Inhibitory Effect of Naringin on α-Glucosidase and Its Mechanism
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摘要: 为研究柚皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，本文采用酶动力学、荧光光谱和分子对接等方法研究了柚皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制效果、抑制作用类型及其抑制作用的分子机制。柚皮素对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.174 mmol/L，显著低于阿卡波糖的0.721 mmol/L，为非竞争型抑制剂，Ki值为0.114 mmol/L；柚皮素和α-葡萄糖苷酶的结合导致了酶分子的内在荧光静态猝灭，猝灭常数为0.1598×104 L/mol，结合位点数n为1。分子对接结果显示，在氢键、离子键、疏水作用、π-π T型堆积、静电作用五种作用力的驱动下，柚皮素结合于α-葡萄糖苷酶分子的一个疏水口袋中，结合能为−7.6 kJ/mol。本文研究结果表明，柚皮素是一种较好的食源性α-葡萄糖苷酶抑制剂，在辅助治疗糖尿病功能食品中具有良好的应用前景。Abstract: To investigate the inhibitory activity and mechanism of naringin on α-glucosidase, the inhibition effect, type, and molecular mechanism of naringin on α-glucosidase were investigated by integrative analysis of enzyme kinetics, fluorescence spectroscopy and molecular docking simulation. The results showed that IC50 of naringin against α-glucosidase was 0.174 mmol/L, which was significantly lower than that of acarbose (IC50=0.721 mmol/L). The inhibition type was non-competitive inhibition with a Ki of 0.114 mmol/L. The binding of naringin and α-glucosidase led to the internal fluorescence quenching of the enzyme molecule. Furhter analysis indicated that the quenching constant was 0.1598×104 L/mol, and there was only one binding site. The molecular docking results showed that naringin was bound to a hydrophobic pocket of α-glucoside enzyme by the driving force of hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic action, π-π-T stacking, and electrostatic action, with a binding energy of −7.6 kJ/mol. The results indicated that naringin was a good food-borne α-glucosidase inhibitor, and therefore had a good application prospect in the adjuvant treatment of diabetes functional food.
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Keywords:
- naringenin /
- α-glucosidase /
- fluorescence spectroscopy /
- molecular docking /
- inhibition
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糖尿病及其并发症严重威胁人类健康，近年来发病率不断上升，已经被列为十大致死原因之一[1]。据国际糖尿病联合会（IDF）报道，截止到2019年，全球约有4.63亿各类型的糖尿病患者，而我国就有1.164亿人，居世界首位[2]。餐后高血糖是糖尿病的主要症状之一[3]，如果餐后血糖控制不好，会导致严重的并发症，因此控制餐后血糖是糖尿病患者的重要目标[4]。
α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase, EC 3.2.1.20），是一类催化碳水化合物非还原末端的 α-1,4-糖苷键水解、释放出葡萄糖的酶，主要存在于唾液和小肠刷状缘上皮细胞，对碳水化合物的消化吸收和餐后血糖起着非常重要的作用。服用α-葡萄糖苷酶抑制剂是抑制餐后血糖的有效方法。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制或非竞争性抑制等机制来抑制α-葡萄糖苷酶与底物的结合来减缓底物的降解，降低餐后血糖，从而缓解糖尿病及其症状[5-7]。《Ⅱ型糖尿病全球指南》和《中国Ⅱ型糖尿病防治指南》指出，以提高糖尿病患者当前和今后长期生活质量为目标，服用葡萄糖苷酶抑制剂是治疗Ⅱ型糖尿病的首选方法之一[1]。
