Optimization of Extraction Process of Schisandra chinensis Polysaccharide and Analysis of Its Inhibitory Activity Against α-Glucosidase
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摘要: 以五味子为原料，采用单因素实验探究超声功率、提取温度、复合酶添加量和提取时间对五味子多糖得率的影响。在此基础上，通过正交试验优化超声辅助复合酶提取五味子多糖工艺。随后，基于酶抑制和荧光光谱探索五味子多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，超声辅助复合酶提取五味子多糖最优工艺参数组合为：超声功率200 W、提取温度30 ℃、复合酶添加量0.20%、提取时间40 min，五味子多糖得率为（8.12%±0.10%）。五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50为27.15 μg/mL，并以竞争性与非竞争性相混合的方式抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并能同时引起α-葡萄糖苷酶发生荧光猝灭，该研究结果为五味子的进一步开发提供理论依据。Abstract: The effect of ultrasonic power, extraction temperature, compound enzyme dosage and extraction time on the yield of polysaccharide from Schisandra chinensis were investigated by single factor experiment. The ultrasonic assisted complex enzyme extraction of polysaccharides from Schisandra chinensis was optimized by orthogonal experiment based on the results of single factor experiment. The inhibitory activity of Schisandra chinensis polysaccharide on α-glucosidase was analyzed by enzyme inhibition and fluorescence spectroscopy. The results showed that the optimum extraction parameters to achieve the highest polysaccharide yield (8.12%±0.10%) from Schisandra chinensis by ultrasonic-assisted extraction of complex enzyme were obtained under a ultrasonic power of 200 W, extraction temperature of 30 ℃, enzyme dosage of 0.20% and extraction time of 40 min. The IC50 of Schisandra chinensis polysaccharide on α-glucosidase inhibition was 27.15 μg/mL, and α-glucosidase activity was inhibited by a mixture of competitive and non competitive. Meanwhile, Schisandra chinensis polysaccharide could cause fluorescence quenching of α-glucosidase. The results provide a theoretical basis for the further development of Schisandra chinensis.
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Keywords:
- Schisandra chinensis /
- polysaccharide /
- extraction /
- process /
- α-glucosidase
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五味子（Schisandra chinensis Baill.）属于木兰科的藤本植物，广泛种植于我国黑龙江、吉林、山东、山西和广西等地区[1]。五味子中富含多糖、木质素和挥发性油等活性成分，其作为名贵药材在《神农本草经》中早有记载[2]。已有研究证实五味子多糖具有显著的抗氧化活性和抗肿瘤活性，同时具有提高机体免疫能力、保护肝脏及降低血糖等功效[3]。目前，五味子多糖的提取主要依赖于传统的溶剂提取方式，虽然该方法操作简单，但存在溶剂消耗量大、耗时长、提取效率低等问题。随着提取技术的发展，传统的溶剂提取方式无法高效获得五味子多糖[4]。因此，寻找从五味子中快速高效的提取多糖技术是当前研究的热点。
