Analysis of Volatile Flavor Components of Virgin Coconut Oil during Normal Temperature Storage based on HS-SPME-GC-MS and Multivariate Statistical Analysis
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摘要: 为了研究初榨椰子油常温储藏过程的挥发性风味成分变化规律，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)技术对不同氧化时期的初榨椰子油进行了分析。结果表明：共鉴定出40种挥发性成分（8个共有组分），主要包括酯类、醛类、酮类和酸类。相对气味活度值（Relative odor activity value，ROAV）分析表明己醛、2-庚酮、丁位己内酯、壬醛、辛酸乙酯、丁位辛内酯、2-十一酮、癸酸乙酯、丁位癸内酯等是初榨椰子油常温储藏过程中关键风味物质。结合主成分分析（principal component analysis，PCA）及偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）建立了初榨椰子油不同储藏时期的判别模型，表明除不同类别化合物（酮类化合物、酯类化合物和酸类化合物）的含量可以作为简单区分初榨椰子油储藏期的指标以外，至少六种关键挥发性成分（2-庚酮、2-己酮、丁位己内酯、己醛、己酸、丁位辛内酯）也可用于评估初榨椰子油的氧化情况。相关研究为初榨椰子油风味品质评价及氧化程度提供了理论参考，研究结果也有助于开发一种鉴别不同新鲜程度椰子油品的新方法。
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关键词:
- 初榨椰子油 /
- 风味成分 /
- 贮藏 /
- 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法 /
- 主成分分析
Abstract: In order to study the variation of volatile flavor components of virgin coconut oil during storage at room temperature. Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) was used to analyze virgin coconut oil in different oxidation stages. The results showed that 40 kinds of volatile components (8 common components) were identified, mainly including esters, aldehydes, ketones and acids. Relative odor activity value (ROAV) analysis showed that hexanal, 2-heptanone, δ-hexanolactone, nonanal, ethyl octanoate, δ-octalactone, 2-undecone, ethyl caprate and δ-decalactone were the key flavor substances in the storage process of virgin coconut oil at normal temperature. Combining principal component analysis (PCA) and partial least squares discrimination analysis (PLS-DA), a discriminant model for different storage periods of virgin coconut oil was established, which showed that in addition to the contents of different compounds (ketones, esters and acids) could be used as indicators to simply distinguish the storage period of virgin coconut oil, at least six key volatile components (2-heptanone, 2-hexanone, δ-hexanolactone, hexanal, caproic acid and δ-octalactone) could also be used to