α-葡萄糖苷酶抑制剂种类繁多，按照其来源大致可分为三类，即微生物源性抑制剂、化学合成类抑制剂和植物源性抑制剂[8-11]。微生物来源的主要有阿卡波糖、1-DNJ（1-脱氧野尻霉素）等；化学合成类抑制剂有吡啶2,4,6-三酮类衍生物、苯并噻唑类衍生物、1, 2 -环己二甲酸类化合物等[12-14]；植物源性抑制剂种类繁多，有黄酮类、生物碱类、多酚类、萜类、多糖等[15-18]。阿卡波糖是一种常用于研究和临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂，降糖效果较好，同时也存在一些不良反应，如硬便、便秘、腹部气胀等[19]。化学合成的米格列醇，抑制能力强，但是其副作用如软便和腹泻等相对明显[20]，天然产物类抑制剂的种类较多且研究较广，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较好且目前还尚未发现较强的副作用[21]。因此，发掘新型、高效且低副反应的天然产物类α-葡萄糖苷酶抑制剂具有重要的意义。
黄酮类化合物广泛存在于芸香科植物葡萄柚、西红柿、葡萄以及柑橘类水果中[22]，具有多种药理活性，如清除自由基、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗骨质疏松等[23]。植物源的黄酮类物质对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制作用，且副作用较小，因而备受关注[24-25]。本文以黄酮类物质柚皮苷水解后除去糖基部分的产物柚皮素（又名柚皮苷元）为研究对象，采用酶抑制动力学、荧光猝灭等研究方法，结合分子对接技术，探究了柚皮素对α-葡萄糖苷酶的体外抑制效果及其作用机制，以期为柚皮素在新型辅助降糖功能食品中的应用提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
α-葡萄糖苷酶（10 U/mg） EC 3.2.1.20，来自酿酒酵母，Sigma-Aldrich （中国上海）；柚皮素（98%）、阿卡波糖（98%） 南京源植生物有限公司（中国南京）；DMSO（二甲基亚砜） 分析纯，上海贸易有限公司；PNPG（对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷，4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside） 分析纯，上海梯希爱化成工业发展有限公司；甘油、磷酸盐标准缓冲液 分析纯，厦门海标科技有限公司；其他试剂 均为国产分析纯；溶液 均采用蒸馏水配制。
N12639-02型Multiskan FC酶标仪 中国上海赛默飞世尔仪器有限公司；970CRT型荧光分光光度计 中国上海精密科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法
参照杨丽珍等[26]的方法并稍作修改，进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定，具体操作步骤如下：在反应孔中加入160 μL PBS缓冲液（pH6），依次加入10 μL不同浓度柚皮素（1.58、1.88、2.06、2.18、2.28、2.36、2.43、2.49 mmol/L），再加入10 μL的1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。在37 ℃恒温下孵育20 min，同时37 ℃水浴PNPG溶液20 min，后在反应孔中加入20 μL PNPG溶液。PNPG可被α-葡萄糖苷酶水解为黄色且在405 nm波长处有最大吸收的对硝基苯酚。在405 nm波长下，加入PNPG后每隔2 min测定一下吸光值，共测定11次。运用线性回归法计算吸光度的斜率k，根据公式1计算不同抑制剂浓度下α-葡萄糖苷酶的相对活力，每个样品浓度重复四组，结果用均值±标准差表示，用Graphpad prism 作非线性拟合酶的相对活力与抑制剂浓度的曲线，得到IC50值。同时，采用相同的方法测定阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制效果，分析比较柚皮素的抑制效果。
α-葡萄糖苷酶(%)=K样品K对照×100 (1) 式中：K样品为样品的吸光度；K对照为空白样品的吸光度。
1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制类型的判断方法
依据姜丽丽等[27]的方法，按照1.2.1所述方法分别测定不同柚皮素浓度（0、0.077、0.154、0.231 mmol/L）在底物PNPG浓度为 0.1、0.25、0.35、0.45、0.6、0.75、0.9、1.2 mmol/L时的酶反应速度，α-葡萄糖苷酶浓度为1 U/mL，运用GraphPad Prism8.0软件进行非线性回归方法计算抑制常数，以酶促速率（1/v）对PNPG浓度的倒数（1/[S]）作图，得Lineweaver-Burk曲线图，以判断抑制类型，并计算抑制动力学参数[28]。
V=VmaxKm(1+IKi)+S(1+IαKi) (2) 式中：S是底物浓度，mmol/L；V是有抑制剂或没有抑制剂时的初始反应速度；Km为米氏常数；Vmax为最大酶速；I为抑制剂浓度，mmol/L；Ki为抑制常数；α表示抑制剂对酶与底物亲和的影响。
