Study on in Vitro Stability and Antioxidant Activity of ACE Inhibitory Peptide from Gracilaria lemaneiformis
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摘要: 以龙须菜为原料，通过酶解法制备分子量<1 kDa的龙须菜蛋白，分别以冷冻干燥和喷雾干燥收集多肽组分(GLP-F、GLP-S)，研究其在体外环境的活性保留率和抗氧化能力。通过血管紧张素转化酶(Angiotensin Ⅰ converting enzyme, ACE)活性抑制、总抗氧化能力、DPPH·清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力等实验测定多肽抗氧化能力及体外稳定性。结果表明，通过ACE抑制活性为指标，两多肽在ACE抑制活性均有较好的IC50值(0.62、0.70 mg/mL)，金属离子Zn2+和Cu2+促进两个多肽ACE活性的保留，Al3+、K+、Fe3+等离子均能较好保留两多肽的ACE抑制活性，Ca2+的加入则降低了多肽的ACE抑制活性。随着NaCl浓度的升高，GLP-F和GLP-S的ACE抑制活性降低；高糖浓度下GLP-F的ACE抑制活性较好保留，GLP-S的ACE抑制活性显著增加（P<0.05）。GLP-F在强酸强碱环境下ACE抑制活性略降低5%，GLP-S的ACE抑制活性不受酸碱pH环境的影响；在低于40 ℃的温度条件下，GLP-F和GLP-S的ACE抑制活性得到保留。在模拟体外胃肠消化系统可知：GLP-F为前体型抑制肽，GLP-S为真抑制型抑制肽。−20 ℃条件下两者活性都能保持稳定，而GLP-F在4 ℃贮藏至14 d活性保留降至40.67%。体外抗氧化试验表明，GLP-S在总抗氧化能力、DPPH·、·OH和O2−·清除能力方面均优于GLP-F。因此，GLP-F多肽体外降血压活性稳定性上更优于较GLP-S，而GLP-S在抗氧化方面效用高于GLP-F，此为龙须菜多肽开发为天然降血压肽和抗氧化肽提供理论参考。Abstract: Gracilaria lemaneiformis were prepared by enzymatic hydrolysis with molecular weight <1 kDa, collecting peptide components by freeze drying and spray drying, measuring the activity retention rate and antioxidant capacity of ACE inhibitory peptides in the in vitro environment. The antioxidant capacity and in vitro stability of peptides were determined by experiments of inhibition of angiotensin converting enzyme activity, total antioxidant capacity, DPPH· scavenging capacity, hydroxyl free radical scavenging capacity and superoxide anion scavenging capacity. The results showed that by using ACE inhibitory activity as indicators, both had good IC50 values (0.62, 0.70 mg/mL) in ACE inhibitory activity. The addition of metal ions (Zn2+、Cu2+) were both promoted inhibitory activity retention, (Al3+、K+、Fe3+) were retained the ACE inhibitory activity of GLP-F and GLP-S, Ca2+reduced the ACE inhibitory activity of both. With the increase of NaCl concentration, the ACE inhibitory activity was reduced of GLP-F and GLP-S; under high sugar concentration, GLP-F was better retained, and GLP-S activity was significantly increased(P<0.05). With strong acid and alkali, GLP-F activity retention decreased by 5%, GLP-S inhibitory activity remained unchanged with pH 4~10. Below 40 ℃, the ACE inhibitory activity was stabled of GLP-F and GLP-S. Simulation the digestion of gastrointestinal tract, GLP-F belonged to pro-drug type, GLP-S belonged to true inhibitor type. GLP-F and GLP-S suited for storage at −20 °C, GLP-F activity retention decreased to 40.67% stored at 4 ℃ until 14 d. The results of above antioxidant tests indicated that GLP-S had superior in terms of total antioxidant activities, DPPH· free radicals, ·OH and O2−· than GLP-F. Therefore, the stability of GLP-F polypeptide in lowering blood pressure activity in vitro had better than that of GLP-S, and GLP-S had more effective than GLP-F in anti-oxidation. Gracilaria lemaneiformis polypeptide providing theoretical reference for the development of natural antihypertensive peptides and antioxidant peptides.