evaluate the oxidation of virgin coconut oil. Related research provided theoretical reference for the evaluation of virgin coconut oil flavor quality and degree of oxidation, and the findings would be conducive to the development of a new method for the identification of virgin coconut oil products with different degrees of freshness. -
椰子主要分布在热带或亚热带沿海地区，是与茶、橄榄和棕榈并列的四大木本油料植物之一[1]。椰子油（Coconut oil，CO）作为椰子的主要成分，其通常分为两大类：初榨椰子油（Virgin coconut oil, VCO）和精制椰子油（Refined, bleached, deodorized coconut oil, RBD）。VCO是通过机械或自然过程从新鲜成熟的椰子肉中获得的，无需任何精炼步骤，从而保留了椰子的各种自然特性[2]和更多的生物活性成分[3]，赋予其更多的生理功能[4]。此外，由于富含天然挥发性化合物，VCO味道清香与牛奶相似，受到广大消费者的青睐。
VCO储藏过程中受温度、光照、空气和金属离子等影响，在存放初期也会产生令人不愉悦的气滋味而影响消费者的食用喜好，并对油品质产生一定的影响。脂质氧化酸败过程中，除了导致脂肪酸和微量有益成分含量减少、营养品质下降外[5]，在氧化中后期还会产生一系列有害成分，包括氢过氧化物等初级氧化产物和小分子的醛、酮、烷烃和烯醛等一些主要的挥发性次级氧化产物[6]，对食用油的气味具有重要影响作用。挥发性成分组成与含量的不同，将导致油脂风味特性出现差异，新鲜油整体呈一定的香气，氧化油脂则呈现一定的酸败味[7-8]。
目前，气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）被广泛应用于食品挥发性成分分析的检测，具有所需样品少、分析速度快、灵敏度高等特性，并可以检测出特定的风味化合物。杨朝晖等[9]采用SPME-GC-MS（Solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry） 技术分析核桃油氧化的挥发性成分，己醛、正戊醇、戊醛和壬醛为主要的风味物质，戊醛含量随着油脂氧化程度成正比。Escuderos 等[10]采取HS-SPME-GC-MS 方法对初榨橄榄油 100 ℃下加速氧化 33 h 期间壬醛含量的变化进行研究，发现壬醛可作为评价初榨橄榄油氧化程度的评价指标。Petersen等[11]采用顶空固相微萃取气相色谱法（HS-SPME-GC）对热应激常规油和高油酸向日葵（HOSF）油样品在80 ℃下加速储存14 d中选择了六种挥发性化合物作为评估向日葵油（SF）和HOSF油脂质氧化的标记化合物。有研究表明[12]，油在室温下的氧化过程与在较高温度下引起的加速氧化过程存在差异，且目前国内外对椰子油常温氧化过程的相关研究并不多见，关于VCO在常温储藏过程中的风味物质的变化情况还未见报道。
为了探究VCO在储藏过程中挥发性成分的变化规律及其对油脂氧化过程中风味的影响，本研究采用顶空固相微萃取技术（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，利用相对活度气味值（Relative Odor Activity Value, ROAV）法并结合主成分分析（principal component analysis, PCA）及偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis, PLS-DA ），以期确定常温氧化过程中VCO的主体挥发性风味成分，探讨不同常温贮藏期风味成分的变化趋势，为科学控制油脂氧化酸败，提高VCO氧化过程中的品质提供理论及数据参考。本研究也为开发VCO氧化程度鉴别技术提供了潜在的方法和进一步的数据支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
原料 新鲜椰蓉（含水量3%），以及多年常温保存的不同时期VCO样品由海口植之素生物资源研究所有限公司提供。
SUN螺旋榨油机 广州市扬光机械设备有限公司； 7890B 气相色谱质谱联用仪 美国Agilent公司；1cm × 65 µm PDMS萃取头 Supelco USA。
1.2 实验方法
1.2.1 椰子油制备及准备