1.2.3 荧光光谱扫描
结合韩芬霞等[29]的方法进行荧光光谱分析，略作修改。将4 mL的α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）与1 mL不同浓度柚皮素（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）混合，在298 K条件下反应15 min后对其进行荧光光谱扫描。以287 nm为激发波长，扫描范围波长为250~550 nm。
1.2.4 分子对接实验
参考林萍等[20]的分子对接方法，进行分子对接实验。目前酿酒酵母中α-葡萄糖苷酶的三维结构未知，从NCBI下载α-葡萄糖苷酶的FASTA格式序列，本文以同源性较高的3AXH_A（相似性为72%）为模板，通过SWISS-MODEL同源建模方法来获取酵母中葡萄糖苷酶的三维结构，并使用Ramachandran plot 和Profile-3D 模型评价葡萄糖苷酶模型。从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取柚皮素的3D结构。采用AUTODOCK-Vina删除水分子和非必需子结构，通过末端处理、加氢、分配原子类型、加电荷等步骤完成受体结构的准备，使分子间相互作用的构象能最小化，分析柚皮素与α-葡萄糖苷酶的结合模式和作用力[30]。立方体网格参数为18 Å×18 Å×18Å，对接参数为x=36.877，y=−20.592，z=20.037，对接后，选用Total score最大且Cscore也较大的构象作为研究对象，随后用Pymol和Discovery Studio 2016 进行可视化作图。
1.3 数据处理
所有实验均重复处理3次，各组数据用实验结果的平均值±标准差表示，使用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，使用Prism进行作图分析。
2. 结果与分析
2.1 柚皮素对α-葡萄糖苷酶抑制效果
如图1、图2所示，在2.0~2.5mmol/L范围内柚皮素与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶均有较好的抑制作用，柚皮素和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率不同。随着柚皮素和阿卡波糖浓度的增大，α-葡萄糖苷酶的活性不断降低，呈现良好的剂量效应关系。通过Graphpad prism非线性拟合可以得出，柚皮素对α-葡萄糖苷酶的IC50值为0.174 mmol/L，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的IC50值为0.721 mmol/L。上述检测数据表明，柚皮素的抑制效果明显强于阿卡波糖，能较好抑制α-葡萄糖苷酶的活性，是一种较好的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂，因此在食品和医药领域有良好的应用前景。
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图 1 不同浓度柚皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果Figure 1. Inhibitory effect of naringin of different concentration on α-glucosidase activity![]()
图 2 不同浓度阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果Figure 2. Inhibitory effect of acarbose of different concentration on α-glucosidase activity2.2 柚皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学检测与分析
抑制剂对酶的抑制作用包括竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合非竞争抑制4种类型[31]。从Lineweaver-Burk图（如图3所示）得到1/[S]对1/v的线性回归关系，随着柚皮素浓度的增加，纵轴截距逐渐变大，且各浓度回归线基本上与x轴交于负半轴一点，即最大反应速度Vmax随抑制剂浓度的增大而减小，米氏常数Km基本上保持不变，表明抑制剂浓度增大时，底物与抑制剂可以同时与酶结合，二者并不存在竞争作用，因此柚皮素对酶的抑制作用为非竞争性抑制。根据式2，柚皮素的抑制常数Ki为0.114 mmol/L。
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图 3 柚皮素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk图Figure 3. Lineweaver-Burk plot for the inhibition of α-glucosidase by naringenin2.3 柚皮素作用下α-葡萄糖苷酶的荧光光谱变化
荧光光谱是研究多酚类物质与蛋白质相互作用的一种有效方法，可以用来计算结合常数、结合位点和热力学参数等[32]。α-葡萄糖苷酶具有内源性荧光发色团，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，都属于芳香族氨基酸[33]。由图4可以看出，激发波长为287 nm时，α-葡萄糖苷酶的最大发射波长为365.4 nm，在柚皮素浓度从0～0.1 mg/mL增加的过程中，α-葡萄糖苷酶的荧光强度呈规律性减小，说明α-葡萄糖苷酶的内源性荧光不同程度地被猝灭剂所猝灭，且在猝灭过程中最大发射波长由365.4 nm红移到了381.4 nm，红移量为16 nm（±1 nm）。
