Extraction of Anthraquinone from Fermented Morinda officinalis and Its Antioxidant and Hypoglycemic Activities
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摘要: 目的：优化发酵巴戟天蒽醌的提取工艺，并评价其抗氧化和降血糖活性。方法：以蒽醌提取率为指标，通过响应面法确定最佳提取工艺；测定蒽醌对DPPH自由基、OH自由基和超氧阴离子的清除能力来评价体外抗氧化活性；测定蒽醌对线虫寿命和运动能力的影响来评价体内抗氧化活性；测定蒽醌对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率来评价体外降血糖活性；测定蒽醌对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响来评价体内降血糖活性。结果：蒽醌最佳提取工艺为乙醇体积分数45%、料液比1:41 (g/mL)、提取温度65 ℃、提取时间1.60 h，在此工艺下蒽醌提取率为90.37%。蒽醌在体外对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子具有良好的清除能力；在体内能显著延长线虫的寿命（P<0.05），增强线虫的运动能力。蒽醌对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值分别为0.588 mg/mL和0.575 mg/mL；在1.2 mg/mL蒽醌组中IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量较模型组细胞极显著提高47.42%（P<0.01）。结论：发酵巴戟天蒽醌具有良好的抗氧化和降血糖活性，为治疗糖尿病的天然药物的开发提供基础数据。Abstract: Objective: Optimization of the extraction process of anthraquinone from fermented Morinda officinalis and investigated its antioxidant and hypoglycemic activities. Methods: Taking the extraction ratio of anthraquinone as the evaluation index, the optimal conditions were obtained by response surface methodology. In vitro, the antioxidant activity was evaluated by determining the scavenging ability of anthraquinone against DPPH free radical, hydroxyl free radical and superoxide anion assays. In vivo, the antioxidant activity was evaluated by measuring the effect of anthraquinone on the life span and motility of Caenorhabditis elegans. The hypoglycemic activity in vitro was evaluated by determining the inhibition rate of anthraquinone against alpha-glucosidase and alpha-amylase. The hypoglycemic activity in vivo was evaluated by measuring the effect of anthraquinone on glucose consumption of IR-HepG2 cells. Results: The optimal conditions were obtained as follows: ethanol concentration, 45%; solid-to-solvent ratio, 1:41 (g/mL); temperature, 65 ℃; and time, 1.60 h. Under these conditions, the extraction ratio of anthraquinone was 90.37%. In the antioxidant assay in vitro, anthraquinone exhibited good scavenging ability against DPPH free radicals, hydroxyl free radicals, and superoxide anions. In the antioxidant assay in vivo, anthraquinone significantly prolonged the life span (P<0.05), and enhanced the motility of Caenorhabditis elegans (P<0.05). The IC50 values of anthraquinone on alpha-amylase and alpha-glucosidase were 0.588 and 0.575 mg/mL, respectively. Glucose consumption of IR-HepG2 cells in the anthraquinone group (1.2 mg/mL) was increased by 47.42% compared with the model group. Conclusion: The anthraquinone from fermented Morinda officinalis exhibited good antioxidant and hypoglycemic activities, facilitating the development of natural therapeutic agents for diabetes treatment.
