Separation and Purification of ACE Inhibitory Peptide from Jellyfish by Macroporous Resin
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摘要: 本文主要从分子极性角度研究了大孔吸附树脂对具有血管紧张素转化酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）抑制活性的海蜇多肽的分离纯化作用。取海蜇酶解产物作为研究对象，选用HP20SS、SP20SS、SP207三种不同型号的大孔吸附树脂分离纯化海蜇ACE抑制肽，以ACE抑制率为评价指标，对其分离纯化海蜇ACE抑制肽的工艺进行研究。结果发现，HP20SS型大孔吸附树脂分离纯化海蜇ACE抑制肽效果最佳，当海蜇酶解液的浓度为10.0 mg/mL、上样流速为2.0 BV/h、静置吸附3 h、洗脱剂为70%的乙醇溶液、洗脱剂流速为1.0 mL/min的条件下，富集后的ACE抑制肽分子量为2.65×103 Da，纯度为89.16%，抑制率高达92.18%，IC50值为1.02 mg/mL。经3次平行试验，样品的平均回收率为94.76%，RSD为0.63%。综合分析，HP20SS大孔吸附树脂对海蜇ACE抑制肽有较好的分离纯化效果，该工艺合理可行且重现性好。Abstract: In this paper, the separation and purification of jellyfish polypeptide with Angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory activity by macroporous adsorption resin was studied from the perspective of molecular polarity. The enzymatic hydrolysates of jellyfish were taken as the research object, and three different types of macroporous resin HP20SS, SP20SS and SP207 were used to isolate and purify the ACE inhibitory peptide of jellyfish. The ACE inhibitory rate was used as the evaluation index, and the separation and purification process of ACE inhibitory peptide was screened. The results showed that HP20SS macroporous resin was the best for the separation and purification of ACE inhibitory peptide. Under the conditions of 10.0 mg/mL of hydrolysate, 2.0 BV/h of sample loading, 3 h of standing adsorption, 70% ethanol solution of eluent, 1.0 mL/min of eluent, after enrichment, the molecular weight of ACE inhibitory peptide was 2.65×103 Da, the purity was 89.16%, and the inhibition rate was up to 92.18%, the IC50 value was 1.02 mg/mL. The average recovery was 94.76% and RSD was 0.63% after three parallel tests. Comprehensive analysis showed that HP20SS macroporous resin had a good separation and purification effect on the ACE inhibitory peptide of jellyfish, and the process was reasonable and feasible with good reproducibility.
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高血压作为最常见的心血管疾病，已成为威胁人类健康的一大杀手。经数据统计分析可知，近年来全球高血压的平均发病率已经达到了10%~20%，我国高血压患病人口也已超过了1.2亿，并且处于持续快速增长的趋势[1-2]。血管紧张素转化酶（angiotensin-I-converting enzyme，ACE）作为生物体内一类重要的血压调节酶，其由单一肽链组成且含有大量的低聚糖，能够被Zn2+和Cl－激活且底物特异性较宽[3]。在ACE的作用下，血管紧张素I会生成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素II，后者可作用于小动脉从而引起血管平滑肌收缩，导致血压迅速升高；与此同时，其还能够促进醛固酮的分泌，增强肾脏对Na+和水的重吸收，使血压升高[4-5]。