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Keywords:
- ACE inhibitory peptides /
- stability /
- antioxidant /
- storage /
- Gracilaria lemaneiformis protein /
- anti-hypertension
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血管紧张素转化酶能调节以体循环动脉血压升高为主的高血压疾病。化学合成的ACE抑制剂具有显著的降血压效果，但长期服用容易引起刺激性干咳、轻度肌酐、高钾血症等[1]不良反应，食源性ACE抑制肽因易提取制备、生物活性强等特性受到广泛研究[2]。近年来，食源性ACE抑制肽也逐渐取代高副作用的ACE抑制剂成为治疗高血压疾病的天然合成药物，如在干腌火腿蛋白[3]、扁豆蛋白[4]、大海马蛋白[5]等中分离出ACE抑制肽。龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）是第三大海洋藻类植物，其具有抗氧化、降血压、调节肠道菌群的功能且价格低廉，作为经济价值高的食源性原料具有较高研究意义。
目前，关于ACE抑制肽的报道集中在制备、分离纯化[6]、药效分析[7]、构效关系等[8]的应用研究上，主要通过酸碱提取法、酶解法、微生物发酵法、虚拟筛选等方法制备多肽、利用膜分离技术、凝胶层析、离子交换、方向高效液相法等方法分离纯化，基于动物体内活性和分子对接等技术研究体内药效和体外构效关系。国内外研究人员测定龙须菜酶解液具有降血压、抗氧化[9-10]等活性，但基于龙须菜多肽在分离制备及环境条件对活性影响的研究却鲜有报道。
本文基于前期制备龙须菜酶解液的工艺基础，通过分离不同组分的多肽溶液，利用冷冻干燥和喷雾干燥制备多肽。基于两个不同加工条件得到的多肽均能在工业上实现制备，但未有文章报道不同干燥方法得到的多肽在ACE抑制率上的区别，其在体外ACE抑制活性的稳定性研究也不明确。由于多肽氨基酸结构复杂，在生物活性方面还需进一步研究[11]。因此，本文收集两种干燥方式的多肽组分，研究体外环境对多肽ACE抑制活性保留率的影响和抗氧化活性分析，为进一步开发多功能活性产品及体外动物实验提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
龙须菜（Gracilaria lemaneiformis） 福建环海生物科技股份有限公司；碱性蛋白酶（50 U/mg） 庞博公司；胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（250 U/mg）、血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme, ACE，0.25 U）、马尿酸-组氨酸-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate, HHL）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl, DPPH） Sigma公司；氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙、水杨酸、乙腈、三氟乙酸、邻苯三酚、浓盐酸等 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
Watere 2695型高效液相色谱仪 Alliance公司；M450型酶标仪 BIO-RAD公司；UV-1800型紫外可见光分光光度计 上海美普达公司；LGJ-12型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；B-290型喷雾干燥机 上海沃珑仪器有限公司；HWS-28型恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 龙须菜多肽制备
通过前期对龙须菜酶解工艺的优化，在最适pH8.4，底物浓度18%，温度55 ℃，酶底比2%的条件下碱性蛋白酶酶解3 h。酶解液在水浴锅100 ℃灭酶10 min，在4 ℃、8000 r/min条件下离心20 min，陶瓷膜过滤等一系列步骤后，通过超滤膜收集1 kDa组分以下的混合酶解液，分别通过冷冻干燥在−40 ℃条件下冻干72 h及喷雾干燥在内机温度180 ℃、加样量50%、泵速15%的条件下收集多肽，分别为（Gracilaria lemaneiformis peptides by Freeze Dryer, GLP-F）、（Gracilaria lemaneiformis peptides by Spray Dryer, GLP-S）两个组分。
1.2.2 RP-HPLC法测定ACE抑制活性