采用螺旋榨油机在室温下榨取，过滤即可得VCO，于室温自然光下贮藏并定期取样分析。VCO样品储藏期共计六年。本实验主要分析测定的VCO样品共计13组，取样的8个时期展开如下：新鲜（0 d：1号）、半个月（15 d：2-1、2-2号）、半年（6 m：3-1、3-2、3-3号）、一年半（18 m：4-1、4-2、4-3号）、两年半（30 m：5号）、三年半（42 m：6号）、四年半（54 m：7号）、五年半（66 m：8号）。其中2号有两组、3号和4号各有三组同一储藏时的不同样品，其中4号样品处于市售VCO的保质期，实验测定均平行 3 次。
1.2.2 椰子油挥发性成分HS-SPME-GC-MS检测
HS-SPME条件：参考Chang等[13]的方法，使用固相微萃取装置（Supelco，Bellefonte，PA，USA）结合聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯纤维（长度 1 cm × 65 µm 膜厚）。将 5 g 油加入一个 20 mL 玻璃小瓶中，该小瓶带有磁性螺旋盖和聚四氟乙烯内衬橡胶隔垫。在充分搅拌下让样品在 55 ℃下平衡 10 min后，通过将带有纤维的手动 SPME 支架插入小瓶中，在 55 ℃下萃取挥发物 30 min。随后，通过将光纤置于气相色谱仪入口，以不分流模式在 250 ℃下进行 3 min的热解吸，以实现所有分析物的热解吸。
GC条件：HP-5MS 弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm），进样口温度：200 ℃，以氦气为载气，载气流速：1.00 mL/min，色谱柱升温程序：起始温度 40 ℃，以 5 ℃/min 升至 300 ℃；进样方式为不分流进样。
MS条件：采用EI离子化方式，离子源温度230 ℃，电子能量 70 eV，质量扫描范围29~500 m/z。
1.2.3 化合物识别
人工解析图谱，将获得的质谱与NIST谱库检索匹配，进行化合物鉴定。仅选匹配度大于80%（最大为100）的鉴定结果，并与其他参考文献[13-14]进行对比分析，采用面积归一化法得到各挥发性成分的相对含量。
1.2.4 主体风味成分评价方法
基于相对气味活度值（ROAV 法）评价各挥发性成分在VCO的氧化阶段对其整体气味的贡献[15]，当ROAV≥1时，该物质可能对食品风味的贡献和影响较大，为所测样品的主体挥发性成分；0.1≤ROAV<1的组分对所测样品的总体风味起重要修饰作用[16-17]；ROAV<0.1，表明该物质对总体风味无实质性贡献，一般认为，ROAV 越大则说明该组分对样品总体风味的贡献越大。
1.3 数据处理
平行实验数据均表示为平均值，采用Microsoft Office Excel 2016进行原始数据处理；SPSS Statistics 23、Origin 9.1、TB tools、Metabo Analyst 5.0进行作图及相关分析，其中使用TB tools软件绘制聚类热图，Metabo Analyst 5.0软件用于PCA和PLS-DA。
2. 结果与分析
2.1 储藏期间初榨椰子油挥发性风味成分解析
通过HS-SPME-GC-MS检测，VCO在室温储藏过程中共检测到40种主要的挥发性成分（8个共有组分），包括酯类6种、醛类8 种、酮类 5种、酸类4种、醇类3种、烃类 4 种。其中在储藏期为0 d、15 d、6 m、18 m、30 m、42 m、54 m和66 m，VCO分别有16、20、23、18、17、26、24和20种主要的挥发性成分。在VCO氧化过程中，受光、热、氧等的影响，所产生的氢过氧化物易发生复杂的裂解和相互作用，生成醛、酮、酸等物质，这些小分子氧化挥发物影响着油脂的整体风味[5-6]。有研究表明，油脂氧化过程中产生具有基因毒性及细胞毒性的α/β不饱和醛类化合物，对人体健康产生危害[18]。如表1所示，分析可知酯类化合物是VCO整个储藏过程中挥发性风味成分的重要组成部分，相对含量在27.29%~75.28%之间。此外，酮类化合物含量在6 m时达到最大（44.24%），成为此时期最主要的挥发性组分；酸类化合物先降低至消失（18 m）后又逐渐增大，成为含量最大的挥发性组分（30 m以后均达到50%以上），醛类化合物含量则在42 m时达到最大（8.09%）。由此可见，在VCO的氧化过程中产生的主要挥发物类别及含量存在显著差异。
表 1 VCO储藏过程中挥发性风味成分比较Table 1. Comparison of volatile flavor components of virgin coconut oil during storage分类 0 d 15 d 6 m 18 m 30 m 42 m 54 m 66 m 种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）醇类化合物 1 28.91 2 27.57 3 16.75 1 6.86 1 1.47 3 7.68 1 3.06 − − 酯类化合物 10 49.79 11 49.25 12 35.10 11 75.28 10 34.46 11 27.29 10 30.83 10 39.51 醛类化合物 1 2.55 1 0.84 1 0.80 1 0.79 2 3.25 6 8.09 6 3.64 3 3.17 酮类化合物 1 1.38 2 18.01 4 44.24 3 15.57 1 1.80 2 1.30 2 0.69 4 5.98 酸类化合物 2 15.33 2 3.34 2 2.57 − − 2 50.56 4 51.45 3 58.50 3 50.90 烃类化合物 1 0.37 2 0.94 1 0.09 2 0.27 1 0.11 1 3.80 2 2.48 − − 注：“−”表示未检出。 