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Keywords:
- Morinda officinalis /
- anthraquinone /
- extraction /
- anti-oxidation /
- hypoglycemic activity /
- fermentation
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糖尿病是世界性三大疾病之一，全球糖尿病患者90%以上属于Ⅱ型糖尿病[1]。在Ⅱ型糖尿病早期，胰岛素抵抗细胞从血液中摄取葡萄糖的能力下降，导致人体血糖水平升高[2]。α-葡萄糖苷酶将食物中的碳水化合物水解成葡萄糖，通过酶抑制剂减缓葡萄糖生成来降低餐后血糖水平被认为是治疗Ⅱ型糖尿病的有效手段。当前的α-葡萄糖苷酶抑制剂容易导致胃肠道功能絮乱、食欲减退等副作用，故天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂开发已经成为国内外科研人员的研究热点[3-4]。
Ⅱ型糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗引起的代谢性疾病。Ⅱ型糖尿病的发生与氧化应激具有密切关联，当过多的自由基在体内积累时会引发氧化应激反应，对胰岛β细胞造成氧化损伤和胰岛素抵抗[5]。抗氧化剂能淬灭糖尿病患者体内的自由基，改善氧化应激，进而治疗Ⅱ型糖尿病。因此，具有抗氧化能力的活性物质是治疗Ⅱ型糖尿病的潜力资源。
巴戟天（Morinda officinalis How.）是茜草科巴戟属双子叶植物巴戟天的干燥根，具有抗氧化[6]、降血糖[7]、抗炎[8]、抗癌[9]和治疗阳痿遗精[10]等多种功效，在我国可用于保健食品中。研究表明巴戟天中主要的活性物质有蒽醌类、糖类、环烯醚萜类、生物碱类、黄酮类、氨基酸类、挥发性成分和微量元素[11-12]。巴戟天的炮制方式主要有盐制、煮制、蒸制、酒制、甘草水制和发酵法等[13]。发酵法较其他方法具有多种优势，如微生物在发酵过程中代谢生成的酶类会溶解植物细胞壁，有助于物质的释放，进而提高活性物质的得率[13]。DU-106是本课题组从传统发酵奶酪中筛选出的一株益生菌，经鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）[14]。课题组前期使用DU-106发酵巴戟天，发现提取出的蒽醌含量要显著高于未发酵的巴戟天[13]。目前对发酵法炮制巴戟天的研究较少，对发酵巴戟天蒽醌的提取、抗氧化及降血糖功效的研究更鲜有报道。本试验利用响应面法优化发酵巴戟天蒽醌的提取工艺，对其抗氧化和降血糖活性进行初步研究，旨在更加有效的利用巴戟天资源，为开发发酵巴戟天蒽醌作为药物治疗Ⅱ型糖尿病提供一定的数据支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
巴戟天（已抽芯） 购买于广东省云浮市郁南县大方镇巴戟天市场，华南农业大学食品学院杜冰教授鉴定为茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根；产乳酸芽孢杆菌DU-106（筛选于传统发酵奶酪，并委托广州市微生物所制成1×1012 CFU/g菌粉）、野生N2型秀丽隐杆线虫 由华南农业大学新资源食品与功能性原料评价及研究中心保藏并提供；HepG2细胞 购买于中国科学院细胞库；1,8-二羟基蒽醌（≥99.5%） 广州分析测试中心科力技术开发公司；阿卡波糖 齐云生物试剂有限公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、α-淀粉酶（1000 U/mg）、牛胰岛素、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 美国Sigma公司；盐酸二甲双胍 贵州天安药业股份有限公司；葡萄糖测定试剂盒 上海荣盛生物药业有限公司；四甲基偶氮唑盐 美国Amresco公司；CCK-8试剂 广州松鼠生物科技有限公司；DMEM高糖培养基 美国Gibco公司。
VarioskanTM LUX多功能酶标仪、Countess II细胞计数仪 美国Thermo Fisher公司；ScanSpeed 40真空冷冻干燥机 丹麦LaboGene公司；UV759紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；BPNZ-300CD CO2细胞培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备
取0.10 g芽孢杆菌DU-106菌粉溶于50 mL生理盐水中，在37 ℃、160 r/min条件下振荡30 min得到活化液。巴戟天用100 ℃清水煮制20 min后，取150 g置于发酵培养基（含2%葡萄糖和1% NaCl）中，接种1 mL芽孢杆菌活化液，于30 ℃发酵12 d[11]。取出巴戟天，于60 ℃烘干24 h，粉碎后过20目筛，即得发酵巴戟天样品。
1.2.2 发酵巴戟天蒽醌提取