超声提取作为新型的物理提取技术，其基于超声的“空化效应”，可以加速植物细胞壁破裂、降低细胞内目标成分的传质阻力、提高目标成分在溶剂中的扩散系数，从而达到强化提取目标成分的目的[5]。因此，该技术已被广泛应用于天然活性物质的提取。大量研究表明植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等成分构成。因此，采用酶（纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶）辅助降解植物细胞壁，降低细胞内活性成分的传质阻力，有利于活性成分由内向外扩散，提高活性成分得率[6]。将超声和复合酶两种先进的提取方式联合起来应用于五味子多糖的提取是一种有效可行的方式。尹秀莲等[7]和李栋等[8]均利用超声辅助复合酶法提取桑黄多糖和红枣多糖，研究发现该方式多糖得率明显优于单一的超声提取和复合酶提取。而目前关于利用超声辅助复合酶提取五味子多糖的研究鲜见报道。目前针对多糖活性方面主要集中在其抗氧化活性的研究，而关于五味子多糖是否具有降糖活性未见报道。
因此，本研究采用超声辅助复合酶技术对五味子多糖进行提取，并研究其功能活性。首先通过单因素实验，探究超声功率、提取温度、复合酶添加量和提取时间对五味子多糖得率的影响；在此基础上，通过正交试验优化其提取工艺，然后再进一步探究最优工艺条件下获得的多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
五味子果实 吉林省颐鹿堂商贸有限公司；阿卡波糖 上海澄绍生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（酵母，68.5 kDa） 美国Sigma公司；果胶酶（3000 U/g） 河北冠朗生物科技有限公司；纤维素酶（2000 U/g） 上海联硕生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（2300 U/g） 合肥博美生物科技有限责任公司；D-无水葡萄糖标准品 河北陌槿生物科技有限公司；乙醇 分析纯，河南天孚化工有限公司；苯酚 分析纯，昆山惠尔众化工有限公司；硫酸 分析纯，山东西亚化学工业有限公司；盐酸 南京肽业生物科技有限公司；对硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP） 分析纯，泰州苏泽化工材料有限公司；对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 分析纯，上海吉至生化科技有限公司；硫酸铵 分析纯，郑州杰克斯化工产品有限公司；去离子、蒸馏水 上海澄绍生物科技有限公司。
CYS-Y21S超声波提取仪 杭州超音速机电科技有限公司；LB321旋转蒸发仪、UV-1900PCS光束紫外可见分光光度计 上海继谱电子科技有限公司；BK-FD10S真空冷冻干燥机 常州市中冷冷冻设备有限公司；HH-1型恒温水浴锅 无锡玛瑞特科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
在室温条件下对五味子果实进行晾干，然后采用九阳粉碎机将其粉碎，过80目筛，制得五味子粉末，然后置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 超声辅助复合酶提取五味子多糖
采用超声辅助复合酶法提取五味子多糖，具体步骤如下：准确称取5 g五味子粉末，在40 ℃条件下，加入石油醚回流提取2 h，其目的是除去五味子中的脂溶性成分，将获得的提取物在40 ℃的旋转蒸发仪旋干除去溶剂，然后加入100 mL蒸馏水使其充分混合。果胶酶和木瓜蛋白酶酶活按SB/T10317-1999 蛋白酶活力测定法测定，纤维素酶酶活按GB/T23881-2009测定。依据酶活测定结果选择复合酶（纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶）的质量比为1:1:1（g/g/g）。混合液按照上述比例添加复合酶，然后将其置于超声波提取仪中，通过控制面板设定超声时间30 min，待提取结束后，提取物以7000 r/min离心15 min，取上清液。在上清液中加入3倍体积的无水乙醇，在4 ℃冰箱中过夜醇沉，然后分别用体积分数80%乙醇和丙酮进行洗涤，随后将其置于55 ℃烘箱中干燥48 h，即得到五味子多糖。
1.2.3 紫外分析
将五味子多糖进行复溶，从中取出0.2 mL置于具塞管中，依次加入2 mL质量浓度25 mg/L D-葡萄糖标准溶液、2 mL体积分数5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸，在50 ℃下反应30 min，随后将样品通过紫外分光光度计进行紫外扫描，由扫描结果可知，在波长491 nm下样品吸光度最大。
