Optimization of Silybin Extraction Using Natural Deep Eutectic Solvents and Mechanism Discussion Based on COSMO-SAC
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摘要: 水飞蓟素是水飞蓟种子提取出的黄酮类生物活性成分，具有保肝利胆等多种药理功能，其中水飞蓟宾活性及含量最高，本研究利用天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutectic Solvent，NADES），对水飞蓟宾的高效提取工艺与机理进行研究。以粉碎脱脂后的水飞蓟种壳粉为原料，用初步筛选所得较优NADES，即：氯化胆碱+1,4-丁二醇进行提取，HPLC法测定水飞蓟宾含量，在单因素实验基础上，采用响应面法对该NADES提取水飞蓟宾工艺进行优化。结果表明：料液比1:20 g/mL，提取温度77.0 ℃、时间5.6 h，模型预测水飞蓟宾得率可达4.29%，与实验值4.30%基本一致。基于片段活度系数类导体屏蔽模型（Conductor-like Screening Model for Segment Activity Coefficient，COSMO-SAC），分别对水飞蓟宾和溶剂分子（NADES与传统溶剂乙醇）进行结构与能量优化，通过量子化学计算，得到水飞蓟宾在两种溶剂中的无限稀释活度系数的对数分别为−6.922和−6.043，分子间相互作用能分别为−51.62和−25.47 kJ/mol，以探讨不同溶剂提取水飞蓟宾效果差异机理。
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关键词:
- 水飞蓟宾 /
- 天然低共熔溶剂 /
- 提取 /
- 量子化学计算 /
- 片段活度系数类导体屏蔽模型(COSMO-SAC)
Abstract: As a bioactive component extracted from the seed of milk thistle, silymarin has many pharmacological functions, such as liver-protective and cholagogic effect. It is categorized as a class of flavonoids, among which silybin is one of the main components. Efficient extraction of silybin with a type of new and green solvent natural deep eutectic solvent (NADES), as well as mechanism discussion were explored in this study. With the degreased milk thistle seed shell powder as raw material and using HPLC for silybin analysis, NADES composed of choline chloride/1,4-butanediol was screened out as optimal solvent for silybin extraction. On the basis of single factor experiments, Box-Behnken Design from response surface methodology was used for process optimization. The generated model predicated that the highest silybin yield of 4.29% would be achieved with solid-liquid ratio of 1:20 g/mL, at 77 °C for 5.6 h. The result from verification experiment was about 4.30%, which fitted well with the prediction. Then, based on conductor-like screening model for segment activity coefficient (COSMO-SAC), structure and