根据参考文献[12-13]改进，取100 µL HHL（5 mmol/L含pH8.3的硼酸-硼砂缓冲液）于2 mL离心管，加入100 µL多肽溶液，在37 ℃水浴锅充分预热5 min，加入50 µL ACE酶（50 mU/mL含pH8.3的硼酸硼砂缓冲液）后在37 ℃水浴锅反应1 h，加200 µL的1 mol/L盐酸终止反应，过0.45 µm水系滤膜后，通过固定相为SunFire C18（4.6 mm×250 mm）的色谱条件测定溶液中马尿酸的含量，同时以超纯水为空白对照。
色谱条件参照文献[14]：HPLC系统：HPLC-DAD；色谱柱：SunFire C18分析用色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流速：1 mL/min；检测波长：228 nm；进样量：10 μL；流动相：水:乙腈=68:32。
ACE抑制率({\text{%}})=A−BA×100 式中：A为超纯水中马尿酸峰面积，B为多肽中马尿酸峰面积。
ACE抑制肽活性保留率（\%）=A1/A2×100 式中：A1为多肽反应后ACE抑制率，A2为多肽反应前ACE抑制率。
1.2.3 各因素对ACE体外抑制肽稳定性和抑制活性的影响
1.2.3.1 龙须菜多肽ACE抑制活性测定
将龙须菜GLP-F和GLP-S两组分配制成0.25、0.5、1、1.5、2、3、4 mg/mL不同浓度梯度的ACE抑制肽进行活性测定，半数抑制浓度（IC50）为抑制50%所需的多肽浓度。
1.2.3.2 金属离子对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
参考文献[15]取0.5 mL（质量浓度2 mg/mL）的龙须菜GLP-F和GLP-S，分别加入0.5 mL（质量浓度5 mmol/L）CaCl2·2H2O、CuCl2·2H2O、Al（OH）3、ZnSO4·7H2O、KOH、FeCl3·6H2O、MgSO4·7H2O及NaCl金属离子溶液，在37 ℃水浴2 h后，测定多肽活性保留率，同时对照组为不加金属离子的溶液。
1.2.3.3 NaCl和葡萄糖对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
参考文献[15]将0.5 mL（质量浓度2 mg/mL）的龙须菜GLP-F和GLP-S，分别加入等量的1%、4%、7%、10%、13%质量浓度的NaCl溶液，以相同浓度配制葡萄糖溶液，并加入等体积多肽，在100 ℃水浴中恒温振荡20 min后放置室温，测定多肽活性保留率。
1.2.3.4 温度和pH对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
参考文献[15]将2 mL（质量浓度2 mg/mL）的龙须菜GLP-F和GLP-S各分成2份，1份置于20、40、60、80及100 ℃的水浴中反应2 h后放置室温，另1份用0.1 moL/L的HCl和0.1 moL/L NaOH调节pH至4.0、5.5、7.0、8.5、10.0，在37 ℃水浴反应3 h后，分别测定多肽活性保留率。
1.2.3.5 胃蛋白酶消化实验对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
参照文献[16]模拟胃消化道的消化实验稍加修改，分别取400 µL（质量浓度2 mg/mL）的龙须菜GLP-F和GLP-S，3600 µL人工胃液（取16.4 mL的稀盐酸内含9.5%~10.5%的浓盐酸，加入10.0 g胃蛋白酶用蒸馏水定容至1.0 L）在37 ℃水浴反应，分别在0、30、60、90、120 min取样一次，加0.1 moL/L NaOH调pH7.0，沸水浴中灭活10 min，测定多肽活性保留率。
1.2.3.6 胰蛋白酶消化实验
参照文献[16]模拟肠消化道的消化实验稍加修改，分别取400 µL（质量浓度2 mg/mL）的龙须菜GLP-F和GLP-S，3600 µL人工肠液（取6.8 g磷酸二氢钾，溶解于500 mL蒸馏水用0.1 moL/L NaOH调节pH6.8；称10.0 g胰蛋白酶，溶于200 mL蒸馏水，混合定容至1.0 L）在37 ℃水浴反应，分别在0、1、2、3、4、5、6 h取样一次，在沸水浴中灭活10 min，测定多肽活性保留率。
1.2.3.7 贮藏时间对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
将质量浓度2 mg/mL的龙须菜多肽GLP-F和GLP-S存放在4 ℃冰箱，共测定前7 d及第14 d的多肽活性保留率；将质量浓度2 mg/mL的龙须菜GLP-F和GLP-S存放在−20 ℃冰箱保存28 d，间隔7 d测定一次多肽活性保留率。
1.2.4 抗氧化能力测定
1.2.4.1 总抗氧化能力测定