1.2.4 葡萄糖标准曲线的绘制及多糖得率的计算
D-无水葡萄糖作为标准品，将其配制成质量浓度为0、12.5、25.0、50.0和100.0 mg/L的标准溶液，从中分别取出2 mL，进行显色反应，在波长491 nm下，通过紫外分光光度计测定样品吸光度。以样品浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），对数据进行线性拟合得到如下的标准方程。
Y=0.0161X+0.1071R2=0.9985 (1) 称取0.1 g五味子粗多糖，配置成1 mg/mL的多糖溶液，然后将其稀释成一定的倍数，随后按照1.2.3实验步骤进行显色反应，测定样品吸光度，通过式（2）和式（3）计算多糖得率（Y）。
M(%)=V×C0.1×100 (2) Y(%)=W2×Mm×100 (3) 式中：M为多糖质量分数，%；Y为多糖得率，%；C为待测样品浓度，g/mL；W2为提取所得的五味子多糖质量，g；m为五味子原材料质量，g；V为待测样品的体积，L。
1.2.5 单因素实验
采用超声辅助复合酶法提取五味子多糖，选择超声功率、提取温度、复合酶添加量和提取时间4个因素进行单因素实验，研究4个因素对五味子多糖得率的影响。
1.2.5.1 超声功率对五味子多糖得率的影响
将提取温度、复合酶添加量和提取时间分别固定在50 ℃、0.20%和40 min，考察超声功率（100、200、300、400和500 W）对五味子多糖得率的影响。
1.2.5.2 提取温度对五味子多糖得率的影响
将超声功率、复合酶添加量和提取时间分别固定在300 W、0.20%和40 min，考察提取温度（30、40、50、60和70 ℃）对五味子多糖得率的影响。
1.2.5.3 复合酶添加量对五味子多糖得率的影响
将超声功率、提取温度和提取时间分别固定在300 W、50 ℃和40 min，考察复合酶添加量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%）对五味子多糖得率的影响。
1.2.5.4 提取时间对五味子多糖得率的影响
将超声功率、提取温度和复合酶添加量分别固定在300 W、50 ℃和0.20%，考察提取时间（20、30、40、50和60 min）对五味子多糖得率的影响。
1.2.6 正交试验
以单因素实验结果为基础，设计L9（34）正交试验，设计如表1所示。
表 1 超声辅助复合酶提取五味子多糖的L9（34）正交试验因素及水平Table 1. L9(34) orthogonal experiment factors and levels of ultrasonic assisted complex enzyme extraction of polysaccharides from Schisandra chinensis水平 因素 A 超声功率（W） B 提取温度（℃） C 复合酶添加量（%） 1 200 30 0.15 2 300 40 0.20 3 400 50 0.25 1.2.7 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
PNP是由α-葡萄糖苷酶水解PNPG所产生的，在波长405 nm处PNP具有最大吸收峰。选择阿卡波糖作为阳性对照，将五味子多糖和阿卡波糖分别配置成质量浓度为10、20、30、40和50 μg/mL的样品溶液。分别取1 mL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶于试管中，随后分别加入1 mL不同浓度的五味子多糖和阿卡波糖溶液，将样品溶液混合，其余操作参考文献[9]的方法。通过式（4）计算α-葡萄糖苷酶抑制率。
抑制率(%)=A对照−(A样品−A空白)A对照×100 (4) 式中：A对照为对照品（阿卡波糖）吸光度；A样品为对五味子多糖样品的吸光度；A空白为对空白样品的吸光度。
1.2.8 α-葡萄糖苷酶抑制类型判定
为判断五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型，设定PNPG质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，设定五味子多糖质量浓度为0、20、50 μg/mL，α-葡萄糖苷酶含量为0.2 U/mL，在此条件下，测定反应速率，以反应速率（1/V）为纵坐标，以PNPG浓度的倒数（1/[S]）为横坐标作图，获得Lineweaver-Burk双倒数曲线，用于判断五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型[10]。
1.2.9 荧光光谱测定
参照文献[11]的方法，分别取1 mL不同质量浓度10、20、30、40和50 μg/mL的五味子多糖与4 mL α-葡萄糖苷酶液（0.2 U/mL）均匀混合，在30 ℃条件下，反应10 min，在波长320~380 nm范围内进行荧光光谱扫描。
1.3 数据处理