energy optimization of silybin and solvent were attempted. The logarithms of infinite dilution activity coefficients in the two solvents, chloride/1,4-butanediol and the traditional organic solvent ethanol, were −6.922 and −6.043, and the intermolecular interaction energies were −51.62 and −25.47 kJ/mol, respectively, which would provide insight into the mechanism explaining performance difference of the solvents during extraction. -
水飞蓟（Silybum marianum （L.） gaertn），又名奶蓟，是菊科水飞蓟属的植物，在我国广泛种植[1]。水飞蓟素是从水飞蓟种子中分离出来的二氢黄酮类有效成分[2]，具有保肝利胆的作用[3]，还可降低血糖和血脂、抗凝结，是治疗心脑血管疾病的良药[4]。因水飞蓟素急性毒性试验、长期饲养实验均表明其具有极高食用安全性[5]，美国和欧洲都已批准其作为食品营养添加剂上市销售[6]。水飞蓟宾（silybin）是其中的主要活性成分（约占水飞蓟素总量40%~65%），其抗氧化活性取决于结构中的酚羟基与氧自由基反应生成较稳定的半醌式自由基[7]，其化学结构式如图1所示。因此，水飞蓟宾高效提取研究已引起学者广泛关注。
水飞蓟种子可以分为种皮和种仁两部分，水飞蓟宾在种皮中含量最为丰富[9]。因此，常以剥除种仁后的种皮为原料[10]，采取有机溶剂如乙醇、丙酮等浸提[11]，但有机溶剂存在易燃易爆等诸多问题[12]。目前对于水飞蓟宾的研究多集中于药理活性的探讨，但对其高效提取工艺研究却少见报道，若能寻找一种安全、绿色且具有较高水飞蓟宾提取潜力的溶剂，并对其工艺进行优化，可有利于水飞蓟宾的高效利用。有研究者采用双水相这一新型溶剂来提取水飞蓟宾[13]，但采用低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）提取水飞蓟宾的研究却未见报道。
DES是由氢键供体（Hydrogen Bond Donor，HBD）和氢键受体（Hydrogen Bond Acceptor，HBA）按一定摩尔比，在一定温度下搅拌一段时间即可制得[14]。作为一种新型绿色溶剂，具有可设计性强、对环境无污染、易于制备等诸多优点[15]，近年来引起国内外学者的广泛关注[16]。DES目前多用于提取芳香族和脂肪族烃类[17]，分离黄酮类物质、多糖等[18-19]。Duan等[20]采用43种DES提取中草药（三七、大黄、丹参等）中的生物碱，最优DES体系提取得率远高于传统有机溶剂提取。天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutectic Solvent，NADES）是从DES衍生出的一种新型溶剂[21]，即HBD和HBA是由生物体内代谢物如胆碱衍生物、醇类、有机酸等物质组成，具有更好的生物相容性和生物可降解性等显著优势，在食品、医药和化妆品等领域的应用具有更大潜力[22]。
近年来，研究者尝试从量子化学角度建立合适的模型，探讨溶质和溶剂分子之间相互作用机理，以预测或解释不同溶剂提取潜力的差异。Klamt等[23]提出采用片段活度系数类导体屏蔽模型（Conductor-like Screening Model for Segment Activity Coefficient，COSMO-SAC），在量子化学和统计热力学基础上处理溶质和溶剂，以预测体系的理化性质并探讨分子间相互作用。Zurob等[24]用DES提取橄榄多酚，并将模拟计算所得无限稀释活度系数γ∞与实验得率进行比对，结果表明γ∞数值越小橄榄多酚得率越高。以上研究说明该模型可用于探讨提取过程中的关键作用力及预测溶剂提取潜力，进而有助于指导后续天然产物类产品的生产开发。
基于此，本课题选用两种季铵类HBA—氯化胆碱与甜菜碱、两种HBD—1,4-丁二醇和乳酸组成四组NADESs，对其提取水飞蓟宾效果比对后，选取氯化胆碱+1,4-丁二醇（摩尔比1:2）组成的NADES，尝试结合单因素实验和响应面法优化水飞蓟宾提取参数，并基于COSMO-SAC模型结合实验结果进行探讨。在得到水飞蓟宾高效、绿色提取工艺的同时，为新型溶剂提取各类活性成分的工艺优化及机理研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料和仪器