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图 4 在298 K下柚皮素对α-葡萄糖苷酶荧光的猝灭作用Figure 4. Quenching effects of naringenin on the fluorescence of α-glucosidase at 298 K研究表明，荧光猝灭主要有三种形式，分别为非辐射能量转移、静态淬灭和动态淬灭[34]，猝灭过程可以采用如下Stern-Volmer方程（公式（3））进行判断[35]：
F0F=Kqτ0[Q]+1=1+Ksv[Q] (3) 式中：F0与F分别为未加入与加入猝灭剂后体系的荧光强度（au）；[Q]为猝灭剂浓度（mol/mL）；τ0是无猝灭剂时物质的荧光平均寿命/s，一般生物大分子的荧光平均寿命为1×10−8 S；Kq为荧光猝灭速率常数（L/（mol·s）），Ksv为荧光猝灭常数（L/mol）。
利用公式3对图5中的数据进行线性拟合计算，结果如图5所示，由斜率可得出荧光猝灭常数Ksv为0.1598×104 L/mol；荧光猝灭速率常数Kq为1.598×1011 （mol·L−1）−1·S−1，此Kq值大于生物大分子的最大散射碰撞猝灭速率常数2×1010 （mol·L−1）−1·S−1，此外，动态猝灭并不会影响荧光物质的吸收光谱，而基态配合物的形成会使荧光物质的吸收光谱发生变化，即红移现象的产生[36]。由此可进一步判断出柚皮素猝灭α-葡萄糖苷酶的过程不是由分子碰撞引起的动态猝灭，而是形成复合物的静态猝灭过程。
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图 5 柚皮素猝灭α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer图Figure 5. Stern-Volmer plots for quenching of α-glucosidase by naringenin基于上述分析，本文以lg[（F0−F）/F]为Y轴、lg[Q]为X轴，对检测数据进行了进一步的双对数回归分析其中，斜率=结合位点数，纵轴截距=lgKA，结果如图6所示。根据曲线对应的公式4，计算出柚皮素与α-葡萄糖苷酶的结合位点数n约为0.998，说明柚皮素与α-葡萄糖苷酶所形成的复合物中二者的比例接近1:1，即α-葡萄糖苷酶上与柚皮素只有一个结合位点。
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图 6 柚皮素对α-葡萄糖苷酶在298K时猝灭的lg（F0−F）/F与lg[Q]曲线Figure 6. lg（F0−F）/F versus lg[Q] curve for the naringenin/α-glucosidase system at 298Klg(F0−F)F=lgKa+nlg[Q] (4) 式中：F0与F分别为未加入与加入猝灭剂后体系的荧光强度（au）；[Q]为α-葡萄糖苷酶的浓度（mol/mL）；Ka为荧光剂与猝灭剂的表观结合常数（L/mol）；n为结合位点数。
2.4 分子对接分析柚皮素与α-葡萄糖苷酶分子间的相互作用
上述研究可知，柚皮素与α-葡萄糖苷酶发生非竞争性抑制，且柚皮素与α-葡萄糖苷酶只有一个结合位点，因此可以推测柚皮素分子结合于α-葡萄糖苷酶的非活性中心[37-40]。为了进一步确定柚皮素在α-葡萄糖苷酶上的结合，以同源性较高的3AXH_A（相似性为72%）为模板进行同源建模。图7为α-葡萄糖苷酶的同源建模拉氏图，氨基酸大多位于“允许区”，结构可信。图8为柚皮素和阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶对接结果，阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶的活性位点结合，而柚皮素与阿卡波糖在α-葡萄糖苷酶上结合位点的位置不同，柚皮素与α-葡萄糖苷酶进行分子对接的结合位点为非活性位点。从分子水平表明柚皮素与α-葡萄糖苷酶结合位点位于非竞争域，并非活性位点，属于非竞争性抑制，与动力学结果一致。
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图 8 柚皮素与α-葡萄糖苷酶的结合位点及活性位点的相对位置注：紫色：阿卡波糖；蓝色：柚皮素。Figure 8. Binding site of naringin and α-glucosidase and the relative position of the active site图9为柚皮素与α-葡萄糖苷酶的三维相互作用，图10为柚皮素在α-葡萄糖苷酶同源模型结合袋中的二维相互作用，可以看出柚皮素在氢键、离子键、疏水作用、π-π T型堆积、静电作用五种作用力下与α-葡萄糖苷酶结合。表1为柚皮素与α-葡萄糖苷酶的结合位点分析，柚皮素与氨基酸ASN 314、ASP 429形成氢键，其中氨基酸残基ASN 314的作用距离为1.93Å，是柚皮素与α-葡萄糖苷酶结合过程中最重要且稳定的氢键，增加了结合程度。另外，柚皮素与氨基酸THR 234形成共价结合Pi-Sigma作用；与氨基酸ILE415、ILE416形成疏水结合Pi-Alkyl作用；与氨基酸PHE 420形成共价结合Pi-Pi T-shaped作用，是一种同氢键同样重要的相互作用；与氨基酸ASP 232形成静电结合Pi-Anion作用，是一种新型非共价弱相互作用（见表1）。分子对接结果显示，在氢键、离子键、疏水作用、π-π T型堆积、静电作用五种作用力的驱动下，柚皮素结合于α-葡萄糖苷酶分子的一个疏水口袋中，这种非竞争性的结合阻碍了酶分子与其底物的结合，因此对该酶的活性产生了较强的抑制作用。