图1 是VCO储藏过程中挥发性风味成分总含量分布热图。热图能够将 GC-MS 分析得到的挥发性风味成分数据可视化[19]，图1中红色代表同种物质在某一样品中的含量高，蓝色则代表该物质在对应样品中的含量低[20]，可以看出，长达六年的储藏期间VCO特征风味成分的含量有明显变化趋势，且存在明显差异。新鲜VCO中丁位辛内酯、丁位癸内酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、壬醛等挥发性风味成分的含量相对较高；2-庚酮在短时期内从无到有且快速增加，六个月（6 m）后成为最大的挥发性风味成分。己酮、2-十一酮、丁位己内酯、丁位辛内酯、辛酸甲酯、丁位癸内酯在一年半（18 m：市售油保质期）时的含量均达到最高，值得注意的是此时己酸、辛酸未检出，推测己酸可能转化为丁位己内酯和己酮；辛酸可能向丁位辛内酯、辛酸甲酯等转化。己酸和辛酸在储藏过程中有着先减小后增大的变化趋势，在两年半（30 m）和三年半（42 m）时分别成为最主要的挥发性风味成分，对椰子油风味有着重要的影响。
2.2 不同类别化合物的含量与储藏期关联分析
PCA 分析利用降维思想，在损失很少信息的前提下将原来的众多变量通过降低数据维数、除噪转化为几个综合指标用于反映原来变量的信息，具有更优越的性能[21-22]。为进一步明确不同类别化合物的含量与储藏期的相关性，结合HS-SPME-GC-MS的相关数据（表1），采用 Metabo Analyst 进行分析，绘制样品PCA得分图（图2a）。由图2a可知，可将不同时期的VCO样品分为四组：A组：半月之内；B组：半年左右；C组：一年半左右；D组：两年半至五年半。且各组之间分离分类的效果较好，无重叠区域，表明室温储藏的自然氧化过程明显改变了VCO中各挥发性组分的含量。PCA载荷图如图2b所示，载荷反应了PCA中各变量与主成分之间的关系，由酯类化合物、酸类化合物和酮类化合物所处分布区域可知这三类化合物的含量可以为简单区分不同储藏期的VCO提供参考。图2c中PLS-DA模型获得的3D得分图结果与PCA分布相似，VCO样品被有效分为四类。图2d是PLS-DA的模型参数，以验证模型的有效性。模型参数第三组分的准确度值、R2值接近于1，Q2 >0.9，表明模型具有较高的预测能力。
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图 2 VCO氧化过程中挥发物类别含量的多元分析注：a和b：PCA的2D得分图和负荷图；c和d：PLS-DA的3D得分图和交互验证。Figure 2. Multivariate analysis of volatile species content in the oxidation process of virgin coconut oil2.3 VCO特征风味成分的分析
根据 Guadagni 气味活度值理论，食品中香气浓度高而阈值低的成分很可能是食品的特征香气[23]，物质浓度高不一定对椰子油的香气有很大的贡献，而含量低的物质也有可能对椰子油的整体香气有大的影响。因此，化合物的阈值对于初榨椰子油的风味分析至关重要，若知道这些挥发物的浓度和阈值，则可以有效判断其在体系中对风味或味觉重要性的贡献率[24]。
参考《化合物香味阈值汇编（第二版）》[23]及参考文献[19,25-26]，确定了 24 种挥发性风味物质在部分或所有VCO样品中 ROAV > 0.1。一般认为ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV<1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用[15]。