总抗氧化能力（Totalantioxidantcapacity, T-AOC），根据南京建成生物工程研究所试剂盒的T-AOC比色法，参照文献总抗氧化能力的测定方法[17]。
1.2.4.2 DPPH自由基清除能力测定
DPPH自由基清除能力，参照文献[18]分别配制0.1、2、4、8、12、16、20 mg/mL不同浓度不同组分的多肽溶液1 mL，加入4 mL的DPPH溶液，避光条件下静置30 min，在λ=517 nm处测定吸光值；以超纯水代替多肽溶液进行试验；同理用无水乙醇代替DPPH测定吸光值；以同等浓度的VC做阳性对照，利用公式得：
DPPH自由基清除率(%)=[1−(A−BC)]×100 式中：A为多肽+DPPH的反应体系；B为多肽+无水乙醇的反应体系；C为超纯水+DPPH 的反应体系。
1.2.4.3 羟自由基清除能力测定
羟自由基（·OH）清除能力参照文献[18]，分别配制0.05、1、2、4、8、12、16 mg/mL不同浓度不同组分的多肽溶液1 mL，依次加入0.5 mL硫酸亚铁、0.5 mL水杨酸-无水乙醇溶液、0.5 mL H2O2，在37 ℃条件下反应20 min，在λ=510 nm处测吸光值，以同等VC做阳性对照，根据公式求·OH清除率。
羟自由基清除率(%)=[1−(A−BC)]×100 式中：A为样品组分吸光值；B为超纯水替代H2O2；C为超纯水替代样品组分的吸光值。
1.2.4.4 超氧阴离子自由基清除能力测定
超氧阴离子自由基（O2−·）清除能力参照文献[19]，分别配制0.25、4、8、12、16、20、24 mg/mL不同浓度不同组分的多肽溶液，取1.8 mL多肽溶于Tris缓冲液，在25 ℃水浴锅反应15 min，再加入0.125 mL的邻苯三酚溶液混匀，每隔30 s在λ=325 nm下测定一次吸光值，并计算自氧化速率，同样以超纯水代替邻苯三酚做空白实验，根据公式求O2−·清除率。
超氧阴离子自由基(%)=[1−(AB)]×100 式中：A为样品组的自氧化速率；B为对照组的自氧化速率。
1.3 数据处理
数据以
¯x ±SD（N=3）表示，采用SPSS Statistics软件进行统计分析。多组均数进行相关性分析、方差齐性检验和单因素方差分析（ANOVA）和多重比较（Duncan’s法），P<0.05，差异显著。2. 结果与分析
2.1 多肽的ACE抑制活性
通过冷冻干燥和喷雾干燥得到的多肽粉末颗粒均匀，具有可溶解性。喷雾干燥的多肽溶解后溶液颜色更深，冷冻干燥的多肽溶液较浅，喷雾干燥的高度浓缩是造成颜色差异的主要原因。图1可知随着质量浓度的增加，ACE抑制率逐渐增大，GLP-F的IC50为0.618 mg/mL优于GLP-S的IC50的0.702 mg/mL，造成两者IC50不一致的原因可能是喷雾干燥的高温反应破坏蛋白结构，分解成更多氨基酸残基。
2.2 各因素对龙须菜多肽ACE抑制活性的影响
2.2.1 金属离子对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
金属离子对GLP-F和GLP-S多肽活性保留率的影响如表1所示，加入不同金属离子后的活性都有相对应的变化。GLP-F与GLP-S抑制肽的活性变化较为稳定，与对照组相比，除了Zn2+和Cu2+对多肽是促进作用外，其他离子的活性保留率变化幅度均在±15%之内，说明Zn2+和Cu2+显著促进多肽活性的保留（P<0.05），而其他离子的加入不会破坏多肽的结构。因为在GLP-F和GLP-S抑制肽的作用下，Zn2+作为ACE酶催化作用的活性中心，可能抑制酶的活性位点，导致ACE抑制率增加。在GLP-F抑制肽中，当Fe3+存在时，体系降低ACE活性，提高ACE抑制率，增加多肽活性的保留，而加入含有Ca2+、Al3+、K+、Mg2+和Na+等金属盐溶液时，ACE活性保留率降低，对多肽活性稳定性起抑制作用。对于GLP-S抑制肽而言，Al3+、K+和Fe3+的加入对活性影响不大，而Ca2+、Mg2+和Na+与抑制肽反应产生抑制效应，多肽活性降低保留率下降。赵玉菲等[5]的研究表明，Al3+、K+对大海马PH-I3抑制肽活性略有抑制作用，与本研究结果一致。
表 1 金属离子对GLP-F和GLP-S的ACE抑制活性的影响Table 1. The influence of mental ion on ACE inhibition activity of GLP-F and GLP-S金属离子 活性保留率（%） GLP-F GLP-S 对照 97.87±1.15d 98.14±2.30c Ca2+ 83.85±0.89g 83.90±2.14d Cu2+ 143.02±0.15b 153.56±1.86a Al3+ 84.74±0.17g 96.72±1.89c Zn2+ 144.44±0.27a 156.32±2.02a K+ 88.46±0.20ef 100.69±1.57bc Fe3+ 108.38±0.19c 102.83±1.55b Mg2+ 89.71±0.20e 83.20±2.06d Na+ 87.45±0.15f 86.65±0.41d 注：同列不同字母表示显著性差异（P<0.05）。 2.2.2 葡萄糖和NaCl对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