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图 9 柚皮素与α-葡萄糖苷酶同源模型的三维相互作用示意图Figure 9. Schematic diagram of 3-D interaction between naringenin and α-glucosidase homologous model表 1 柚皮素与α-葡萄糖苷酶结合的作用力及结合能Table 1. Driving forces and binding energy of the interaction between naringenin and α-glucosidase作用力 作用位点 作用距离 结合能 氢键 ASN 314 1.93Å −7.6 kJ/mol ASP 429 2.36Å 离子键Pi-Sigma THR 234 3.4 Å 疏水结合Pi-Alkyl ILE415 3.45Å ILE416 4.65、5.13Å 共价结合π-π T型堆积 PHE 420 4.53、4.84 Å π-阴离子作用 ASP 232 4.72Å ![]()
图 10 柚皮素在α-葡萄糖苷酶同源模型结合袋中的二维相互作用示意图Figure 10. Schematic diagram of 2-D interactions of naringenin in the binding pocket of the developed homology model of α-glucosidase3. 讨论
α-葡萄糖苷酶，对碳水化合物的消化吸收和餐后血糖起着非常重要的作用，服用α-葡萄糖苷酶抑制剂是治疗Ⅱ型糖尿病的首选方法之一[1]。
植物源性的α-葡萄糖苷酶抑制剂种类较多，有黄酮类、生物碱类、多酚类、萜类、多糖等[12-15]，是目前的研究热点之一，研究主要集中在筛选、抑制动力学及抑制作用机理等方面[25-26]。朱娟娟等[41]基于α-葡萄糖苷酶-PNPG体外反应体系，建立了微量、快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，并采用Lineweaver-Burk Plots、Eadie-Hofstee Plots、Hanes-Wolff Plots、Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots、Non-linear Regression Analysis五种方法对该酶促反应的动力学数据进行了详细的分析，阐述了这五种方法的主要优缺点，为α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选提供了依据。王文玲等[42]研究珊瑚真菌OUCMDZ-3658的发酵产物3、4对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，活性与阳性药阿卡波糖相当，IC50值分别为0.87、1.14和1.11 mmol/L。张慧等[43]研究了戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，IC50为1.95 mmol/L。户晶晶等[44]的研究分析了Mn6对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，计算出其抑制常数为0.156和0.319 mmol/L，为竞争型抑制。严晓琳等[45]研究表明灯盏花艺素对 α-葡萄糖苷酶的半数抑制率( IC50 )为 0. 498 mmol/L。猝灭常数表示处于激发态的荧光分子与猝灭剂分子碰撞激活过程引起的荧光猝灭程度大小的一个常数，反映两种衰变途径之间的竞争, 是双分子猝灭常数与单分子衰变速率常数的比值[46]。本文的检测数据显示，柚皮素对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.174 mmol/L，显著低于目前临床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖（0.721 mmol/L），柚皮素的抑制常数为0.114 mmol/L，为非竞争型抑制剂，表明柚皮素是一种强效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有很好的应用前景。
汪大伟等[47]的研究表明，山奈酚和α-葡萄糖苷酶之间形成了氢键、疏水作用及范德华力等非共价键作用力，这些作用力对于维系蛋白受体-配体复合物构象的稳定和小分子对酶的抑制效应发挥着非常重要的作用。林萍等[48]的研究表明π-π T型堆积相互作用对化合物的抑制活性有显著影响，π-π T型堆积越多，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用越强。本文的分子对接结果显示，在氢键、离子键、疏水作用、π-π T型堆积、静电作用五种作用力的共同驱动下，柚皮素结合于α-葡萄糖苷酶分子的一个疏水口袋中，而非酶的催化活性腔中，结合能为-7.6 kJ/mol，这与荧光猝灭实验结果一致。
4. 结论