水飞蓟种子 黑龙江绥化市某水飞蓟种植公司；脱脂水飞蓟种壳粉 剥离种仁后所得水飞蓟种壳，粉碎机粉碎、过100目筛后，用石油醚在索氏抽提装置中脱脂12 h，得脱脂后水飞蓟种壳粉，待石油醚挥发后，于105 ℃烘箱烘干，放于气密避光容器中备用；水飞蓟宾标准品 色谱纯，北京中科质检生物技术有限公司；甲醇 色谱纯，阿拉丁试剂公司；其它试剂 均为国产分析纯。
LC-20AT高效液相色谱仪（HPLC）、SPD-20A紫外可见光检测器、WONDASIL C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 日本岛津公司；JYL-D025料理机 九阳股份有限公司；TGL-16M台式高速冷却离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；FA2004N电子天平（精度为0.01 mg） 上海精密科学仪器有限公司；计算模拟所用软件为Materials Studio7.0 美国Accelrys公司。
1.2 实验方法
1.2.1 NADES制备
按照下表1所示NADES组成的摩尔比[25]，结合相对分子量取相应质量的HBA和HBD，置于500 mL的圆底烧瓶中，用封口膜密封后，置于80 ℃磁力搅拌水浴锅中搅拌，直至瓶内液体成为均相、无色透明液体时停止加热，取出圆底烧瓶冷却至室温，即得NADES。
表 1 NADES配制表Table 1. NADES preparation序号 NADES HBA HBD 摩尔比（HBA:HBD） 1 氯化胆碱+1,4-丁二醇（ChCl+1,4-Bu） 氯化胆碱 1,4-丁二醇 1:2 2 甜菜碱+1,4-丁二醇（Betaine+1,4-Bu） 甜菜碱 1,4-丁二醇 1:2 3 氯化胆碱+乳酸（ChCl+LA） 氯化胆碱 乳酸 1:1 4 甜菜碱+乳酸（Betaine+LA） 甜菜碱 乳酸 1:1 1.2.2 水飞蓟宾提取流程
称取0.5 g种壳粉，按一定料液比取一定体积提取溶剂（v提取液），倒入20 mL钳口瓶中，加入磁力搅拌子后压盖封瓶。于磁力搅拌器内一定温度加热并搅拌一定时间后，转移至10 mL离心管，离心8000 r/min，20 min，即得水飞蓟宾提取液[4]。
1.2.3 单因素实验
选择HBA为氯化胆碱和甜菜碱，HBD为1,4-丁二醇和乳酸，共考察如表1所示的4组NADES。同时参考文献[26]，采取传统有机溶剂乙醇提取以做比对。设定提取温度80 ℃，料液比1:20 g/mL，提取4 h，按1.2.2所述提取及1.2.5得率计算方法，得到各溶剂的水飞蓟宾得率，选择得率最高的溶剂体系进行后续单因素及响应面试验。确定得率最高的溶剂体系后，对影响水飞蓟宾得率的主要因素：温度、时间、料液比进行单因素实验。
首先采用提取温度80 ℃，提取时间4 h的初始条件，考察料液比（1:50、1:25、1:20、2:20、3:20、4:20、5:20 g/mL）对水飞蓟宾提取的影响，然后在较优料液比及4 h的提取时间下考察提取温度（30、50、70、80、95 ℃）的影响，最后在较优料液比和提取温度下研究提取时间（1、2、4、6、8、10 h）对水飞蓟宾提取的影响。
1.2.4 响应面优化
在单因素实验基础上，采用Box-Behnken进行响应面试验设计，中心点数量为4，以水飞蓟宾得率为主要考核指标，对于提取时间、提取温度、料液比三个因素进行优化，确定水飞蓟素提取的最佳工艺条件。在单因素实验的基础上，选择提取时间为4、6、8 h，提取温度为70、80、90 ℃，料液比为1:20、2:20、3:20 g/mL进行响应面优化[27]，试验因素与水平设置见表2。
表 2 响应面设计因素与水平Table 2. Factors and levels of response surface methodology因素 水平 −1 0 +1 A 提取温度（℃） 70 80 90 B 提取时间（h） 4 6 8 C 料液比（g/mL） 1:20 2:20 3:20 1.2.5 指标测定
水飞蓟宾标准曲线绘制：0.025 g水飞蓟宾标准品用甲醇定容至50 mL，配制得母液。用甲醇分别稀释2、4、8、16倍，每个浓度3组平行，标准品溶液用0.22 μm滤膜过滤[28]。HPLC流速为1 mL/min，柱温40 ℃，流动相为甲醇-水（60:40），设定检测波长为287 nm[27]，进样量20 µL，以峰面积和浓度为横纵坐标绘制标准曲线。