每组实验重复3次，结果用平均值±标准差表示；采用Statistix 8.0软件对每组实验数据进行方差分析（ANOVA）；采用SAS 8.0软件分析结果的显著差异，P<0.05表示结果存在显著差异；P>0.05表示结果无显著差异；Origin 9.0进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 单因素对五味子多糖得率的影响
超声功率、提取温度、复合酶添加量和提取时间4个因素对五味子多糖得率的影响结果如图1所示。由图1A可知，当超声功率在100~300 W范围内，五味子多糖得率随超声功率增加呈现显著增加的趋势（P<0.05）。其原因是随超声功率的增加，一方面由于超声产生的“机械效应”、“空化效应”和“热效应”加快了五味子细胞壁的破裂，有效降低多糖由内向外的传递阻力[12]；另一方面超声功率的增加有助于提高多糖的扩散系数和溶解度，从而使更多的多糖扩散到溶剂中，进而提高多糖得率[13]。当超声功率超过300 W时，五味子多糖得率随超声功率增加而显著降低（P<0.05）。其原因是较高的超声功率增加杂质的溶解度，同时可能破坏多糖的化学键，不利于多糖的提取[14]。该研究结果与BABAMORADI等[15]和李刚刚等[16]采用超声辅助提取茛花多糖和蕨麻多糖的结果一致。综上考虑，选择超声功率为200、300和400 W三个水平进行后续正交试验。
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图 1 单因素对五味子多糖得率的影响注：不同字母表示组间差异显著，P<0.05。Figure 1. Effect of single factor on polysaccharide yield of Schisandra chinensis由图1B可知，当提取温度在30~50 ℃范围内，随提取温度升高五味子多糖得率呈显著增加的趋势（P<0.05），当提取温度在50 ℃时，五味子多糖得率取得最大值（7.45%±0.16%）。其原因一方面是随提取温度升高，增加多糖扩散系数和提高多糖在溶剂中的溶解度[17]；另一方面，随温度的升高复合酶的催化活性提高，有利于复合酶降解五味子细胞壁，降低多糖的传质阻力，从而提高多糖得率[18]。但当提取温度高于50 ℃时，五味子多糖得率随提取温度的升高而呈显著降低的趋势（P<0.05）。其原因可能是高温破坏五味子多糖结构[19]；此外，高温降低复合酶的活性，甚至使复合酶完全失活，不利于复合酶对五味子细胞壁的降解，进而不利于多糖的提取[20]。王杉杉等[21]采用超声辅助复合酶提取枸杞多糖时也有类似的结论。因此，提取温度选择30、40、50 ℃三个水平进行后续的正交试验。
由图1C可知，当复合酶添加量低于0.20%的范围内，五味子多糖得率随复合酶添加量增加呈显著增加的趋势（P<0.05）。这是由于复合酶的添加量越高，单位时间内催化五味子细胞壁的降解程度越大，传质阻力越低，更有利于多糖从细胞内扩散到溶剂中，从而提高多糖得率[22]。复合酶添加量在0.20%~0.30%范围内，继续增加复合酶添加量多糖得率反而显著降低（P<0.05）。可能是由于酶催化引起过多的杂质被萃取出来，从而影响多糖提取。这与LIU等[23]采用超声辅助酶提取枸杞多糖的结果一致。因此，选择复合酶添加量为0.15%、0.20%和0.25%进行后续的正交试验。
由图1D可知，当提取时间在20~40 min范围内时，五味子多糖得率随提取时间的延长而显著增加（P<0.05）。其原因可能是在提取初期，超声产生的“空化效应”、“机械效应”及复合酶高效催化效应协同促进五味子多糖从细胞内扩散到溶剂中，从而加快多糖的提取[24]；此外，在提取初期，细胞内外存在较大的浓度梯度，浓度梯度可作为五味子多糖的传质驱动力，进而促进多糖的提取[25]。但当提取时间超过40 min时，多糖得率随提取时间进一步延长而无显著变化（P>0.05）。可能是由于随提取的进行，多糖几乎被完全提取出来。该结论与冯艳波[26]研究阿拉尔骏枣多糖提取的结论一致。因此，多糖提取最佳时间为40 min。并且由图1可知，提取时间对多糖得率的影响最小，因此，接下来只对超声功率、提取温度和复合酶添加量三个因素进行正交试验。
2.2 超声辅助复合酶法提取五味子多糖正交试验结果
超声辅助复合酶法提取五味子多糖的正交试验设计及结果如表2所示。通过极差大小确定各因素对五味子多糖得率影响的主次顺序为：提取温度（B）>超声功率（A）>复合酶添加量（C）。最优水平组合为A1B1C2，即超声功率为200 W、提取温度为30 ℃、复合酶添加量为0.20%，在上述参数组合下，进行3次平行实验，所得五味子多糖得率为（8.12%±0.10%）。结果说明通过正交试验使得超声辅助复合酶法提取五味子多糖的提取工艺得到优化。采用单一的超声提取和复合酶提取所得多糖得率分别为（5.71%±0.08%）和（6.05%±0.11%）[27-28]。对比结果发现，超声辅助复合酶法提取五味子多糖明显优于单一的超声提取和复合酶提取。