柚皮素通过非竞争性抑制的方式来抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50为0.174 mmol/L，显著低于阿卡波糖；荧光猝灭分析结果表明，柚皮素可与α-葡萄糖苷酶结合生成复合物，结合位点数为1，属于静态猝灭过程；分子对接结果显示，柚皮素结合于α-葡萄糖苷酶分子的一个疏水口袋中，属于非竞争性抑制剂，两者的结合由氢键、离子键、疏水作用、π-π T型堆积、静电作用五种作用力驱动。在实验过程中发现柚皮素微溶于水甚至不溶于水，因此在今后开发利用柚皮素时还需进一步优化生物利用度等方面。为了进一步阐明柚皮素对α-葡萄糖苷酶的结合过程和抑制作用机理，本实验室后期将采用分子动力学模拟技术进行深入研究和探索，为其在降糖药物和辅助降血糖功能食品中的推广应用提供依据。
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图 1 不同浓度柚皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果
Figure 1. Inhibitory effect of naringin of different concentration on α-glucosidase activity
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图 2 不同浓度阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果
Figure 2. Inhibitory effect of acarbose of different concentration on α-glucosidase activity
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图 3 柚皮素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk图
Figure 3. Lineweaver-Burk plot for the inhibition of α-glucosidase by naringenin
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图 4 在298 K下柚皮素对α-葡萄糖苷酶荧光的猝灭作用
Figure 4. Quenching effects of naringenin on the fluorescence of α-glucosidase at 298 K
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图 5 柚皮素猝灭α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer图
Figure 5. Stern-Volmer plots for quenching of α-glucosidase by naringenin
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图 6 柚皮素对α-葡萄糖苷酶在298K时猝灭的lg（F0−F）/F与lg[Q]曲线
Figure 6. lg（F0−F）/F versus lg[Q] curve for the naringenin/α-glucosidase system at 298K
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图 8 柚皮素与α-葡萄糖苷酶的结合位点及活性位点的相对位置
注：紫色：阿卡波糖；蓝色：柚皮素。
Figure 8. Binding site of naringin and α-glucosidase and the relative position of the active site
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图 9 柚皮素与α-葡萄糖苷酶同源模型的三维相互作用示意图
Figure 9. Schematic diagram of 3-D interaction between naringenin and α-glucosidase homologous model
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图 10 柚皮素在α-葡萄糖苷酶同源模型结合袋中的二维相互作用示意图
Figure 10. Schematic diagram of 2-D interactions of naringenin in the binding pocket of the developed homology model of α-glucosidase
表 1 柚皮素与α-葡萄糖苷酶结合的作用力及结合能
Table 1 Driving forces and binding energy of the interaction between naringenin and α-glucosidase
作用力 作用位点 作用距离 结合能 氢键 ASN 314 1.93Å −7.6 kJ/mol ASP 429 2.36Å 离子键Pi-Sigma THR 234 3.4 Å 疏水结合Pi-Alkyl ILE415 3.45Å ILE416 4.65、5.13Å 共价结合π-π T型堆积 PHE 420 4.53、4.84 Å π-阴离子作用 ASP 232 4.72Å 
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