如图2（A）所示，GLP-F抑制肽在耐糖性方面较稳定，随着葡萄糖浓度的增加，基本维持在85%~95%活性保留率，ACE抑制率不受糖浓度的影响；而GLP-S多肽活性保留率随着葡萄糖浓度的增加而增大，浓度越高差异越显著（P<0.05），可能是因为龙须菜抑制肽在高温喷雾和高糖浓度条件下发挥协同效应，使氨基酸结构分解成更有活性的肽段，造成ACE抑制活性增强。由图2（B）所示，不同浓度条件下的NaCl溶液对GLP-F和GLP-S多肽活性保留率都随浓度的增加而减少，其原因是Na+离子溶液本身就会抑制多肽的活性，浓度越高越不利于活性保留[5]，进一步说明抑制肽在越稀浓度下ACE抑制活越强，且GLP-F整体活性保留率趋势要优于GLP-S。
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图 2 食品配料对龙须菜多肽ACE抑制活性的影响注：图2中的A为不同葡萄糖浓度对ACE抑制活性保留率的影响；B为不同NaCl浓度对ACE抑制活性保留率的影响；图中不同小写字母表示差异显著P<0.05，图3~图5同。Figure 2. The influence of food ingredients on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis2.2.3 温度和pH对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
在食品加工过程中，功能性食品同样易受温度和pH两大因素的影响。热稳定性对抑制肽的影响如图3（A）所示，GLP-F和GLP-S抑制肽在40~100 ℃之间，活性保留率逐渐减小，变化幅度在振幅±5%之内，说明温度对多肽的稳定性影响不明显。GLP-F和GLP-S多肽活性保留率在温度低于40 ℃的条件下较稳定，更有利于食品低温贮藏及加工，LI等[20]进一步解释了黑豆ACE肽在40 ℃以下具有较好的稳定性。MIRZAEI等[21]研究从酵母蛋白酶解物纯化的VLSTSFPPK也在40 ℃以下具有较好的稳定性。图3（B）则为pH对多肽活性保留率的影响，GLP-S抑制肽保留率的稳定性略优于GLP-F抑制肽，两者ACE抑制活性变化显著，抑制肽在任何酸碱性条件下都不会破坏氨基酸序列，且两者活性在pH7.0时保留率稳定在85%左右。
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图 3 温度和pH对龙须菜ACE抑制活性的影响注：图3中的A为不同温度条件对ACE抑制活性保留率的影响；B为不同pH条件对ACE抑制活性保留率的影响。Figure 3. The influence of temperature and pH on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis2.2.4 模拟人工胃肠消化系统对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
多肽能否在人体消化吸收，关键在于肠胃道的消化稳定性[22]，GLP-F和GLP-S抑制肽经人工胃液消化模拟后，其活性保留率如图4（A）所示，反应初期可能是胃酸与抑制肽的协同效应导致ACE抑制率较高。随着消化反应的延长，GLP-F抑制肽在胃消化系统稳定性较好，与刘文颖等[23]研究的乳清低聚肽的消化稳定性结果保持一致。胃蛋白酶切断抑制肽的肽链，ACE抑制活性逐渐升高，均能高达120%的活性保留率。因此，抑制肽在胃部中不容易被消化，反而更多活性成分得以保留。图4（B）为人工肠液对抑制肽的影响，GLP-S活性保留较稳定，抑制肽在消化6 h过程中仍维持90%的活性保留率，与CHIRINOS等[24]研究的藜麦多肽在胃肠消化道下，ACE抑制活性能稳定保留的结果相一致。GLP-F抑制肽经胰蛋白酶的1 h消化后ACE抑制率降低，1~5 h期间ACE抑制率升高，说明抑制肽的活性组分能抵抗胰蛋白酶的降解，活性保留率也逐渐升高。ACE抑制肽根据消化稳定性[25-26]：分成ACE抑制活性不受肠道酶影响的真抑制型，ACE抑制活性降低的底物型和短肽ACE抑制活性明显增加的前体型。因此，GLP-F为前体型抑制肽，GLP-S为真抑制型抑制肽。