表 2 超声辅助复合酶法提取五味子多糖的L9（34）正交试验设计及结果Table 2. L9(34) orthogonal design and results of ultrasonic assisted enzymatic extraction of polysaccharides from Schisandra chinensis试验号 因素 多糖得率（%） A 超声功率 B 提取温度 C 复合酶添加量 1 1 1 1 7.82±0.13 2 1 2 2 8.06±0.16 3 1 3 3 7.63±0.07 4 2 2 3 7.05±0.09 5 2 3 1 6.97±0.10 6 2 1 2 7.70±0.11 7 3 3 2 7.24±0.09 8 3 1 3 8.12±0.13 9 3 2 1 7.46±0.08 k1 7.83 7.88 7.42 因素主次：
B>A>Ck2 7.24 7.52 7.67 k3 7.61 7.28 7.60 优化方案：A1B1C2 R 0.59 0.60 0.07 2.3 α-葡萄糖苷酶抑制效果
阿卡波糖通常作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的阳性药，为判断五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制效果，本研究选取阿卡波糖为阳性对照，研究不同质量浓度五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制效果。样品对α-葡萄糖苷酶抑制率越大，说明样品降糖活性越好，即α-葡萄糖苷酶抑制率与降糖活性呈正相关。由图2可知，当五味子多糖和阿卡波糖质量浓度在10~50 μg/mL范围内时，随五味子多糖和阿卡波糖质量浓度增加α-葡萄糖苷酶抑制率显著增加（P<0.05）。当五味子多糖和阿卡波糖质量浓度在50 μg/mL时，五味子多糖和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为（75.13%±0.59%）和（70.68%±0.63%）。将上述数据进行非线性拟合可得，五味子多糖和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50分别为27.15 μg/mL和29.63 μg/mL。IC50越低，抑制效果越好。经对比发现，五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制效果明显优于阿卡波糖。表明五味子多糖具有较好的降糖活性。
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图 2 五味子多糖和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响注：不同小写字母表示不同浓度同一样品间差异显著（P<0.05）；不同大写字母表示相同浓度不同样品间差异显著（P<0.05）。Figure 2. Effect of Schisandra chinensis polysaccharide and acarbose on α-glucosidase inhibition rate2.4 五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型判定
为研究五味子多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，探究不同质量浓度五味子多糖存在条件下，α-葡萄糖苷酶催化PNPG水解速率，得到Lineweaver-Burk进行双倒数作图，其结果如图3所示。
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图 3 五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk图Figure 3. Lineweaver-Burk diagram for the inhibition of α-glucosidase by Schisandra chinensis polysaccharide由图3可知，利用不同质量浓度（0、20、50 μg/mL）五味子多糖处理α-葡萄糖苷酶，对所得数据（1/[S]与1/V）进行线性拟合，R2均在0.92以上，说明所得数据拟合较好。分析上述数据可知，随五味子多糖浓度增加米氏常数（Km）增加，最大反应速率（Vm）降低。这种酶抑制类型属于混合型抑制，即竞争性抑制和非竞争性相结合的抑制类型。结果表明五味子多糖与α-葡萄糖苷酶的活性部位发生可逆性结合，从而抑制α-葡萄糖苷酶发挥催化活性。该结论与冯学珍等[29]研究网地藻多糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型相一致。
2.5 荧光光谱分析
不同质量浓度五味子多糖（0~50 μg/mL）对α-葡萄糖苷酶内部荧光强度的影响结果如图4所示。由图4可知，随五味子多糖质量浓度增加α-葡萄糖苷酶内荧光强度逐渐降低，α-葡萄糖苷酶最大波长（339 nm）没有发生移动。结果表明五味子多糖与α-葡萄糖苷酶发生了氢键相互作用，进而使得α-葡萄糖苷酶内部荧光发生猝灭[10]。XUE等[9]研究飞燕草-3-葡萄糖苷对α-葡萄糖苷酶同样得到相似的结论。
