 55.08 53.92 R 16.20 14.35 1.93 0.79 注：*标注列为空白列，用于估计实验误差。
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表 4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
方差分析 平方和 自由度 均方 F值 P值 A 57.998 2 28.999 557.314 0.002* B 35.052 2 17.578 336.827 0.003* C 0.689 2 0.345 6.623 0.131 误差 0.104 2 0.052 总和 93.844 8 注：*代表差异显著（P<0.05）；表5同。
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表 5 因素各水平之间差异分析
Table 5 Variation analysis between factor levels
水平 显著性 A（%） B（g/mL） C（℃） 1 2 0.887 0.011* 0.539 3 0.001* 0.002* 0.075 2 1 0.887 0.011* 0.539 3 0.001* 0.004* 0.113
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表 6 11个批次福建观音座莲根茎的VCEAC值
Table 6 VCEAC values of 11 batches of A. fokiensis
批次 VCEAC（mg/g） 批次 VCEAC（mg/g） GY-1 22.49±0.25 GY-2 25.74±1.01 GY-3 9.41±0.70 GY-4 29.21±0.94 GY-5 29.32±0.67 GY-6 21.96±0.69 GY-7 19.26±1.17 GY-8 22.11±0.76 GY-9 9.63±0.46 GY-10 16.05±1.04 GY-11 26.34±2.47
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表 7 DPPH法和ABTS法测定的11批福建观音座莲的IC50值
Table 7 IC50 values of 11 batches of A. fokiensis determined by DPPH and ABTS scavenging assay
编号 IC50值（mg/mL） 编号 IC50（mg/mL） DPPH法 ABTS法 DPPH法 ABTS法 GY-1 1.59±0.02 1.57±0.02 GY-2 0.85±0.01 1.02±0.02 GY-3 1.77±0.04 1.85±0.03 GY-4 1.08±0.01 1.38±0.01 GY-5 1.18±0.01 1.42±0.02 GY-6 1.54±0.02 1.87±0.02 GY-7 1.89±0.01 2.15±0.02 GY-8 1.25±0.02 1.71±0.04 GY-9 3.03±0.05 3.81±0.13 GY-10 2.29±0.07 2.72±0.03 GY-11 1.66±0.02 2.03±0.01
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表 8 11个批次福建观音座莲根茎抗氧化提取物的总酚和总黄酮含量
Table 8 Contents of total phenols and flavonoids of antioxidant extract from 11 batches of A. fokiensis
批次 含量（mg/g） 批次 含量（mg/g） 总黄酮 总酚 总黄酮 总酚 GY-1 18.64±1.02 11.31±0.30 GY-2 29.28±0.27 14.70±0.02 GY-3 8.75±0.42 5.19±0.14 GY-4 26.91±1.37 16.28±0.34 GY-5 30.18±0.76 17.84±0.50 GY-6 20.20±1.11 13.21±0.06 GY-7 17.61±0.90 11.34±0.02 GY-8 23.33±1.30 12.88±0.16 GY-9 11.47±0.25 6.43±0.19 GY-10 17.92±0.12 9.08±0.02 GY-11 28.60±0.42 15.55±0.19
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表 9 VCEAC值、IC50值与总酚或总黄酮含量的相关系数
Table 9 Correlation coefficient between antioxidant capacity and content of total phenols or flavonoids
分析指标 总黄酮 总酚 DPPH IC50 −0.733* −0.744** ABTS IC50 −0.631* −0.653* VCEAC 0.948** 0.984** 注：*在0.05级别（双尾），相关性显著；**在0.01级别（双尾），相关性显著。
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