将发酵巴戟天样品加到一定量的乙醇溶液中，在一定温度和时间下进行提取，得到样品提取液。提取液在4000 r/min条件下离心15 min，取上清液在60 ℃下进行减压浓缩，再将浓缩后的溶液冷冻干燥备用。
1.2.3 单因素实验
以蒽醌提取率为指标，考察不同乙醇体积分数、料液比、提取温度及提取时间对发酵巴戟天蒽醌提取效率的影响。四个单因素设计方案如下：梯度乙醇体积分数为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%，料液比为1:40 （g/mL），提取温度为65 ℃，提取时间为1.5 h；梯度料液比为1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50 （g/mL），乙醇体积分数为45%，提取温度为65 ℃，提取时间为1.5 h；梯度提取温度为50、55、60、65、70 ℃，乙醇体积分数为45%，料液比为1:40 （g/mL），提取时间为1.5 h；梯度提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，乙醇体积分数为45%，料液比为1:40 （g/mL），提取温度为65 ℃。
1.2.4 响应面优化试验
在单因素实验基础上进行响应面优化，每个因素设计三个水平，蒽醌提取率为响应值。试验因素和水平见表1。
表 1 响应面试验因素和水平表Table 1. Factors and levels of response surface methodology因素 水平 −1 0 1 A 乙醇体积分数（%） 40 45 50 B 料液比（g/mL） 1:35 1:40 1:45 C 提取温度（℃） 60 65 70 D 提取时间（h） 1.0 1.5 2.0 1.2.5 发酵巴戟天蒽醌测定
采用0.5%醋酸镁-甲醇法测量蒽醌含量[13]，标准曲线方程为：y=1.9508x+0.0011，R2=0.999（n=7）。取1 g发酵巴戟天样品，按照单因素实验方法提取蒽醌，根据标准曲线测定蒽醌。蒽醌提取率计算公式如式（1）。
蒽醌提取率(%)=M1M2×100 (1) 式中：M1为提取所得蒽醌质量，mg；M2为发酵巴戟天中蒽醌质量，mg。
1.2.6 体外抗氧化活性测定
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定
取2 mL样品溶液（1~5 mg/mL）于试管中，加入2 mL DPPH无水乙醇溶液（0.1 mmol/L），混匀，在室温下放置反应30 min后，517 nm处测定吸光值[15]。VC作为阳性对照，计算公式如式（2）。
DPPH自由基清除率(%)=(1−A1−A2A0)×100 (2) 式中：A0为DPPH+无水乙醇的吸光值；A1为样品+DPPH的吸光值；A2为样品+无水乙醇的吸光值。
1.2.6.2 羟自由基清除能力测定
取2 mL样品溶液（1~5 mg/mL）于试管中，加入2 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）和2 mL H2O2溶液（6 mmol/L），混匀，在室温下避光反应10 min后，加入2 mL水杨酸溶液（6 mmol/L），510 nm处测定吸光值[16]。VC作为阳性对照，计算公式如式（3）。
羟自由基清除率(%)=(1−B1−B2B0)×100 (3) 式中：B0为FeSO4+H2O2+水杨酸的吸光值；B1为样品+FeSO4+H2O2+水杨酸的吸光值；B2为样品+FeSO4+H2O2的吸光值。
1.2.6.3 超氧阴离子清除能力测定
取4 mL样品溶液（1~5 mg/mL）于试管中，加入5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2），混匀，在25 ℃水浴15 min后，加入0.15 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液反应4 min，320 nm处测定吸光值[17]。VC作为阳性对照，计算公式同式（2）。其中，A0为Tris-HCl缓冲液+邻苯三酚的吸光值；A1为样品+Tris-HCl缓冲液+邻苯三酚的吸光值；A2为样品+Tris-HCl缓冲液的吸光值。
1.2.7 体内抗氧化活性测定
1.2.7.1 线虫同期化
用M9缓冲液冲洗含有产卵期线虫的培养基，无菌EP管收集洗得的液体，涡旋30 s，4000 r/min离心1 min，弃上清液。每管加入1 mL线虫裂解液（ddH2O、2 mol/L NaOH溶液和60% NaClO溶液按照1:1:1的比例混合），涡旋1 min后静置5 min，4000 r/min离心1 min，弃上清液。用M9缓冲液重复清洗2次，转移到线虫培养基（含OP50大肠杆菌）中，20 ℃培养48 h得到同期化L4期线虫。
1.2.7.2 线虫寿命测定
挑选L4期线虫进行实验，分为空白组和实验组（蒽醌浓度1.2、2.4、4.8 mg/mL），每组设置3板，每板30条[18]。20 ℃恒温培养，每2 d记录线虫的寿命，直至最后一条线虫死亡即实验结束。
1.2.7.3 线虫运动能力测定
线虫培养同线虫寿命培养方法。从空白组和实验组中分别挑选15条状态较好、培养时间为3 d的线虫转移到新的线虫培养基中，在线虫恢复运动2 min后，记录每分钟线虫头部摆动的次数及20 s内线虫身体弯曲的总次数。
1.2.8 酶抑制率测定
1.2.8.1 α-葡萄糖苷酶抑制率测定
取10 μL样品溶液（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL）于试管中，加入10 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），混匀，置于37 ℃恒温培养箱中反应15 min后，加入20 μL PNPG溶液，混匀，用塑料膜密封并置于37 ℃恒温培养箱中反应30 min，最后加入80 μL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，405 nm处测定吸光值[19]。阿卡波糖为阳性对照，计算公式如式（4）。