其ROAV值、阈值及嗅闻气味描述如表2 所示，其组成成分主要包括酯类、酸类、醛酮类，另外还有少部分醇类。可以看出，从C11（壬醛）、C15（辛酸乙酯）、C17（丁位辛内酯）、C18（2-十一酮）、C21（癸酸乙酯）、C22（丁位癸内酯）和C23（月桂酸乙酯）这7种风味物质在各氧化期间均有不同影响程度的存在，这些化合物的综合作用赋予VCO独特的奶油香及果香气味，其中C17（丁位辛内酯）、C21（癸酸乙酯）和C22（丁位癸内酯）具有独特的椰子香型和乳脂似香气。已有研究证明丁位辛内酯可产生明显的椰子气味[27]。C11（壬醛）虽在VCO中的浓度并不高但因其阈值低，使之也成为椰子油的特征香气物质，赋予其蜜蜡花香气息。此外，C3（2-庚酮）在鲜榨VCO中未检出，随后其ROAV有着先增大后降低的趋势，类似趋势的还有C9（丁位己内酯），其在18 m以前的ROAV均>1，意味着这些化合物是VCO氧化前中期的重要特征风味物质，且都随着氧化时间的进一步延长ROAV降低，甚至消失。这些物质对VCO的整体香气及差异区分起到很大的贡献作用，其余关键风味成分有着重要修饰作用。而C2（己醛）、C4（反式-2-庚醛）、C5（己酸）、C14（辛酸）、C15（辛酸乙酯）以及C16（2-癸烯醛）等挥发物在30 m以后的ROAV值明显增大，成为VCO氧化后期的关键特征风味物质，并赋予椰子油明显的酸败味及其他略有不舒适的气味或刺激味。有研究表明，戊醛、己醛、反式-2-庚醛等关键风味化合物是油酸和亚油酸的氧化降解产物[28]。
表 2 VCO储藏过程中挥发性风味成分相对气味活度值Table 2. Relative odor activity of volatile flavor components in VCO during storage编号 挥发物
名称挥发物
化学式阈值[23,25-26]
（mg/kg）0 d 15 d 6 m 18 m 30 m 42 m 54 m 66 m 气味描述[19,25−26] C1 戊醛 C5H10O 0.012 − − − − − 6.27 − − 油脂味，木香味 C2 己醛 C6H12O 0.005 − − − − 64.86 149.88 53.78 70.28 呈生的油脂和青草气，木屑味 C3 2-庚酮 C7H14O 0.14 − 16.01 40.72 11.17 − − − 1.93 香蕉香气，轻微药香气味 C4 2-庚醛（E）- C7H120 0.0028 − − − − − 19.25 3.71 − 刺激味，鱼腥味 C5 己酸 C6H12O2 0.89 0.72 0.40 0.13 − 5.66 2.60 3.43 2.85 酸败味，有汗臭味 C6 丁酸丁酯 C8H16O2 0.4 − 0.13 1.19 − − − − − 有梨、菠萝样水果香气 C7 2-己酮，
4-羟基-5-甲基-C7H14O2 0.04 − − 1.98 7.50 − − − − 具刺激性 C8 2-辛烯醛（E）- C8H14O 0.003 − − − − − − 16.81 − 呈脂肪和肉类香气，并有黄瓜和鸡肉香味 C9 丁位己内酯 C6H10O2 0.05 16.56 24.72 29.63 41.46 15.61 − − − 呈椰子油和乳脂似香气，有焦香和果香 C10 2-壬醇 C9H20O 0.058 − 0.59 0.57 − − − − − 有甜而青的玫瑰花蜡和果香的脂蜡香气 C11 壬醛 C9H10O 0.0011 317.82 104.84 100.00 98.79 110.34 164.52 138.38 76.70 有青而微甜，尖锐的蜜蜡香，花生味 C12 苯乙醇 C8H10O 0.14 − − 0.33 − − − − − 具有玫瑰香气 C13 辛酸甲酯 C9H18O2 0.2 0.44 0.30 0.11 0.51 0.41 0.26 0.19 0.86 呈葡萄酒和橙子香气 C14 辛酸 C8H16O2 1.405 1.04 <0.1 0.17 − 1.36 3.02 3.27 2.90 略有不舒适的气味和焦膣味，干酪味 C15 辛酸乙酯 C10H20O2 0.0193 32.43 46.25 29.35 25.08 25.94 102.51 137.12 154.03 白兰地酒香，有似菠萝的香味，并有甜味 C16 2-癸烯醛, （E）- C10H18O 0.003 − − − − − 10.91 3.41 2.28 油脂味，呈鸡、家禽和橙子似香味 C17 丁位辛内酯 C8H14O2 0.2 18.27 15.95 7.76 28.48 12.38 5.83 5.61 6.98 呈可可、椰子和乳脂似香气 C18 2-十一酮 C11H22O 0.0055 34.35 42.11 43.98 49.68 45.00 26.27 15.81 13.62 呈柑橘类、油脂和芸香似香气 C19 癸酸甲酯 C11H22O2 0.0043 19.63 29.86 7.64 28.60 11.35 9.07 5.54 11.17 果香气 C20 癸酸 C10H20O2 0.13 − − − − − 3.68 2.95 2.90 脂肪味 C21 癸酸乙酯 C12H24O2 0.005 47.21 58.55 28.18 53.68 22.21 15.16 7.82 28.11 脂肪香，具有椰子香型香气 C22 丁位癸内酯 C10H18O2 0.031 32.46 17.61 10.51 41.89 19.45 10.39 9.74 11.71 具有强烈持久的奶油香 C23 月桂酸乙酯 C14H28O2 0.4 0.40 0.28 0.15 0.35 0.19 0.13 <0.1 0.15 特殊的果香气味 C24 δ-十二内酯 C12H22O2 0.005 6.65 3.79 2.24 5.72 4.68 2.74 3.12 2.71 有奶油香味和果香香气 注：“−“表示未检出。 