水飞蓟宾得率的测定：HPLC操作及检测条件同上。将水飞蓟宾提取液用甲醇稀释适量倍数（
n ）后进行测定。根据标准曲线求得浓度（c），按照式（1）计算水飞蓟宾得率。水飞蓟宾得率(%)=n×c×v提取液0.5×103×100 (1) 式中：
n 为HPLC样品稀释倍数；c 为提取样品的水飞蓟宾浓度，mg/mL；v提取液 为提取溶剂体积，mL；0.5为种壳粉质量，g。1.2.6 COSMO-SAC模型及相互作用能计算
使用Materials Studio7.0软件，通过建立COSMO-SAC模型，将组成NADES的HBA、HBD以及乙醇和水飞蓟宾分别进行构型优化，再对组合所得NADES进行构型及能量优化，得到能量最低的分子结构，在输出的COSMO文件中选择溶质和溶剂的片段数和空穴数，进而得到各类分子的表面屏蔽电荷密度，输入COSMO-VT程序，得到水飞蓟宾在NADES及乙醇中的γ∞[29]。无限稀释活度系数γ∞反映溶质分子完全被溶剂分子包围时溶液的行为，可用于预测溶剂的溶解能力和选择性，也可用于辅助评判溶质与溶剂分子间相互作用强弱[30]。
溶质与溶剂分子间的相互作用能EINT的大小，可较为直观的比较其相互作用强弱[29]。对构型优化所得水飞蓟宾和溶剂组合分子结构，进行基组重叠误差（Basis Set Superposition Error，BSSE）校正，得到EINT。经BSSE校正后体系的相互作用能计算公式见式（2）~式（3）[31]。具体计算流程如图2所示。
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图 2 水飞蓟宾在溶剂中的γ∞及EINT计算流程图Figure 2. Flow chart for calculating γ∞ and EINT of silybin in solventEINT=EAB−EA−EB+EBSSE (2) EBSSE=EA−E(A,AB)+EB−E(B,AB) (3) 式中：EAB是A、B分子间的相互作用能；EA、EB分别是分子A（水飞蓟宾）和分子B（NADES或乙醇）的能量；E（A,AB）是A、B基组下A的能量；E（B,AB）是A、B基组下B的能量；EA是A基组下A的能量，EB是B基组下B的能量，以上参数单位均为kJ/mol。以上可消除因单体基组重叠造成的能量降低后的AB复合物能量，从而使得分子间相互作用能计算更准确合理[32]。
1.3 数据处理
所有提取实验均至少重复3次，HPLC浓度测定时重复3次。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计，采用SPSS 25进行显著性差异分析，P<0.05为具有统计学意义的显著差异，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，实验结果绘制均采用Origin 2018。
2. 结果与分析
2.1 溶剂筛选结果
如图3所示，为不同NADESs以及传统溶剂乙醇对提取水飞蓟宾得率。在考察的溶剂中，氯化胆碱+1,4-丁二醇提取水飞蓟宾得率最高，与其余4种溶剂有显著性差异（P<0.05）。从“相似相溶”的角度出发，可能氯化胆碱+1,4丁二醇所构成的NADES与溶质水飞蓟宾的极性更为接近，另一方面，也有可能溶质分子与该NADES形成的氢键相互作用力，进而有助于水飞蓟宾的提取[24]，选择该NADES体系进行后续单因素及响应面法工艺优化，并利用COSMO-SAC模型对提取过程中水飞蓟宾与溶剂分子间的关键作用力进行机理探讨。
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图 3 不同溶剂提取水飞蓟宾得率注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图4同。Figure 3. Yield of silybin extracted with different solvents2.2 单因素实验结果
以氯化胆碱+1,4-丁二醇所组成的NADES对水飞蓟宾进行提取，料液比、提取温度及时间对水飞蓟宾得率影响如图4所示。
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图 4 料液比、提取温度、提取时间对水飞蓟宾得率的影响Figure 4. Effects of solid-liquid ratio, extraction temperature and extraction time on silybin yield2.2.1 料液比对水飞蓟宾得率的影响