海蜇（Rhopilema esculentum），根口水母科海蜇属动物，其口感美味且营养价值较高。研究证实[6-7]，海蜇具有舒张血管、降血压以及消炎等功效，深受国内外广大消费者的青睐。从海蜇中提取的海蜇ACE抑制肽是经蛋白酶处理后得到的具有ACE抑制活性的肽，它们对ACE活性区域的亲和力大于血管紧张素I和缓激肽对ACE的亲和力，ACE抑制肽与活性区域相互结合可有效的抑制ACE的活性，降低血管紧张素II的生成水平，起到降血压的功效[8]。
为了进一步筛选并富集海蜇ACE抑制肽的有效组分，增强降血压疗效，因此有必要对海蜇酶解液进行纯化处理。文献研究表明[9-11]，大孔吸附树脂在分离纯化多肽、蛋白质等生物活性物质时具有良好的选择性，且试验条件温和、操作方便、成本较低，近年来被广泛应用于活性物质的生产中。目前ACE抑制肽主要通过酶解法制备，除了选择具有较高特异性的酶之外，对酶解产物的分离纯化也是非常重要的。一般的，海蜇酶解产物成分是比较复杂的，要想得到纯度相对较高的ACE抑制肽则需要通过纯化技术来富集具有较高ACE抑制活性的肽段[12]。HP20SS型大孔吸附树脂是将具有良好吸附特性的HP20小粒径化的产品，其粒径为63~150 μm，可以实现高纯度精密分离；SP20SS型大孔吸附树脂是一种粒度小且分布窄的产品；SP207是在芳香族系的骨架上结合了溴，从而强化了疏水吸附力。本研究采用复合蛋白酶酶解海蜇，首先通过分子量（MW）为3000 Da的滤膜超滤，富集MW<3000 Da的酶解液，然后以ACE抑制率为评价指标，对比分析HP20SS、SP20SS和SP207三种不同型号的大孔吸附树脂对海蜇ACE抑制肽的纯化效果，为综合开发利用海蜇资源提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
三矾海蜇 购自海鲜市场；复合蛋白酶（120 U/mg）、硼酸、乙腈、乙酸和乙醇 均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司；ACE抑制肽标准品 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；马脲酰组氨酰亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL） 上海瀚鸿科技股份有限公司；HP20SS、SP20SS、SP207型大孔吸附树脂 北京绿百草科技发展有限公司。
JJ-1A型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪、RF-20A紫外检测器、Apollo 5u色谱柱（250 mm×4.6 mm） 日本岛津公司；BS-100A自动部分收集器 上海沪西分仪器厂有限公司；AB204-N电子分析天平 上海精科实业有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 海蜇ACE抑制肽酶解液的制备
将三矾海蜇用清水冲洗去除盐和其他杂质，测定浸泡后海蜇的清水电导率，直至与自来水的电导率一致时停止冲洗。将浸泡后的海蜇研磨成匀浆，取10 g海蜇匀浆样品置于30 mL的蒸馏水中，用氢氧化钠（0.1 mol/L）或盐酸（0.1 mol/L）溶液调节pH至7.6，加入复合蛋白酶（酶与底物比例为2.8%）于58 ℃的温度下酶解3.9 h，同时伴随磁力搅拌[13]。待酶解结束后，将酶解液置于沸水中水浴10 min，灭活复合蛋白酶，然后冷却至室温，于4000 r/min条件下离心处理15 min。将离心后的样品采用分子量为3000 Da的滤膜超滤，分别收集MW>3000 Da和MW<3000 Da的滤过部分，测定ACE抑制率，取抑制率相对较高（MW<3000 Da）的部分进行下一步实验。
1.2.2 ACE抑制率的测定
设置样品组和空白对照组，分别取1.5 mL的离心管，向空白对照组中加入100 μL浓度为5 mmol/L的HHL，加入硼酸缓冲液（pH8.3）补足至120 μL，置于37 ℃恒温水浴锅中保温5 min，然后加入5 μL浓度为0.1 U/mL的ACE抑制肽标准品开始反应；样品组则加入100 μL浓度为5 mmol/L的HHL和20 μL的酶解液，置于37 ℃的恒温水浴中保温5 min，然后加入5 μL浓度为0.1 U/mL的ACE抑制肽标准品开始反应[14]。
上述操作完成后将两组均置于37 ℃的恒温水浴锅中保温处理30 min后，加入200 μL浓度为1 mol/L的盐酸中止反应，补加175 μL的硼酸缓冲液。
待反应结束后，采用高效液相色谱仪测定对照组和样品组样品的峰面积，检测条件如下：色谱柱为Apollo 5u C18（250 mm×4.6 mm）；流动相为乙腈:0.5%乙酸=35:65；流速为1.0 mL/min；检测波长为228 nm；柱温为35 ℃；进样量为20 μL。