综上，相对气味活度值（Relative odor activity value, ROAV）的分析表明己醛、2-庚酮、丁位己内酯、壬醛、辛酸乙酯、丁位辛内酯、2-十一酮、癸酸乙酯、丁位癸内酯等是初榨椰子油常温储藏过程中关键风味物质。整体上酯类化合物是赋予VCO独特的椰香的来源，而C3（2-庚酮）和C7（己酮）等酮类化合物在氧化前期（6 m）的产生和大量增多对VCO的清香气味有着一定的刺激作用，使得VCO的风味变化极为迅速，随后则是醛、酸类化合物的综合作用导致VCO出现更多的不良风味。因此，不同氧化阶段产生的挥发性风味物质对VCO的风味有着重要的影响，其部分特征挥发物产生的不良风味对VCO的整体风味也有着至关重要的作用。
2.4 特征风味物质与储藏期关联分析
为在降维中可视化数据结构，通过归一化处理了表2中具有变化规律的特征挥发性成分的ROAV生成PCA得分图（图3）。根据PCA分类结果（图3a）可见，不同时期VCO样品分成了四组，与上述不同类别化合物含量与储藏期关联分析所得分组相同，结合储藏期可将本研究涉及的VCO样品的氧化过程大致分为四个阶段：A组：半月之内（0~15 d），新鲜油；B组：半年（6 m），氧化前期；C组：一年半（18 m），氧化中期；D组：两年半至五年半（30~66 m），氧化后期。如图3a所示， B组（绿点）和C组（紫点）之间观察到存在部分重叠，而A组（红点）、D组（蓝点）明显远离其他两组。这意味着氧化过程明显改变了椰子油的挥发性成分，VCO在市售保质期内挥发性风味物质存在一定的共性，但随着储藏期的延长由各别特征风味物质的出现逐渐转变为大量不良风味物质的产生。因此，贮藏期对分类影响较大，不同时期的氧化反应是VCO特征挥发物质差异的重要因素。
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图 3 VCO特征风味物质ROAV的多元分析注：a和b： PCA的2D得分图和负荷图；c和d： PLS-DA的3D得分图和交叉验证；e：PLS-DA变量重要性因子-VIP值。Figure 3. Multivariate analysis of characteristic volatiles of VCOPLS-DA 作为一种有监督的判别分析统计方法[29]，与PCA侧重反映样品的分类趋势不同的是PLS-DA可用于建立挥发性风味物质与样品类别的关联模型，以实现样品类别预测[30]。ROAV的PLS-DA三维得分示意图如图3c所示，Component 1 贡献率为 46.1%，Component 2 贡献率为 19.9%，Component 3 贡献率为 18.1%。由图可直观反映各样本间的相似性和差异性，两个样本间差异越大，表现在得分图上的相对位置越远，反之亦然[25]。这些样品的归类结果与VCO所处的氧化阶段直接相关，PLS-DA 建立的关系模型也将VCO样品分为四类。图3d中列出了PLS-DA的模型参数，R2为0.95，Q2>0.8，表明模型具有较高的预测能力，模型有效。
变量投影重要度（variable importance for the projection, VIP）可以用来衡量PLS-DA 模型下每一个变量因子的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助标志变量因子的筛选[31]。如图3e所示，VIP 值越大，表明该风味物质在组间的差异越大，对VCO氧化程度的判别分类越关键。依据 VIP 值 > 1.0 的原则并结合PCA的载荷图（图3b），共筛选出2-庚酮、己醛、丁位己内酯、丁位辛内酯、2-癸烯醛、癸酸乙酯、己酮、己酸等关键差异性化合物，可将2-庚酮作为氧化前期（储藏半年），己酮、丁位己内酯作为氧化中期（储藏一年半），己醛、己酸、2-癸烯醛作为氧化后期 （储藏两年半至五年半）的重要特征挥发性风味成分。
图4是VCO样品中24种特征挥发性风味成分ROAV的分布热图。图中红色越深代表某种物质的风味贡献程度越高，可以看出，不同储藏时期的VCO都有明显的特征挥发性成分，聚类分析结果也进一步表明氧化过程中存在明显的变化趋势。C10（2-壬醇）与C11（壬醛）具有甜而青的花蜡和果香的脂蜡香气，对新鲜VCO的清香风味有着重要作用；同时C19（癸酸甲酯）、C21（癸酸乙酯）、C22（丁位癸内酯）、C24（δ-十二内酯）这些酯类化合物具有具有强烈持久的奶油香、脂肪香及椰子香型香气，赋予新鲜VCO特殊的椰香味。在氧化前期C3（2-庚酮）对椰子油的风味影响较大，呈香蕉香气及轻微药香气味，此外，C6（丁酸丁酯）、C9（丁位辛内酯）、C17（丁位辛内酯）、C23（月桂酸乙酯）等酯类挥发性化合物在氧化阶段的前中期（18个月的保质期之内）也赋予乳脂似香气及特殊的焦香、果香气味，在氧化后期的影响作用则明显降低，此阶段C5（己酸）的酸败味逐渐浮出；随后C1（戊醛）、C2（己醛）、C4（2-庚醛（E）-）的木屑味、刺激味、鱼腥味也开始起到不良作用；随着氧化过程的不断进行，呈脂肪和肉类香气的C8（2-辛烯醛（E）-）、C16（2-癸烯醛, （E）-）有着重要修饰作用；伴随着还有C14（辛酸）、C15（辛酸乙酯）、C20（癸酸）等挥发出的略有不舒适的油脂气味和干酪味。