抑制率(%)=(1−C1−C2C3−C4)×100 (4) 式中：C1为样品+α-葡萄糖苷酶+PNPG的吸光值；C2为样品+PNPG的吸光值；C3为α-葡萄糖苷酶+PNPG的吸光值；C4为PNPG的吸光值。
1.2.8.2 α-淀粉酶抑制率测定
取0.5 mL α-淀粉酶溶液（1 U/mL）于试管中，加入0.5 mL样品溶液（0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL），混匀，置于37 ℃恒温箱中10 min。加入0.5 mL 1%淀粉溶液，混匀，在37 ℃下反应10 min后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS），沸水浴中反应5 min后立即冰浴，冷却后用去离子水稀释并在520 nm处测定吸光值[4]。阿卡波糖为阳性对照，计算公式同式（4）。其中，C1为样品+α-淀粉酶+1%淀粉的吸光值；C2为样品+1%淀粉的吸光值；C3为α-淀粉酶+1%淀粉的吸光值；C4为1%淀粉的吸光值。
1.2.9 胰岛素抵抗细胞模型的建立
HepG2细胞用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长且细胞覆盖率超过80%后，PBS清洗3次后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代[20]。取生长状态良好且处于对数生长期的细胞，用含10 μg/mL胰岛素的DMEM培养基培养24 h，建立胰岛素抵抗HepG2（IR-HepG2）细胞模型。IR-HepG2细胞培养使用无血清无酚红DMEM专用高糖培养基，待细胞贴壁覆盖率达到80%后，测定上清液中葡萄糖浓度。通过比较正常细胞与模型细胞组中葡萄糖消耗量来判断造模是否成功，造模成功后调整IR-HepG2细胞密度为1×105 个/mL用于后续试验。
1.2.10 IR-HepG2细胞活性测定
取对数期IR-HepG2细胞，以每孔100 μL接种至96孔细胞培养板中，培养至细胞贴壁覆盖率达到80%后，加入100 μL蒽醌溶液（0.5、1、2、4、8 mg/mL），每个浓度设置6个复孔，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育2 h后在450 nm处测定吸光值[20]。细胞存活率计算公式如式（5）。
细胞存活率(%)=D1−D0D2−D0×100 (5) 式中：D0为CCK-8溶液的吸光值；D1为细胞+蒽醌+CCK-8溶液的吸光值；D2为细胞+CCK-8溶液的吸光值。
1.2.11 IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量测定
分为模型组、正常组、阳性对照组和实验组。取对数期IR-HepG2细胞，以每孔200 μL接种至96孔细胞培养板中，实验组加入100 μL蒽醌溶液（0.6、1.2 mg/mL），模型组加入100 μL DMEM培养基，阳性对照组加入100 μL二甲双胍溶液使最终浓度为1 mg/mL。正常组为对数期HepG2细胞，其余操作同模型组[21]。每个浓度设置6个复孔，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖消耗量。
1.3 数据处理
试验至少进行3次平行。使用SPSS 22进行方差分析，Origin 9.1进行可视化处理。利用Duncan法进行显著性差异分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验分析
乙醇体积分数对蒽醌提取率的影响如图1a所示，在乙醇体积分数20%~50%范围内，蒽醌提取率曲线呈先上升后下降趋势。这可能是当乙醇体积分数较大时，溶液极性减弱使得更多的脂溶性、醇溶性杂质被释放出来，与蒽醌组分竞争而降低其纯度[22]。在乙醇体积分数为45%时，蒽醌提取率最高，且与其他水平存在显著性差异（P<0.05），故确定最佳乙醇体积分数为45%。
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图 1 单因素对蒽醌提取率的影响注：图中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 1. The effect of single factor on the extraction ratio of anthraquinone料液比对蒽醌提取率的影响如图1b所示，在料液比1:20~1:40 （g/mL）范围内，蒽醌提取率曲线呈上升趋势，这是由于在一定范围内随着料液比的升高会使巴戟天细胞壁内外浓度差增大，从而提高蒽醌提取率[23]。在料液比1:40~1:50 （g/mL）范围内，蒽醌提取率曲线趋于平稳，故确定最佳料液比为1:40 （g/mL）。
提取温度对蒽醌提取率的影响如图1c所示，在温度50~70 ℃范围内，蒽醌提取率曲线呈先上升后下降趋势。随着温度的升高，溶剂渗透能力会得到一定的增强，有利于蒽醌的提取。但温度过高，会导致蒽醌的分子结构被破坏，从而导致提取率降低[24]。在温度为65 ℃时，蒽醌的提取率最高，且与其他水平差异显著（P<0.05），故确定最佳提取温度为65 ℃。
提取时间对蒽醌提取率的影响如图1d所示，在提取时间0.5~2.5 h范围内，蒽醌提取率曲线呈先上升后下降趋势。这可能是由于长时间的高温提取使蒽醌的结构受到一定的破坏，产生较多的杂质，进而影响蒽醌的提取率[25]。在提取时间为1.5 h时，蒽醌提取率达到最高点，故确定最佳提取时间为1.5 h。