由图4A可以看出，随料液比逐渐增加，水飞蓟宾得率呈降低趋势，当料液比大于2:20 g/mL，降低趋势加快。尽管从提高得率角度出发，较低的料液比可以提高得率，但低料液比意味着较多提取溶剂消耗，从节省提取溶剂考虑，选定料液比1:20、2:20、3:20 g/mL进行下一步响应面优化。
2.2.2 提取温度对水飞蓟宾得率的影响
温度升高可促进传质，在一定程度上提高生物活性物质从固体原料中脱出并溶解扩散到提取溶剂中的速度。采取料液比1:20 g/mL，在4 h的提取条件下，温度对水飞蓟宾提取影响如图4B所示。随温度逐渐升高，水飞蓟宾得率上升，但温度高于80 ℃后，水飞蓟宾得率下降，由其结构式可知，其酚羟基在较高的温度下会被氧化进而影响水飞蓟宾得率。从节省加热耗能及水飞蓟宾这一活性物质的稳定性保障两方面考虑，响应面优化拟选定择70、80、90 ℃三个水平。
2.2.3 提取时间对水飞蓟宾得率的影响
采取料液比1:20 g/mL及80 ℃的条件下研究提取时间对水飞蓟宾得率的影响。由图4C可以看出，在提取的前6 h随提取时间延长，水飞蓟宾得率上升，但前2 h上升速率最快，6 h时得率可达3.57%；2~6 h随时间增加，得率上升的趋势逐渐减缓；6 h之后，因水飞蓟宾的稳定性导致得率呈下降趋势，后续响应面试验拟定4、6、8 h三个水平进行响应面优化。
2.3 NADES提取水飞蓟宾响应面试验
在单因素实验基础上，进行NADES提取水飞蓟宾响应面试验，所得试验结果如表3所示。
表 3 NADES提取水飞蓟宾响应面试验结果Table 3. Extraction of silybin using NADES with response surface methodology编号 提取温度 提取时间 料液比 得率（%） 1 80 8 1:20 4.00 2 80 6 2:20 4.00 3 70 6 1:20 4.20 4 70 8 2:20 3.80 5 70 6 3:20 3.90 6 90 6 3:20 3.80 7 80 6 2:20 4.10 8 90 8 2:20 3.30 9 80 8 3:20 3.70 10 80 6 2:20 4.10 11 70 4 2:20 3.80 12 80 6 2:20 4.00 13 80 4 3:20 4.00 14 90 4 2:20 3.80 15 80 4 1:20 4.20 16 90 6 1:20 3.90 对实验数据进行方差分析，结果进行二次多元回归拟合，得到因变量水飞蓟宾得率和自变量（提取温度A，提取时间B和料液比C）之间的关系式：得率Y（%）=4.02−0.11A−0.13B−0.12C−0.13AB+0.045AC−0.022BC−0.21A2−0.14B2+0.091C2
本实验所得回归模型方差分析如表4所示，分析所得回归模型的F值为22.89且P<0.001，表明该模型具有显著统计学意义。失拟项P值为0.8035>0.05，说明该模型与实验拟合程度差异并不显著，可认为无失拟因素存在，可用该回归方程对实验结果进行分析[33]。校正决定系数R2（Adj R-Squared）为0.9293和变异系数CV为1.50%，进一步说明模型具有较好的拟合性和合理性。预测校正决定系数（Pred R-Squared）为0.8487，与校正决定系数很接近，衡量有效信号与噪声的信噪比为19.268（大于4.0视为合理），进一步说明模型拟合度较好，可用来对NADES提取水飞蓟宾的工艺进行初步分析和预测。
表 4 回归模型方差分析Table 4. Analysis of variance of quadratic model方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 0.70 9 0.078 22.89 0.0006 A 0.097 1 0.097 28.44 0.0018 B 0.13 1 0.13 38.96 0.0008 C 0.11 1 0.11 31.76 0.0013 AB 0.068 1 0.068 19.86 0.0043 AC 8.100E-003 1 8.100E-003 2.38 0.1739 BC 2.025E-003 1 2.025E-003 0.59 0.4698 A2 0.17 1 0.17 49.98 0.0004 B2 0.083 1 0.083 24.28 0.0026 C2 0.033 1 0.033 9.78 0.0204 残差 0.020 6 3.404E-003 失拟项 5.125E-003 3 1.708E-003 0.33 0.8035 纯误差 0.015 3 5.100E-003 总误差 0.72 15 自变量一次项A、B、C因素，二次项AB、A2、B2对结果影响极显著（P<0.01）；二次项C2影响显著（P<0.05）；因素AC、BC和对其结果影响不显著（P˃0.05），该模型可用于条件优化的预测。