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图 4 人工胃液和人工肠液对龙须菜ACE抑制活性保留率的影响注：图4中的A为胃消化时间对ACE抑制活性保留率的影响；B为肠消化时间对ACE抑制活性保留率的影响。Figure 4. The influence of artificial gastric juice and intestinal fluid on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis2.2.5 贮藏时间和冻结时间对GLP-F和GLP-S活性保留率的影响
绝大多数食品都会开发成具有生物活性的功能产品，贮藏环境会对生物活性产生较大影响。本实验将探讨4 ℃和−20 ℃条件下贮藏多肽对活性保留率的影响，结果如图5（A）。GLP-F活性在贮藏前5 d较好保留，第6 d后活性显著下降（P<0.05），第7 d的保留率为66.64%，第14 d仅剩40.67%的活性保留率。GLP-S活性在贮藏前7 d活性基本不变，第14 d仍保留83.63%的多肽活性。两抑制肽表现出相似的活性保留趋势，但GLP-F抑制肽难以保留的原因之一是氨基酸短肽链在4 ℃条件下易失活变性。GLP-F和GLP-S抑制肽在−20 ℃冻结下的活性保留率结果如图5（B），在0~28 d冻结条件下，两者降压活性都稳定保留，冻结状态下的多肽链不会断裂失活。因此，在冻结条件下贮藏产品更能延长多肽保留率，发挥药用价值。
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图 5 贮藏时间和冻结时间对龙须菜ACE抑制活性保留率的影响注：图5中的A为贮藏时间对ACE抑制活性保留率的影响；B为冻结时间对ACE抑制活性保留率的影响。Figure 5. The influence of artificial storage time and freezing time on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis2.3 龙须菜多肽抗氧化能力分析
人与外界环境的接触容易在体内产生氧自由基、活性氧和非氧自由基等，堆积过量的自由基容易导致多种生理疾病。因此，具有抗氧化效用的物质不仅有清除自由基的能力，且对生物基团的氧化存在抑制作用。大量研究报道多肽具有多种生物活性[27]。因此，本文以ACE抑制肽为测定，以总抗氧化能力，清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子能力等4种指标，并分析GLP-F和GLP-S抑制多肽的体外抗氧化活性，以抗坏血酸VC作为阳性对照。
2.3.1 GLP-F和GLP-S的总抗氧化能力
若多肽本身含有抗氧化物质，可使Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与菲啉类形成稳定的络合物，通过比色法推断其总抗氧化能力。图6显示GLP-F和GLP-S多肽的总抗氧化能力。VC 在0.125 mg/mL时的总抗氧化能力为50 U/mL，随着浓度逐渐增加，总抗氧化能力越大，在0.2 mg/mL时高达225 U/mL。GLP-F和GLP-S两者的总抗氧化能力也随着质量浓度逐渐增加，说明两多肽都含抗氧化的活性成分，GLP-S抗氧化能力要优于GLP-F多肽活性，这可能与干燥方式有关。
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图 6 质量浓度对龙须菜多肽的总抗氧化能力的影响Figure 6. The effect of mass concentration on the total antioxidant capacity of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis2.3.2 GLP-F和GLP-S对DPPH自由基的清除能力
在517 nm强吸收峰波长下，若多肽有自由基清除能力，可配对DPPH含有的单电子，使其吸收值减小[28]。由图7结果得，GLP-F和GLP-S多肽的DPPH自由基清除能力均随着多肽质量浓度的增加而增加。对于GLP-S而言，浓度在0.6~2 mg/mL时，清除DPPH自由基能力从12.38%升至59.68%，GLP-F多肽在8 mg/mL时，清除能力才达到67.5%。GLP-F和GLP-S的DPPH自由基清除能力非线性拟合曲线方程为y=28.70 ln（x+0.33）−0.21，R2=0.9777；y=9.71 ln（x−0.58）+54.80，R2=0.9692，根据方程计算IC50分别为5.72、1.91 mg/mL。结果表明GLP-S清除DPPH自由基能力远优于GLP-F。
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图 7 质量浓度对龙须菜多肽的DPPH自由基清除率的影响Figure 7. The effect of mass concentration on the DPPH clearance rate of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis2.3.3 GLP-F和GLP-S对·OH的清除能力