2.2 响应面回归模型建立
以单因素结果为依据，进行Box-Behnken响应面分析试验，试验设计及结果见表2。利用Design-Expert对表2中的变量和蒽醌提取率响应值作多元回归拟合，回归方程见公式（6）。
表 2 Box-Behnken响应面试验设计与结果Table 2. Design and results of Box-Behnken response surface test试验号 A
乙醇体积分数B
料液比C
提取温度D
提取时间Y
蒽醌提取率（%）1 0 −1 0 −1 60.34 2 1 0 −1 0 70.78 3 −1 0 0 −1 78.35 4 1 1 0 0 75.54 5 0 0 1 −1 70.32 6 0 0 0 0 89.56 7 1 0 0 −1 64.61 8 1 −1 0 0 60.93 9 0 0 −1 −1 74.79 10 0 −1 1 0 60.35 11 0 0 0 0 90.49 12 1 0 0 1 77.67 13 0 −1 0 1 70.21 14 −1 0 1 0 66.71 15 −1 −1 0 0 63.17 16 0 1 0 −1 73.43 17 0 0 0 0 88.49 18 0 1 1 0 75.44 19 −1 1 0 0 71.11 20 0 0 1 1 78.68 21 0 1 0 1 76.91 22 −1 0 −1 0 73.56 23 0 1 −1 0 71.93 24 0 −1 −1 0 70.34 25 0 0 0 0 91.01 26 −1 0 0 1 75.31 27 0 0 0 0 90.37 28 0 0 −1 1 75.37 29 1 0 1 0 70.15 Y=89.98−0.71A+4.92B−1.26C+2.69D+1.67AB+1.56AC+4.02AD+3.37BC−1.60BD+1.94CD−10.09A2−12.36B2−8.77C2−6.58D2 (6) 由表3可知，回归模型的R²Adj为0.9522，P值小于0.0001表明模型极显著，失拟项不显著（P>0.05），说明得到的回归模型与实际结果拟合良好。影响蒽醌提取率的因素排列顺序为：料液比（B）>提取时间（D）>提取温度（C）>乙醇体积分数（A）。
表 3 回归模型方差分析表Table 3. Analysis of variance table for the regression model变异来源 平方和 自由度 方差 F值 P值 显著性 模型 2177.97 14 155.57 40.81 < 0.0001 *** A-乙醇体积分数 6.06 1 6.06 1.59 0.2279 B-料液比 290.28 1 290.28 76.15 < 0.0001 *** C-提取温度 19.05 1 19.05 5 0.0422 * D-提取时间 86.99 1 86.99 22.82 0.0003 *** AB 11.12 1 11.12 2.92 0.1097 AC 9.67 1 9.67 2.54 0.1335 AD 64.80 1 64.8 17 0.0010 ** BC 45.56 1 45.56 11.95 0.0038 ** BD 10.21 1 10.21 2.68 0.1240 CD 15.13 1 15.13 3.97 0.0662 A2 660.26 1 660.26 173.2 < 0.0001 *** B2 991.39 1 991.39 260.06 < 0.0001 *** C2 499.22 1 499.22 130.95 < 0.0001 *** D2 280.55 1 280.55 73.59 < 0.0001 *** 残差 53.37 14 3.81 失拟项 49.50 10 4.95 5.12 0.0648 纯误差 3.87 4 0.9674 总离差 2231.34 28 注：*差异显著（P<0.05）；**差异高度显著（P<0.01）；***差异极显著（P<
0.001）。2.3 各因素交互效应分析
为了研究各因素对蒽醌提取率的影响，绘制的响应面图见图2。响应面坡度可以反映两个因素交互作用对响应值的影响程度，坡度越陡则表示影响越大。等高线形状反映两个因素交互作用的显著性，椭圆形表示交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著[26]。图2c、d中的曲面较陡峭，对应的等高线形状呈椭圆形，表明乙醇体积分数和提取时间、料液比和提取温度两两因素之间的交互作用对蒽醌提取率的影响较大，这与表3中的方差分析数据一致。
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图 2 各因素交互作用对蒽醌提取率影响的响应面和等高线图Figure 2. Response surface and contour lines plots of effects of interaction between each factors on the extraction ratio of anthraquinone2.4 模型验证
回归模型预测蒽醌的最佳提取工艺为乙醇体积分数45.08%、料液比1:40.93 （g/mL）、提取温度64.93 ℃、提取时间1.59 h，在此工艺条件下蒽醌的提取率为90.69%。为了便于实际操作，调整为乙醇体积分数45%、料液比1:41 （g/mL）、提取温度65 ℃、提取时间1.60 h，运用调整后的工艺条件进行实验验证，蒽醌提取率为90.37%，与预期值契合度较高，表明建立的回归模型可以用来预测发酵巴戟天中蒽醌的提取率。崔瀚元等[27]利用响应面优化决明子蒽醌的提取工艺，蒽醌提取率为74.51%。这表明本实验中的提取工艺可以用来提取发酵巴戟天蒽醌，且提取出的蒽醌提取率较高。
2.5 蒽醌体外抗氧化活性