虽然VCO样品中主要挥发性风味成分大体相似，但是风味成分的含量及阈值的区别导致不同储藏期的VCO样品风味差异很大，关键风味物质的分析对VCO氧化过程中的风味及归类至关重要，因此本研究对储藏过程中挥发性风味成分的连续分析，充分揭示了不同氧化阶段VCO样品风味成分的贡献程度及香气差异的重要来源。综上所述，通过脂质氧化中挥发性化合物的HS-SPME-GC-MS分析和多元统计方法相结合，可为鉴别不同新鲜程度VCO提供一种灵敏的有效工具。
3. 结论
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（Headspace solid-phase microextraction–gas chromatography–mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术对为期六年内8个时期的室温储藏过程中VCO中挥发性风味成分进行了分析，鉴定了40种挥发性物质，并计算ROAV确定VCO的24种特征风味成分，分析表明：整体上丁位辛内酯、癸酸乙酯和丁位癸内酯等酯类化合物是赋予VCO独特的椰香的来源，而2-庚酮和己酮等酮类化合物在氧化前期的产生和大量增多对VCO的清香气味有着一定的刺激作用，使得VCO的风味变化极为迅速，随后则是醛、酸类化合物的综合作用导致VCO出现明显的酸败味及其他不良风味。探究氧化过程中风味差异的产生来源也为VCO风味品质评价提供了理论参考。经PCA和PLS-DA分析，建立了VCO不同储藏时期的判别模型，不同类别化合物（酮类化合物、酯类化合物和酸类化合物）的含量可以作为简单区分VCO储藏期的指标，同时筛选出2-庚酮、己醛、丁位己内酯、丁位辛内酯、2-癸烯醛、癸酸乙酯、己酮、己酸等关键差异风味物质也对VCO的氧化情况的判别有着重要参考作用，挥发性成分有可能作为监测VCO在储藏过程中氧化程度的有效标志。通过HS-SPME-GC-MS结合适当的多元分析对VCO挥发性风味成分进行表征和分类，有可能被用作评估VCO品质的非破坏性方法。关于不同产地椰子制取的VCO的风味类型存在的其他差异还有待对比研究，延缓或抑制VCO自然氧化过程中不良风味产生的方法也可进一步深入探究。
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图 2 VCO氧化过程中挥发物类别含量的多元分析
注：a和b：PCA的2D得分图和负荷图；c和d：PLS-DA的3D得分图和交互验证。
Figure 2. Multivariate analysis of volatile species content in the oxidation process of virgin coconut oil
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图 3 VCO特征风味物质ROAV的多元分析
注：a和b： PCA的2D得分图和负荷图；c和d： PLS-DA的3D得分图和交叉验证；e：PLS-DA变量重要性因子-VIP值。
Figure 3. Multivariate analysis of characteristic volatiles of VCO
表 1 VCO储藏过程中挥发性风味成分比较
Table 1 Comparison of volatile flavor components of virgin coconut oil during storage
分类 0 d 15 d 6 m 18 m 30 m 42 m 54 m 66 m 种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）种类 相对含
量（%）醇类化合物 1 28.91 2 27.57 3 16.75 1 6.86 1 1.47 3 7.68 1 3.06 − − 酯类化合物 10 49.79 11 49.25 12 35.10 11 75.28 10 34.46 11 27.29 10 30.83 10 39.51 醛类化合物 1 2.55 1 0.84 1 0.80 1 0.79 2 3.25 6 8.09 6 3.64 3 3.17 酮类化合物 1 1.38 2 18.01 4 44.24 3 15.57 1 1.80 2 1.30 2 0.69 4 5.98 酸类化合物 2 15.33 2 3.34 2 2.57 − − 2 50.56 4 51.45 3 58.50 3 50.90 烃类化合物 1 0.37 2 0.94 1 0.09 2 0.27 1 0.11 1 3.80 2 2.48 − − 注：“−”表示未检出。 