ACE抑制率的计算公式如下：
(1) 1.2.3 ACE抑制肽分子量的测定
采用高效液相色谱法测定ACE抑制肽分子量，液相色谱检测条件同1.2.2。分别选用Gly-Gly-Gly（MW=189.17 Da）、氧化型谷胱甘肽（MW=612.63 Da）、维生素B12（MW=1355.37 Da）和抑肽酶（MW=6511.51 Da）4种标准品，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准溶液，进样前经过0.45 μm的滤膜过滤备用，通过高效液相色谱分析上述4个标准品的出峰时间，以出峰时间为横坐标，分子量为纵坐标绘制分子量标准曲线。对照标准曲线，计算ACE抑制肽的分子量。
1.2.4 大孔吸附树脂的预处理
以0.5 BV的95%的乙醇分别浸泡HP20SS、SP20SS和SP207型大孔吸附树脂24 h，用2.0 BV的乙醇以1.0 BV/h的流速通过树脂，并浸泡3 h；用乙醇以1.0 BV/h的流速洗涤树脂直至流出液加水不呈现白色浑浊为止；再用蒸馏水以同样的流速洗净直至流出液无乙醇味道，树脂层面上保持2~5 mm的液体，以免干柱，备用。三种大孔吸附树脂的物理参数见表1。
表 1 大孔吸附树脂静态吸附与解吸附结果比较Table 1. Comparsion of static adsorption and desorption capacity of different hydrophobic resin型号 孔径（A） 有效粒径（μm） 比表面积（m2/g） 吸附率（%） 解吸附率（%） HP20SS 260 63~150 600 60.48±2.91a 89.51±3.49a SP20SS 260 63~75 470 51.64±3.25bc 80.33±2.82b SP207 120 63~150 630 53.36±2.44b 79.89±4.54bc 注：同列中的不同字母代表差异显著，P<0.05；表2同。 1.2.5 大孔吸附树脂的静态吸附和解吸性能考察
分别称取2.0 g处理好的HP20SS、SP20SS和SP207型大孔吸附树脂，用滤纸吸干表面水份，装入100 mL具塞磨口三角瓶中，通过移液管量取已知浓度的海蜇ACE抑制肽酶解液30 mL，于转速为110 r/min恒温振荡器中振荡24 h后过滤，分别收集滤出的液体1 mL，加入4 mL双缩脲试剂显色，避光反应30 min后测定其质量分数，计算树脂的静态吸附率；将吸附饱和的树脂用适量蒸馏水洗至洗脱液无色，滤纸吸干树脂表面残留液体，加入30 mL浓度为70%的乙醇，以150 r/min恒温振荡12 h解吸，用滤纸过滤，测定ACE抑制肽的质量分数，计算解吸率。吸附率和解吸率计算公式如下：
(2) (3) (4) 式中：C0表示吸附前溶液中ACE抑制肽的浓度，mg/g；C1表示吸附后溶液中ACE抑制肽的浓度，mg/g；C2表示解吸后溶液中ACE抑制肽的浓度，mg/g；V0表示吸附溶液的体积，mL；V1表示解吸液的体积，mL；W表示树脂的干重，g。
1.2.6 大孔吸附树脂动态吸附和解吸性能考察
1.2.6.1 酶解液上柱浓度对ACE抑制肽吸附效果的影响
取预处理好的HP20SS型大孔吸附树脂20 g，湿法装入层析柱（1.60×20 cm）中；分别取浓度为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液各50 mL，以2.0 BV/h的流速上柱，室温下吸附3 h，检测流出液的ACE抑制率。
1.2.6.2 酶解液上样流速对ACE抑制肽吸附效果的影响
取预处理好的HP20SS型大孔吸附树脂20 g，湿法装入层析柱（1.60×20 cm）中；分别取浓度为10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液50 mL，分别以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h的流速上柱，室温下吸附3 h，收集流出液，检测并计算ACE抑制率。
1.2.6.3 洗脱剂浓度对ACE抑制肽解吸效果的影响
取预处理好的HP20SS型大孔吸附树脂20 g，湿法装入层析柱（1.60×20 cm）中；分别取浓度为10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液50 mL，按照最佳吸附方案完成吸附。待吸附完成后，分别加入浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇各60 mL，以1.0 mL/min的流速进行洗脱。收集洗脱液，检测并计算ACE抑制率。
1.2.6.4 洗脱剂流速对ACE抑制肽解吸效果的影响
取预处理好的HP20SS型大孔吸附树脂20 g，湿法装入层析柱（1.60×20 cm）中；分别取浓度为10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽酶解液50 mL，按照最佳吸附方案完成吸附。待吸附完成后，用60 mL浓度为70%的乙醇，分别以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速洗脱。收集洗脱液，检测并计算ACE抑制率。