植物药中蒽醌多以羟基蒽醌存在，往往具有抗氧化活性[28]。如PONGNARAVANE等[29]从海巴戟（Morinda citrifolia）中提取蒽醌，发现其具有较好的DPPH自由基清除能力。图3中，发酵巴戟天蒽醌对DPPH自由基、OH自由基和超氧阴离子表现出一定的清除能力，且清除效果随着浓度的增加而增强，当发酵巴戟天蒽醌浓度为5 mg/mL时对DPPH自由基、OH自由基和超氧阴离子的清除率分别为74.18%、85.48%和90.24%。虽然比相同浓度的VC对三种自由基的清除率要弱，但后续可通过提升纯度或与其他抗氧化成分互配来进一步增强其抗氧化能力。
2.6 蒽醌体内抗氧化活性
秀丽隐杆线虫具有生命周期短、繁殖能力强、易于计数等优点，是研究抗氧化活性的理想模式生物[30]。线虫的氧化系统失衡会导致其衰老和运动能力下降，因此可通过线虫的寿命和运动能力来评价其抗氧化能力。由表4可知，在蒽醌浓度1.2、2.4和4.8 mg/mL组中线虫的平均寿命分别为12.43、13.67和15.25 d，较空白组线虫寿命分别延长7.71%（P<0.05）、18.46%（P<0.01）和32.15%（P<0.001），且线虫的最长寿命也从空白组的19.67 d分别延长至21.45（P<0.05）、23.05（P<0.01）和26.76（P<0.001） d，表明蒽醌能显著延长线虫的平均寿命和最长寿命。头部摆动频率和身体弯曲频率可用来评估线虫的运动能力。在图4b中，较空白组，蒽醌浓度1.2、2.4和4.8 mg/mL组中线虫每分钟头部摆动频率分别提高了4、9（P<0.05）和18（P<0.01）次；在图4c中，蒽醌浓度1.2、2.4和4.8 mg/mL组中线虫每20秒身体弯曲频率较空白组分别提高了2、7（P<0.05）和13（P<0.01）次。结果表明蒽醌能显著增强线虫的运动能力，且呈剂量依赖关系。LUO等[31]证明具有抗氧化能力的橄榄叶提取物能显著延长线虫的寿命。这与本实验的研究结果一致，发酵巴戟天蒽醌能显著延长线虫的寿命和增强线虫的运动能力，推测是提升了线虫的抗氧化应激能力。
表 4 蒽醌对线虫寿命的影响Table 4. Effects of anthraquinone on the life span of C. elegans蒽醌浓度（mg/mL） 平均寿命（d） 最长寿命（d） 平均寿命延长率（%） 0（空白组） 11.54±0.34 19.67±0.50 1.2 12.43±0.26* 21.45±0.26# 7.71 2.4 13.67±0.55** 23.05±0.68## 18.46 4.8 15.25±0.31*** 26.76±0.63### 32.15 注：与空白组线虫平均寿命相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异高度显著（P<0.01），***表示差异极显著（P<0.001）；与空白组线虫最长寿命相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异高度显著（P<0.01），###表示差异极显著（P<0.001）。 ![]()
图 4 蒽醌体内抗氧化能力注：与空白组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。Figure 4. Antioxidant ability of anthraquinone in vivo2.7 蒽醌对酶的抑制作用
在人体中，α-淀粉酶将碳水化合物水解成寡糖，寡糖在α-葡萄糖苷酶的作用下进一步水解成葡萄糖。抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，能减缓葡萄糖生成，从而降低人体血糖水平[32]。如图5a所示，蒽醌和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线变化趋势相似，在0~2 mg/mL范围呈快速上升的趋势，随后逐渐趋于平稳。在浓度为2.4 mg/mL时，蒽醌对α-葡萄糖苷酶的抑制率为86.04%，高于阿卡波糖（68.39%）。蒽醌对α-葡萄糖苷酶的IC50值为0.575 mg/mL，明显低于阿卡波糖IC50值（1.05 mg/mL），表明蒽醌具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。曾铁鑫等[33]发现巴戟天氯仿萃取相对α-葡萄糖苷酶的抑制率要强于阿卡波糖，但并未对其活性成分进行解析，结合本试验的结果推测蒽醌是提取物中发挥α-葡萄糖苷酶抑制活性的重要成分。在图5b中，在蒽醌浓度较低时（0~1 mg/mL），蒽醌对α-淀粉酶的抑制率低于阿卡波糖，但随着浓度升高，两者抑制率曲线趋近，在8 mg/mL时蒽醌对α-淀粉酶的抑制率高达96.17%。蒽醌对α-淀粉酶的IC50值为0.588 mg/mL，高于阿卡波糖的IC50值（0.441 mg/mL）。蒽醌表现出较强的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，作用机制可能是其与酶分子活性部位结合并改变酶分子构象，进而抑制酶的活性[34]。
2.8 蒽醌对IR-HepG2细胞的影响