为更直观地反映因素对响应值的影响，对回归模型进行响应面图分析，来评价两两交互作用对水飞蓟宾得率的影响并确定各因素的最优范围，各因素在不同水平下对于水飞蓟宾得率的等高线（左）和三维图（右）如图5所示。在响应面中，曲面越陡峭，则该因素对因变量的影响越显著，等高线的形状越趋于椭圆形，表明两个因素之前交互作用显著[33]。提取温度和提取时间的响应面曲线走势陡峭并且等高线（图5A）为椭圆形，说明两者交互作用最显著。料液比和温度交互作用虽不显著，但由图5C~图5D可以观察到，越到橙色区域得率越高，当提取温度在70~80 ℃、液料比在1:10~1:20 g/mL范围，三维图最优值可达4.10%~4.30%。同样由图5E~图5F可以观察到，提取时间在4~6 h、料液比在1:20~2:20 g/mL范围，三维图最优值也可达4.10%~4.30%。
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图 5 提取温度、提取时间、料液比对水飞蓟宾得率的响应面试验结果Figure 5. Influence of temperature, time and liquid-solid ratio on silybin extraction yield拟合模型预测最优提取工艺为：料液比1:20 g/mL，提取时间为5.6 h，提取温度为77.0 ℃，水飞蓟宾得率为4.29%。对该条件进行验证实验，水飞蓟宾得率为4.30%，与模型预测结果相近，比未优化前得率3.17%提高了约35.65%。汪绪龙等[34]以脱脂后种壳粉为原料，采用有机溶剂多次回流提取和超声辅助提取两种方式，得到以无水乙醇回流提取的得率最高，为1.85%；阮洪生等[13]用脱脂水飞蓟粉为原料，采用超声辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取，水飞蓟宾得率为1.02%，均远低于本研究采用NADES的得率。且NADES具有低饱和蒸气压、安全、无毒等诸多优点，使其在水飞蓟宾等天然产物提取方面应用潜力巨大。
2.4 基于COSMO-SAC模型的辅助机理探讨
2.4.1 水飞蓟宾分子结构及表面电荷密度分布
图6所示为通过软件对模型溶质分子水飞蓟宾进行几何优化，得到能量参数最低的最优构型（图6A）、表面电荷密度（图6B）。其中化学结构中的绿色原子表示碳、红色为氧、蓝色为氢。而表面电荷密度图中的蓝色区域主要来自分子中苯环上的酚羟基以及醇羟基上面的氢，这些官能团赋予水飞蓟宾分子具有一定的氢键供体能力（HBD）；同时分子中的羰基氧和羟基氧，使得水飞蓟宾分子同时具有一定的氢键受体能力（HBA）[35]。
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图 6 优化后水飞蓟宾化学结构（A）和表面电荷密度（B）Figure 6. Optimal chemical structure formula (A) and surface charge density (B) of silybin2.4.2 水飞蓟宾、NADES及乙醇的σ-profile
分子的表面电荷密度分布函数（σ-profile），是以电荷密度（σ，单位为e/Å2）为x轴、电荷密度概率大小P（σ）为y轴作图，可反映分子真实电荷分布情况和极性大小，能从整体上描述分子表面的极化作用。±0.0084 e/Å2以外的区域属于极性区域，越向两侧扩展延伸则代表分子的极性越强：如在>0.0084 e/Å2区域延伸较远，则该分子可作为氢键受体（HBA）；如在<−0.0084 e/Å2区域延伸较远则可作为氢键供体（HBD）[36]。
由图7可以看出，溶质水飞蓟宾的σ-profile，在正极性区延伸至>0.015 e/Å2，而负值极性区延伸至<−0.02 e/Å2，说明其结构式中多个羟基赋予水飞蓟宾作为HBD的能力，远大于其作为HBA的能力（来自分子中羰基和羟基上的氧）。即：该溶质分子在溶液中倾向于作为HBD的潜力较大。中间非极性区域的峰值则由于苯环以及烷基上面的氢（负的非极性区）、苯环以及烷基上面的碳以及醚键中的氧（正的非极性区），且>0 e/Å2的正的非极性区峰值更大。