1.2.7 样品平均回收率的计算 计算公式如下：
(5) 1.3 数据处理
实验进行3次取平均值，采用SPSS 22.0对实验数据进行显著性分析，用Origin 9.1软件作图。
2. 结果与分析
2.1 大孔吸附树脂的筛选
在相同实验条件下，3种大孔吸附树脂的静态吸附-解吸附性能结果如表1所示。由表1可以看出，3种树脂中仅有HP20SS的吸附率大于60%，且解吸附率达到了89.51%。由于HP20SS型大孔吸附树脂解吸率最高，因此表现出最佳的综合性能。这是因为HP20SS大孔吸附树脂是一种比表面积大、平均孔径小的非极性树脂，其对多肽的吸附作用力主要是疏水性相互作用，虽然SP207型大孔吸附树脂的孔径小于HP20SS型大孔吸附树脂，但较小的孔径对大分子存在分子排阻效应。因此，选择HP20SS型大孔吸附树脂分离纯化海蜇ACE抑制肽。此外，树脂的吸附能力还与其孔径、比表面积、孔容等物理结构参数有关[15]。对于孔径较大的树脂有利于吸附，且吸附率较高，但在某些情况下，吸附作用力强，对解吸会造成一定的困难，因此，有些树脂虽然吸附率较高，但由于解吸率太低，故不适用于分离纯化目的产物。
2.2 HP20SS大孔吸附树脂静态吸附曲线
从图1可知，HP20SS大孔吸附树脂对海蜇ACE抑制肽上柱液的吸附为快速平衡型，起始阶段的海蜇ACE抑制肽上柱液吸附率较低，在3 h后基本达到平衡，HP20SS大孔吸附树脂对海蜇ACE抑制肽上柱液具有良好的吸附动力学特性，适用于海蜇ACE抑制肽的分离纯化。
2.3 HP20SS大孔吸附树脂的动态吸附和解吸附性能考察
由图2A可知，当上样浓度为50和5.0 mg/mL时，泄漏点出现在40 mL左右，不利于疏水树脂对目标物质的吸附，容易达到饱和吸附。而当上样浓度为1.0、10.0、100.0 mg/mL时，泄漏点均出现在70 mL左右，且上样浓度为10.0 mg/mL时，ACE抑制率达58.76%，大于1.0 mg/mL的47.43%和100.0 mg/mL的39.98%。因此，本实验选取最佳上样浓度为10.0 mg/mL。在大孔树脂的吸附过程中，上柱液浓度对吸附效果的影响也较为显著，这是因为海蜇酶解产物中还含有糖类、锌、镁、钙等金属元素以及海蜇毒素等，当上样浓度过高时，所含杂质过多，杂质会与ACE抑制肽竞争吸附活性位点，也会造成层析柱滤膜的堵塞，从而影响吸附效果[16]；而上样浓度过低则会导致吸附不充分，造成样品浪费[17]。当上柱液浓度为10.0 mg/mL时，多肽与树脂接触越充分，单位表面积内与大孔树脂接触的ACE抑制肽的含量较大，吸附量也就越大。
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图 2 HP20SS大孔吸附树脂的动态吸附和解吸附曲线注：A：上样浓度；B：上样流速；C：洗脱剂浓度；D：洗脱剂流速。Figure 2. Dynamic adsorption and desorption curves of HP20SS macroporous adsorption resin由图2B可知，流量为0.5和1.5 BV/h，泄漏点出现在50 mL左右；当流量为2.0 BV/h时，泄漏点出现在80 mL左右，且ACE抑制率达到了79.65%，因此，本实验选取最佳上样流量为2.0 BV/h。一般的，上样液流速越慢，化学成分才能更有效地扩散到树脂内部和表面，HP20SS树脂表面存在具有较强疏水性能的基团，这些基团对疏水性较大的海蜇ACE抑制肽具有较强的亲和吸附作用[18-20]。过快的流速显然不利于HP20SS树脂与被吸附成分的充分接触而导致泄露增加，产率显著下降[21]。在实际生产操作中，需要尽量缩短吸附时间才能兼顾到生产效率。
由图2C可知，50%的乙醇洗脱液的海蜇ACE抑制率过低，仅有70.14%；80%的乙醇洗脱时泄漏点出现在40 mL左右；60%和90%的乙醇洗脱剂用量达80 mL左右时ACE抑制率仅仅达到80%左右。不同体积分数的乙醇，溶解性能不同，洗脱的物质基础也有所差异，因而对洗脱产物的ACE抑制率也会存在一定的影响，故确定浓度为70%的乙醇溶液为动态洗脱的最佳浓度。这可能是因为乙醇体积分数不同，极性大小也不同，ACE抑制肽和大孔吸附树脂之间存在一定的范德华力，两物质的极性越相似则范德华力越大[22-23]。乙醇的体积分数越大，极性越小，树脂中大量的醇溶性杂质就会越多[24-25]，从而使ACE抑制肽的纯度下降，而70%的乙醇可能与ACE抑制肽的极性相似，洗脱效果较好。
由图2D可知，当固定洗脱剂的用量时，洗脱时流速越小，与树脂接触时间较长，洗脱效果越好，可见洗脱剂流速低有利于海蜇ACE抑制肽的解吸，故选择洗脱剂的流速为1.0 mL/min。另外，随着洗脱液流速加快，洗脱带变窄，拖尾现象不明显，洗脱效果较好，洗脱液体积相对减少；流速过慢，洗脱时间增加，洗脱液的体积也相应地增加[20,26]。
2.4 纯化前后海蜇ACE抑制肽的ACE抑制活性对比分析