HepG2细胞是一种人源肝癌细胞，具有与肝细胞高度相似的形态与功能，是研究药物降糖活性的重要细胞模型[35]。如图6a所示，蒽醌浓度在0.5~8 mg/mL范围内，随着浓度的增大，IR-HepG2细胞存活率会出现轻微的下降，但无显著性差异（P>0.05），均能达到94%以上，表明在此浓度范围内蒽醌对IR-HepG2细胞没有明显的毒性，可以在此范围内进行后续试验。图6b中，与正常组相比，模型组消耗的葡萄糖较正常组显著降低40.90%（P<0.001），表明IR-HepG2细胞模型构建成功。基于发酵巴戟天蒽醌对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的IC50值，以及便于配置浓度，选择蒽醌的IC50（0.6 mg/mL）、2×IC50（1.2 mg/mL）值进一步研究对IR-HepG2细胞的影响。与模型组相比，蒽醌浓度0.6、1.2 mg/mL组葡萄糖消耗量分别提高了20.90%（P<0.05）、47.42%（P<0.01），表明蒽醌能够促进IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗，且在浓度1.2 mg/mL时降糖效果最明显。IR-HepG2细胞在1.2 mg/mL蒽醌组中的葡萄糖消耗量（6.56 mmol/L）与二甲双胍组（6.68 mmol/L）相当，表明蒽醌具有较强的降血糖活性。这与GAO等[36]的研究结果一致，其发现4,5-二羟基蒽醌-2-羧酸能显著降低高血糖老鼠血浆中葡萄糖水平。GLUT4是一种重要的葡萄糖转运蛋白，发酵巴戟天蒽醌可能是提高了IR-HepG2细胞GLUT4 mRNA的表达量，从而消耗更多的葡萄糖[37]。
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图 6 蒽醌对IR-HepG2细胞活性的影响注：与正常组相比，###表示差异极显著（P<0.001）；与模型组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异高度显著（P<0.01），***表示差异极显著（P<0.001）。Figure 6. The effect of anthraquinone on IR-HepG2 cell activity3. 结论
发酵巴戟天蒽醌的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数45%、料液比1:41 （g/mL）、提取温度65 ℃、提取时间1.60 h，该条件下蒽醌提取率为90.37%。对发酵巴戟天蒽醌的抗氧化活性研究发现：在体外，发酵巴戟天蒽醌浓度为5 mg/mL时对DPPH自由基、OH自由基和超氧阴离子的清除率分别为74.18%、85.48%和90.24%；在体内，发酵巴戟天蒽醌浓度为4.8 mg/mL时能显著延长线虫的寿命和显著增强线虫的运动能力。对发酵巴戟天的降血糖活性进行研究发现：在体外，发酵巴戟天蒽醌对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值分别为0.575和0.588 mg/mL，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显优于阿卡波糖；在体内，发酵巴戟天蒽醌浓度为1.2 mg/mL时对IR-HepG2细胞无毒性作用，经此浓度的蒽醌干预后，IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量为6.56 mmol/L，与降血压药物二甲双胍作用效果相当。
综上所述，发酵巴戟天蒽醌在体内、外均表现出一定的抗氧化活性，能有效抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性，且能改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗，提高对葡萄糖消耗量，表明发酵巴戟天蒽醌具有天然抗氧化剂和降血糖药物的开发潜力。本试验的体内降血糖模型为IR-HepG2细胞，有待于构建高血糖小鼠模型进行更深一步的研究。
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图 1 单因素对蒽醌提取率的影响
注：图中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 1. The effect of single factor on the extraction ratio of anthraquinone
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图 2 各因素交互作用对蒽醌提取率影响的响应面和等高线图
Figure 2. Response surface and contour lines plots of effects of interaction between each factors on the extraction ratio of anthraquinone
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图 4 蒽醌体内抗氧化能力
注：与空白组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。
Figure 4. Antioxidant ability of anthraquinone in vivo
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图 6 蒽醌对IR-HepG2细胞活性的影响
注：与正常组相比，###表示差异极显著（P<0.001）；与模型组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异高度显著（P<0.01），***表示差异极显著（P<0.001）。
Figure 6. The effect of anthraquinone on IR-HepG2 cell activity
表 1 响应面试验因素和水平表
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