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图 7 水飞蓟宾与氯化胆碱+1,4-丁二醇及乙醇的σ-profileFigure 7. σ-Profiles of silybin, choline chloride+1,4-butanediol and ethanol从两类典型的溶剂分子的σ-profile可以看出，对传统溶剂乙醇而言，中间的非极性区域有两个明显的峰，是由其烷基上的H（非极性左侧的峰）和C所引起；其<−0.0084 e/Å2区域的延伸源于-OH的极性氢，而-OH上带有sp3杂化的氧则使其在>0.0084 e/Å2区域有明显的峰，因在极性区域左右延伸的远近几乎相同，且峰高也较为接近，推测其作为HBA和HBD的潜力差别不大[37]。由氯化胆碱+1,4-丁二醇所组成的NADES因有两种组分构成，且每种组分的结构都要比乙醇复杂，故其σ-profile上的峰型会相对复杂。但总体而言，该NADES在正极性区，尤其是>0.01 e/Å2区域延伸距离、峰高均大于其在<−0.01 e/Å2的负极性区域，推测其在溶液中具有更高的作为HBA的潜力。对于氯化胆碱+1,4-丁二醇的σ-profile中间的非极性区域而言，其<0 e/Å2负的非极性区域峰值更大。
综合溶质水飞蓟宾与两种溶剂的σ-profile，可初步推断：作为提取所用溶剂，由氯化胆碱+1,4-丁二醇所组成的NADES和水飞蓟宾之间相互作用更强，应具有更强的提取能力。
基于1.2.6所述计算方法，得到水飞蓟宾在氯化胆碱+1,4-丁二醇所组成的NADES及乙醇中的无限稀释活度系数γ∞，γ∞越小则意味着该溶剂对水飞蓟宾的溶解能力越强。水飞蓟宾在氯化胆碱+1,4-丁二醇和乙醇中的lnγ∞分别为-6.922和-6.043。同时得到氯化胆碱+1,4-丁二醇与水飞蓟宾的相互作用能为-51.62 kJ/mol，而传统溶剂乙醇与水飞蓟宾相互作用能则仅为-25.47 kJ/mol，说明氯化胆碱+1,4-丁二醇与溶质水飞蓟宾分子之间的相互作用能更大，与图7 σ-profile所推测的信息一致，也在微观机理层面上解释了图3氯化胆碱+1,4-丁二醇高于乙醇提取得率的实验结果。
3. 结论
实验初步筛选得到提取水飞蓟宾较优的NADES为氯化胆碱+1,4-丁二醇（摩尔比1:2），通过单因素实验和响应面法研究提取温度、提取时间、料液比对水飞蓟宾得率的影响，结果表明：料液比1:20 g/mL，提取时间为5.6 h，提取温度为77 ℃，水飞蓟宾得率可达4.30%，比未优化前提高了约35.65%。通过建立水飞蓟宾、新型绿色溶剂氯化胆碱+1,4-丁二醇体系以及传统溶剂乙醇的COSMO-SAC模型，分别得到其能量最低状态下的σ-profile，以推测溶质和溶剂之间的相互作用。量子化学模拟计算结果表明，水飞蓟宾在氯化胆碱+1,4-丁二醇和乙醇中的lnγ∞分别为−6.922和−6.043，说明前者具有更强的水飞蓟宾溶解潜力；且氯化胆碱+1,4-丁二醇与水飞蓟宾的相互作用能为−51.62 kJ/mol，而乙醇与水飞蓟宾的仅为−25.47 kJ/mol。在提取过程中，溶质在溶剂中无限稀释活度系数越小，相互作用能越大，则其提取得率会更高。本研究对水飞蓟宾的绿色提取工艺优化进行探索，以期促进其作为食品营养强化剂、药用活性成分的进一步开发；通过实验与量子化学模拟计算相结合的方式，尝试从微观角度解释机理，可为各类天然产物高效提取溶剂的选择及工艺优化等方面提供一定借鉴。
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图 2 水飞蓟宾在溶剂中的γ∞及EINT计算流程图
Figure 2. Flow chart for calculating γ∞ and EINT of silybin in solvent
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图 3 不同溶剂提取水飞蓟宾得率
注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图4同。
Figure 3. Yield of silybin extracted with different solvents
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图 4 料液比、提取温度、提取时间对水飞蓟宾得率的影响
Figure 4. Effects of solid-liquid ratio, extraction temperature and extraction time on silybin yield
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图 5 提取温度、提取时间、料液比对水飞蓟宾得率的响应面试验结果