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图 4 五味子多糖对α-葡萄糖苷酶荧光强度的影响注：温度条件为 30 ℃。Figure 4. Effect of Schisandra chinensis polysaccharide on fluorescence intensity of α-glucosidase3. 结论
本研究通过正交试验优化超声辅助复合酶提取五味子多糖工艺，得到最优工艺参数为：超声功率200 W、提取温度30 ℃、复合酶添加量0.20%和提取时间40 min。在此条件下，所得五味子多糖得率为（8.12%±0.10%）。此外，研究发现五味子多糖以竞争性与非竞争性相混合的方式抑制α-葡萄糖苷酶活性，同时能引起α-葡萄糖苷酶发生荧光猝灭。研究结果为多糖提取提供一种可行性的提取方式。后续需加强对多糖的分离纯化和结构鉴定等方面的研究，进一步阐明多糖结构和活性之间的关系，为天然降糖药物开发提取物质基础。
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图 1 单因素对五味子多糖得率的影响
注：不同字母表示组间差异显著，P<0.05。
Figure 1. Effect of single factor on polysaccharide yield of Schisandra chinensis
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图 2 五味子多糖和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响
注：不同小写字母表示不同浓度同一样品间差异显著（P<0.05）；不同大写字母表示相同浓度不同样品间差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Effect of Schisandra chinensis polysaccharide and acarbose on α-glucosidase inhibition rate
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图 3 五味子多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk图
Figure 3. Lineweaver-Burk diagram for the inhibition of α-glucosidase by Schisandra chinensis polysaccharide
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图 4 五味子多糖对α-葡萄糖苷酶荧光强度的影响
注：温度条件为 30 ℃。
Figure 4. Effect of Schisandra chinensis polysaccharide on fluorescence intensity of α-glucosidase
表 1 超声辅助复合酶提取五味子多糖的L9（34）正交试验因素及水平
Table 1 L9(34) orthogonal experiment factors and levels of ultrasonic assisted complex enzyme extraction of polysaccharides from Schisandra chinensis
水平 因素 A 超声功率（W） B 提取温度（℃） C 复合酶添加量（%） 1 200 30 0.15 2 300 40 0.20 3 400 50 0.25 
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表 2 超声辅助复合酶法提取五味子多糖的L9（34）正交试验设计及结果
Table 2 L9(34) orthogonal design and results of ultrasonic assisted enzymatic extraction of polysaccharides from Schisandra chinensis
试验号 因素 多糖得率（%） A 超声功率 B 提取温度 C 复合酶添加量 1 1 1 1 7.82±0.13 2 1 2 2 8.06±0.16 3 1 3 3 7.63±0.07 4 2 2 3 7.05±0.09 5 2 3 1 6.97±0.10 6 2 1 2 7.70±0.11 7 3 3 2 7.24±0.09 8 3 1 3 8.12±0.13 9 3 2 1 7.46±0.08 k1 7.83 7.88 7.42 因素主次：
B>A>Ck2 7.24 7.52 7.67 k3 7.61 7.28 7.60 优化方案：A1B1C2 R 0.59 0.60 0.07
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