因素 水平 −1 0 1 A 乙醇体积分数（%） 40 45 50 B 料液比（g/mL） 1:35 1:40 1:45 C 提取温度（℃） 60 65 70 D 提取时间（h） 1.0 1.5 2.0 
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表 2 Box-Behnken响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken response surface test
试验号 A
乙醇体积分数B
料液比C
提取温度D
提取时间Y
蒽醌提取率（%）1 0 −1 0 −1 60.34 2 1 0 −1 0 70.78 3 −1 0 0 −1 78.35 4 1 1 0 0 75.54 5 0 0 1 −1 70.32 6 0 0 0 0 89.56 7 1 0 0 −1 64.61 8 1 −1 0 0 60.93 9 0 0 −1 −1 74.79 10 0 −1 1 0 60.35 11 0 0 0 0 90.49 12 1 0 0 1 77.67 13 0 −1 0 1 70.21 14 −1 0 1 0 66.71 15 −1 −1 0 0 63.17 16 0 1 0 −1 73.43 17 0 0 0 0 88.49 18 0 1 1 0 75.44 19 −1 1 0 0 71.11 20 0 0 1 1 78.68 21 0 1 0 1 76.91 22 −1 0 −1 0 73.56 23 0 1 −1 0 71.93 24 0 −1 −1 0 70.34 25 0 0 0 0 91.01 26 −1 0 0 1 75.31 27 0 0 0 0 90.37 28 0 0 −1 1 75.37 29 1 0 1 0 70.15
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表 3 回归模型方差分析表
Table 3 Analysis of variance table for the regression model
变异来源 平方和 自由度 方差 F值 P值 显著性 模型 2177.97 14 155.57 40.81 < 0.0001 *** A-乙醇体积分数 6.06 1 6.06 1.59 0.2279 B-料液比 290.28 1 290.28 76.15 < 0.0001 *** C-提取温度 19.05 1 19.05 5 0.0422 * D-提取时间 86.99 1 86.99 22.82 0.0003 *** AB 11.12 1 11.12 2.92 0.1097 AC 9.67 1 9.67 2.54 0.1335 AD 64.80 1 64.8 17 0.0010 ** BC 45.56 1 45.56 11.95 0.0038 ** BD 10.21 1 10.21 2.68 0.1240 CD 15.13 1 15.13 3.97 0.0662 A2 660.26 1 660.26 173.2 < 0.0001 *** B2 991.39 1 991.39 260.06 < 0.0001 *** C2 499.22 1 499.22 130.95 < 0.0001 *** D2 280.55 1 280.55 73.59 < 0.0001 *** 残差 53.37 14 3.81 失拟项 49.50 10 4.95 5.12 0.0648 纯误差 3.87 4 0.9674 总离差 2231.34 28 注：*差异显著（P<0.05）；**差异高度显著（P<0.01）；***差异极显著（P<
0.001）。
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表 4 蒽醌对线虫寿命的影响
Table 4 Effects of anthraquinone on the life span of C. elegans
蒽醌浓度（mg/mL） 平均寿命（d） 最长寿命（d） 平均寿命延长率（%） 0（空白组） 11.54±0.34 19.67±0.50 1.2 12.43±0.26* 21.45±0.26# 7.71 2.4 13.67±0.55** 23.05±0.68## 18.46 4.8 15.25±0.31*** 26.76±0.63### 32.15 注：与空白组线虫平均寿命相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异高度显著（P<0.01），***表示差异极显著（P<0.001）；与空白组线虫最长寿命相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异高度显著（P<0.01），###表示差异极显著（P<0.001）。
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期刊类型引用(7)
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百度学术
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4. 韦菡燕，蒋军文. 等离子体对松茸多糖抗疲劳作用的影响. 保鲜与加工. 2024(10): 128-133 . 百度学术
5. 黄磊，何春梅，司灿，石鸿宇，段俊. 大球盖菇栽培研究进展. 中国食用菌. 2023(03): 8-14 . 百度学术
6. 魏磊，王伟，谢晓阳，周雍，刘雨晴，马艳妮，宁二娟，王韬，李宁洁，景炳年. 响应面优化博爱赤松茸多糖提取工艺及其抑菌和抗氧化活性研究. 食品工业科技. 2023(15): 213-220 . 本站查看
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