Figure 5. Influence of temperature, time and liquid-solid ratio on silybin extraction yield
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图 6 优化后水飞蓟宾化学结构（A）和表面电荷密度（B）
Figure 6. Optimal chemical structure formula (A) and surface charge density (B) of silybin
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图 7 水飞蓟宾与氯化胆碱+1,4-丁二醇及乙醇的σ-profile
Figure 7. σ-Profiles of silybin, choline chloride+1,4-butanediol and ethanol
表 1 NADES配制表
Table 1 NADES preparation
序号 NADES HBA HBD 摩尔比（HBA:HBD） 1 氯化胆碱+1,4-丁二醇（ChCl+1,4-Bu） 氯化胆碱 1,4-丁二醇 1:2 2 甜菜碱+1,4-丁二醇（Betaine+1,4-Bu） 甜菜碱 1,4-丁二醇 1:2 3 氯化胆碱+乳酸（ChCl+LA） 氯化胆碱 乳酸 1:1 4 甜菜碱+乳酸（Betaine+LA） 甜菜碱 乳酸 1:1 
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表 2 响应面设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface methodology
因素 水平 −1 0 +1 A 提取温度（℃） 70 80 90 B 提取时间（h） 4 6 8 C 料液比（g/mL） 1:20 2:20 3:20
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表 3 NADES提取水飞蓟宾响应面试验结果
Table 3 Extraction of silybin using NADES with response surface methodology
编号 提取温度 提取时间 料液比 得率（%） 1 80 8 1:20 4.00 2 80 6 2:20 4.00 3 70 6 1:20 4.20 4 70 8 2:20 3.80 5 70 6 3:20 3.90 6 90 6 3:20 3.80 7 80 6 2:20 4.10 8 90 8 2:20 3.30 9 80 8 3:20 3.70 10 80 6 2:20 4.10 11 70 4 2:20 3.80 12 80 6 2:20 4.00 13 80 4 3:20 4.00 14 90 4 2:20 3.80 15 80 4 1:20 4.20 16 90 6 1:20 3.90
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表 4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic model
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 0.70 9 0.078 22.89 0.0006 A 0.097 1 0.097 28.44 0.0018 B 0.13 1 0.13 38.96 0.0008 C 0.11 1 0.11 31.76 0.0013 AB 0.068 1 0.068 19.86 0.0043 AC 8.100E-003 1 8.100E-003 2.38 0.1739 BC 2.025E-003 1 2.025E-003 0.59 0.4698 A2 0.17 1 0.17 49.98 0.0004 B2 0.083 1 0.083 24.28 0.0026 C2 0.033 1 0.033 9.78 0.0204 残差 0.020 6 3.404E-003 失拟项 5.125E-003 3 1.708E-003 0.33 0.8035 纯误差 0.015 3 5.100E-003 总误差 0.72 15
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