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表 2 VCO储藏过程中挥发性风味成分相对气味活度值
Table 2 Relative odor activity of volatile flavor components in VCO during storage
编号 挥发物
名称挥发物
化学式阈值[23,25-26]
（mg/kg）0 d 15 d 6 m 18 m 30 m 42 m 54 m 66 m 气味描述[19,25−26] C1 戊醛 C5H10O 0.012 − − − − − 6.27 − − 油脂味，木香味 C2 己醛 C6H12O 0.005 − − − − 64.86 149.88 53.78 70.28 呈生的油脂和青草气，木屑味 C3 2-庚酮 C7H14O 0.14 − 16.01 40.72 11.17 − − − 1.93 香蕉香气，轻微药香气味 C4 2-庚醛（E）- C7H120 0.0028 − − − − − 19.25 3.71 − 刺激味，鱼腥味 C5 己酸 C6H12O2 0.89 0.72 0.40 0.13 − 5.66 2.60 3.43 2.85 酸败味，有汗臭味 C6 丁酸丁酯 C8H16O2 0.4 − 0.13 1.19 − − − − − 有梨、菠萝样水果香气 C7 2-己酮，
4-羟基-5-甲基-C7H14O2 0.04 − − 1.98 7.50 − − − − 具刺激性 C8 2-辛烯醛（E）- C8H14O 0.003 − − − − − − 16.81 − 呈脂肪和肉类香气，并有黄瓜和鸡肉香味 C9 丁位己内酯 C6H10O2 0.05 16.56 24.72 29.63 41.46 15.61 − − − 呈椰子油和乳脂似香气，有焦香和果香 C10 2-壬醇 C9H20O 0.058 − 0.59 0.57 − − − − − 有甜而青的玫瑰花蜡和果香的脂蜡香气 C11 壬醛 C9H10O 0.0011 317.82 104.84 100.00 98.79 110.34 164.52 138.38 76.70 有青而微甜，尖锐的蜜蜡香，花生味 C12 苯乙醇 C8H10O 0.14 − − 0.33 − − − − − 具有玫瑰香气 C13 辛酸甲酯 C9H18O2 0.2 0.44 0.30 0.11 0.51 0.41 0.26 0.19 0.86 呈葡萄酒和橙子香气 C14 辛酸 C8H16O2 1.405 1.04 <0.1 0.17 − 1.36 3.02 3.27 2.90 略有不舒适的气味和焦膣味，干酪味 C15 辛酸乙酯 C10H20O2 0.0193 32.43 46.25 29.35 25.08 25.94 102.51 137.12 154.03 白兰地酒香，有似菠萝的香味，并有甜味 C16 2-癸烯醛, （E）- C10H18O 0.003 − − − − − 10.91 3.41 2.28 油脂味，呈鸡、家禽和橙子似香味 C17 丁位辛内酯 C8H14O2 0.2 18.27 15.95 7.76 28.48 12.38 5.83 5.61 6.98 呈可可、椰子和乳脂似香气 C18 2-十一酮 C11H22O 0.0055 34.35 42.11 43.98 49.68 45.00 26.27 15.81 13.62 呈柑橘类、油脂和芸香似香气 C19 癸酸甲酯 C11H22O2 0.0043 19.63 29.86 7.64 28.60 11.35 9.07 5.54 11.17 果香气 C20 癸酸 C10H20O2 0.13 − − − − − 3.68 2.95 2.90 脂肪味 C21 癸酸乙酯 C12H24O2 0.005 47.21 58.55 28.18 53.68 22.21 15.16 7.82 28.11 脂肪香，具有椰子香型香气 C22 丁位癸内酯 C10H18O2 0.031 32.46 17.61 10.51 41.89 19.45 10.39 9.74 11.71 具有强烈持久的奶油香 C23 月桂酸乙酯 C14H28O2 0.4 0.40 0.28 0.15 0.35 0.19 0.13 <0.1 0.15 特殊的果香气味 C24 δ-十二内酯 C12H22O2 0.005 6.65 3.79 2.24 5.72 4.68 2.74 3.12 2.71 有奶油香味和果香香气 注：“−“表示未检出。
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