以卡托普利作为阳性对照[27]，对比分析了纯化前后海蜇ACE抑制肽的IC50值和ACE抑制率。由表2可知，纯化前海蜇ACE抑制肽的ACE抑制率显著小于纯化后海蜇ACE抑制肽的ACE抑制率（P<0.05），纯化后海蜇ACE抑制肽的IC50值为1.02 mg/mL，表明HP20SS分离纯化ACE抑制肽的效果较好。并且，海蜇ACE的活性与多肽的极性有关，疏水性氨基酸含量越高，其ACE抑制活性也就越高[28-29]。
表 2 纯化前后海蜇ACE抑制肽的IC50值和ACE抑制率对比分析Table 2. IC50 value and ACE inhibition ratio of the upper column solution and the purified sample组别 ACE抑制率（%） IC50（mg/mL） 卡托普利 93.42±2.76a 3.54×10−4 纯化前海蜇ACE抑制肽 69.21±2.09c 1.41 纯化后海蜇ACE抑制肽 92.18±1.76b 1.02 2.5 验证实验
根据上述实验结果，按照最佳条件操作，即取质量浓度为10.0 mg/mL的海蜇ACE抑制肽上柱液，以2.0 BV/h上样，静置吸附3 h，用浓度为70%的乙醇按照1.0 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，测定其ACE抑制率为92.18%，所得色谱图见图3。同时完成3次平行试验。富集后的ACE抑制肽分子量为2.65×103 Da，纯度为89.16%，样品的平均回收率为94.76%，RSD为0.63%，表明HP20SS大孔吸附树脂对海蜇ACE抑制肽有较好的分离纯化效果，该工艺合理可行且重现性好。
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图 3 对照品和海蜇ACE抑制肽上柱液高效液相色谱图注：A：对照品；B：海蜇ACE抑制肽。Figure 3. HPLC of reference substance and ACE inhibitory peptide from jellyfish3. 结论
HP20SS型大孔吸附树脂对海蜇ACE抑制肽具有良好的富集作用和解吸效果。HP20SS型大孔吸附树脂纯化海蜇ACE抑制肽最佳动态吸附和解吸条件为：海蜇酶解液的浓度为10.0 mg/mL、上样流速为2.0 BV/h、静置吸附3 h、洗脱剂为70%的乙醇溶液、洗脱剂流速为1.0 mL/min。高效液相色谱结果表明，纯化后海蜇ACE抑制肽的抑制率达到了92.18%，显著高于纯化前的69.21%（P<0.05），且IC50值为1.02 mg/mL。该研究结果为今后探究纯化后ACE抑制肽结构变化奠定了研究基础，也为海蜇ACE抑制肽作为原料开发保健食品与药品提供了科学依据。
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图 2 HP20SS大孔吸附树脂的动态吸附和解吸附曲线
注：A：上样浓度；B：上样流速；C：洗脱剂浓度；D：洗脱剂流速。
Figure 2. Dynamic adsorption and desorption curves of HP20SS macroporous adsorption resin
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图 3 对照品和海蜇ACE抑制肽上柱液高效液相色谱图
注：A：对照品；B：海蜇ACE抑制肽。
Figure 3. HPLC of reference substance and ACE inhibitory peptide from jellyfish
表 1 大孔吸附树脂静态吸附与解吸附结果比较
Table 1 Comparsion of static adsorption and desorption capacity of different hydrophobic resin
型号 孔径（A） 有效粒径（μm） 比表面积（m2/g） 吸附率（%） 解吸附率（%） HP20SS 260 63~150 600 60.48±2.91a 89.51±3.49a SP20SS 260 63~75 470 51.64±3.25bc 80.33±2.82b SP207 120 63~150 630 53.36±2.44b 79.89±4.54bc 注：同列中的不同字母代表差异显著，P<0.05；表2同。 
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表 2 纯化前后海蜇ACE抑制肽的IC50值和ACE抑制率对比分析
Table 2 IC50 value and ACE inhibition ratio of the upper column solution and the purified sample
组别 ACE抑制率（%） IC50（mg/mL） 卡托普利 93.42±2.76a 3.54×10−4 纯化前海蜇ACE抑制肽 69.21±2.09c 1.41 纯化后海蜇ACE抑制肽 92.18±1.76b 1.02
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