Fenton反应生成的·OH自由基，后者与水杨酸形成紫红色物质，通过加入多肽自由基清除剂呈现显色的变化用以评价多肽的清除能力[29]。从图8可以得出，GLP-F和GLP-S多肽均有清除·OH能力，随着浓度增加，清除能力显著提高，在4 mg/mL时GLP-S、GLP-F羟自由基清除率分别高达90%、60.78%。GLP-F和GLP-S的羟自由基清除能力非线性拟合曲线方程为y=28.59 ln（x+0.35）+15.36，R2=0.9839；y=20.30 ln（x−0.10）+49.73，R2=0.9497，根据方程计算IC50分别为2.82、1.09 mg/mL。结果表明GLP-S清除羟自由基能力好于GLP-F。
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图 8 质量浓度对龙须菜多肽的羟自由基清除率的影响Figure 8. The effect of mass concentration on the scavenging rate of hydroxyl radicals of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis2.3.4 GLP-F和GLP-S对O2−·的清除能力
邻苯三酚在弱碱性条件下易发生自氧化反应，生成有色的中间产物和O2−·自由基，通过加入抗氧化剂来清除O2−·，抑制自氧化速率[30]。由图9可知，质量浓度大于20 mg/mL时，GLP-F和GLP-S多肽才有明显的清除O2−·的能力，在低浓度下清除O2−·能力不明显，可能是由于多肽链中清除O2−·能力的活性残基较少。GLP-F和GLP-S的超氧阴离子清除能力非线性拟合曲线方程为y=70.66 ln（x+12.05）−179.12，R2=0.9849；y=200.01 ln（x+60.57）−831.91，R2=0.9834，根据方程计算IC50分别为21.21、12.72 mg/mL。结果表明GLP-S清除超氧阴离子能力好于GLP-F，但相比较清除DPPH和·OH自由基能力而言，GLP-F和GLP-S在清除O2−·的清除能力较差。
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图 9 质量浓度对龙须菜多肽的超氧阴离子清除率的影响Figure 9. The effect of mass concentration on the superoxide anion scavenging rate of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis3. 结论
本文采用冷冻干燥和喷雾干燥的方式处理龙须菜多肽，通过对比分析ACE抑制活性的稳定性和抗氧化能力研究其不同干燥方式对多肽的影响。结果表明：两种形式的多肽均有较好的ACE抑制率和抗氧化能力，具有开发成ACE抑制肽和抗氧化肽的潜能。GLP-F抑制肽在葡萄糖溶液和胃消化系统下活性保留较稳定，Ca2+、Al3+、K+、Mg2+、Na+等金属离子溶液虽然对其有影响，但活性均能能较好保留，高温条件下活性变化较大，在肠消化体系中增加了产物的ACE抑制活性，不利于在4 ℃和高碱环境下的贮藏保留，在−20 ℃有利于保存活性。GLP-S抑制肽活性在Al3+、K+、Fe3+等金属离子溶液中和4 ℃低温贮藏条件下保留稳定且不受酸碱pH条件的影响，在高糖浓度下产生更多活性短肽起促进作用，但随NaCl浓度升高而活性降低，在−20 ℃能保持1个月不变性。GLP-S的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力虽不及VC的抗氧化活性，但均优于GLP-F。综上，1 kDa分子量的龙须菜多肽含有降血压和抗氧化等多种生物活性，GLP-F在NaCl溶液和肠消化模拟体系中表现出的较高的ACE抑制活性保留率，有利于后续开展动物实验；GLP-S体现的高抗氧化活性，有利于开发成抗氧化抑制肽，因此研究两种多肽的ACE抑制活性稳定性和抗氧化能力能够为开发多肽口服液提供技术支撑，也为深入研究多肽的纯化鉴定活性序列提供一定的理论指导。
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图 2 食品配料对龙须菜多肽ACE抑制活性的影响
注：图2中的A为不同葡萄糖浓度对ACE抑制活性保留率的影响；B为不同NaCl浓度对ACE抑制活性保留率的影响；图中不同小写字母表示差异显著P<0.05，图3~图5同。
Figure 2. The influence of food ingredients on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis
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图 3 温度和pH对龙须菜ACE抑制活性的影响
注：图3中的A为不同温度条件对ACE抑制活性保留率的影响；B为不同pH条件对ACE抑制活性保留率的影响。
Figure 3. The influence of temperature and pH on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis
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图 4 人工胃液和人工肠液对龙须菜ACE抑制活性保留率的影响
注：图4中的A为胃消化时间对ACE抑制活性保留率的影响；B为肠消化时间对ACE抑制活性保留率的影响。
Figure 4. The influence of artificial gastric juice and intestinal fluid on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis
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图 5 贮藏时间和冻结时间对龙须菜ACE抑制活性保留率的影响
注：图5中的A为贮藏时间对ACE抑制活性保留率的影响；B为冻结时间对ACE抑制活性保留率的影响。
Figure 5. The influence of artificial storage time and freezing time on ACE inhibitory activity retention of Gracilaria lemaneiformis
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图 6 质量浓度对龙须菜多肽的总抗氧化能力的影响
Figure 6. The effect of mass concentration on the total antioxidant capacity of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis
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图 7 质量浓度对龙须菜多肽的DPPH自由基清除率的影响
Figure 7. The effect of mass concentration on the DPPH clearance rate of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis
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图 8 质量浓度对龙须菜多肽的羟自由基清除率的影响
Figure 8. The effect of mass concentration on the scavenging rate of hydroxyl radicals of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis
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图 9 质量浓度对龙须菜多肽的超氧阴离子清除率的影响
Figure 9. The effect of mass concentration on the superoxide anion scavenging rate of polypeptide form Gracilaria lemaneiformis
表 1 金属离子对GLP-F和GLP-S的ACE抑制活性的影响
Table 1 The influence of mental ion on ACE inhibition activity of GLP-F and GLP-S
金属离子 活性保留率（%） GLP-F GLP-S 对照 97.87±1.15d 98.14±2.30c Ca2+ 83.85±0.89g 83.90±2.14d Cu2+ 143.02±0.15b 153.56±1.86a Al3+ 84.74±0.17g 96.72±1.89c Zn2+ 144.44±0.27a 156.32±2.02a K+ 88.46±0.20ef 100.69±1.57bc Fe3+ 108.38±0.19c 102.83±1.55b Mg2+ 89.71±0.20e 83.20±2.06d Na+ 87.45±0.15f 86.65±0.41d 注：同列不同字母表示显著性差异（P<0.05）。 
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