Research on Non-Enzymatic Browning of Sea Buckthorn Wine during Storage
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摘要: 为研究沙棘酒在室温贮藏期间与非酶褐变有关的主要物质的变化及其与褐变之间的关系，通过测定其在贮藏过程中褐变度、总酚、5-羟甲基糠醛（5-HMF)、抗坏血酸（VC）、还原糖、总酸和溶解氧等指标变化，采用相关性分析和通径分析，探讨影响沙棘酒贮藏过程中非酶褐变的主要原因。结果表明：在25 ℃下，随贮藏时间延长，沙棘酒褐变度逐渐增大，总酚含量和VC含量逐渐减少，5-HMF含量逐渐增加，总酸含量逐渐下降，还原糖含量和溶解氧的含量呈现先下降后上升的变化。其中，5-HMF对沙棘酒褐变度起到的直接作用最强，5-HMF与总酚的交互作用是影响沙棘酒非酶褐变度的第一决定因素，是沙棘酒室温贮藏过程中非酶褐变的主要原因。Abstract: In order to study the changes of main substances causing non-enzymatic browning of sea buckthorn wine during storage at room temperature and their relations with browning, these indexes of the browning degree, total phenol, 5-hydroxymethyl furfural (5-HMF), ascorbic acid (VC), reducing sugar, total acid and dissolved oxygen were determined during storage. The main factors influencing non-enzymatic browning of sea buckthorn wine during storage were analyzed by correlation analysis and path analysis. The results showed that the browning degree of sea buckthorn wine increased with the storage time at 25 ℃. The contents of total phenol and VC decreased gradually and the content of 5-HMF increased gradually. The total acid content decreased gradually, and the content of reducing sugar and dissolved oxygen decreased first and then increased. Among them, 5-HMF had the strongest direct effect on sea buckthorn wine browning degree. The interaction between 5-HMF and total phenols was the first determinant of the non-enzymatic browning degree of sea buckthorn wine, which were the main causes of non-enzymatic browning during the room temperature storage of sea buckthorn wine.
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Keywords:
- sea buckthorn wine /
- storage /
- non-enzymatic browning /
- path analysis
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沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋柳、酸刺，是一种药食同源植物[1]。沙棘果中富含多种营养成分和生物活性成分，如维生素C、维生素E、黄酮类以及甾醇类化合物等，其中，维生素C含量较高，每100 g果中含量高达到825～1100 mg，素有VC之王的称号[2]。目前，虽然已有较多学者对沙棘酒的发酵工艺[3]、香气成分[4]和功能特性[5]等方面进行了相关研究，但是沙棘酒在贮藏（陈酿）过程中的非酶褐变降低了该产品的商品价值，需要进一步研究。
非酶褐变的主要原因包括还原糖和氨基酸等化合物引起的羰氨反应、高温（150～200 ℃）下引起的焦糖化反应、多元酚氧化缩合反应，还有因较高VC含量发生的抗坏血酸氧化分解等[6-9]。褐变现象会造成产品颜色加深，其中，5-羟甲基糠醛（5-HMF）是美拉德反应、焦糖化反应及抗坏血酸氧化分解反应共同的中间产物，不仅是体系形成色素沉积的潜在条件，也是美拉德反应和非酶褐变的标志物[10]。此外，非酶褐变也会使风味发生改变，部分营养物质如氨基酸、糖类以及维生素C等成分损失，大大降低产品的商品价值。由于原料、加工方式以及反应体系的不同，导致非酶褐变反应的原因在不同产品中存在差异。例如，王鑫等[11]发现抗坏血酸氧化分解反应是蓝莓汁非酶促褐变的主要原因；Laurianne等[12]发现美拉德反应是橙汁发生非酶褐变反应的主要途径；崔霖芸等[13]发现影响野木瓜果汁非酶褐变的首要因素是多酚和抗坏血酸的交互作用。目前，有关果酒褐变的研究主要集中在葡萄酒[14]和枸杞酒[15]方面，对沙棘酒非酶褐变原因的研究未见报道。
本研究通过测定沙棘酒在25 ℃贮藏过程中产品的褐变度、总酚、5-羟甲基糠醛（5-HMF）、抗坏血酸（VC）、还原糖、总酸和溶解氧等指标的变化，采用相关性分析和通径分析方法，探讨影响沙棘酒贮藏过程中非酶褐变的主要原因，以期为有效控制沙棘酒非酶褐变提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙棘果鲜果 黑龙江省农科院浆果研究所提供；偏重亚硫酸钠、3,5-二硝基水杨酸、甲醇、碳酸钠、酒石酸钾钠 天津大茂试剂厂；酵母RV171 安琪酵母股份有限公司；白砂糖 黑龙江北方糖业股份有限公司；没食子酸、5-HMF 美国Sigma公司；福林酚试剂 国药集团化学试剂有限公司；2,6-二氯靛酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
HR1861榨汁机 飞利浦（中国）投资有限公司；DR102糖度仪 禹城市田园信科光学仪器有限公司；CR-410型色差仪 日本柯尼卡美能达公司；UV-1100型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；TD5A-WS型台式低速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；Specord210型高效液相色谱仪 德国耶拿分析仪器股份有限公司；HQ-30D哈希溶解氧测定仪 美国哈希公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘酒的制备及贮藏
选取成熟度好、果形完整的沙棘鲜果，清洗后沸水热烫60 s，冷却沥干后将其打浆，得到沙棘果浆，加入白砂糖，将糖度调整到18%；然后加入偏重亚硫酸钠，使其有效二氧化硫的添加量为80 mg/L。接种2%的安琪RV171酵母后，每日测定沙棘酒的酒精度，待其酒精度基本稳定在10% vol左右时，停止发酵，过滤后，装瓶密封，得到沙棘原酒。将沙棘原酒在25 ℃的贮藏温度条件下避光贮藏（陈酿），在第7周和第10周各倒罐一次。每周定期取样，连续取样10周，测定沙棘酒的褐变度A420，以及5-HMF、VC、总酚、还原糖、溶解氧以及可滴定酸等主要指标的含量变化。
1.2.2 测定指标及方法
1.2.2.1 5-HMF的测定
精密称取5-HMF 30.3 mg，用10 mL甲醇将其完全溶解，溶解后用超纯水定容至50 mL，得到6.06 mg/mL标准储备液。量取标准储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL至100 mL容量瓶中，用流动相定容，分别得到浓度为0.606、1.212、1.818、2.424、3.030 mg/L的标准溶液。以浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，得标准曲线为y=139024x+60817，R²=0.9999。
色谱柱选用Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5µm），检测波长275 nm，柱温35 ℃。取15 mL的沙棘酒，以5000 r/min离心20 min，吸取上清液后用0.45 μm滤膜过滤，待进样。以水+甲醇作为流动相体系[16]，流动相比例设置为甲醇:水溶液为10:90，流速设置为0.8 mL/min，进样量10 µL。
1.2.2.2 褐变度的测定
取15 mL的沙棘酒5000 r/min离心20 min，吸取上清液后用0.45 μm滤膜过滤，在420 nm处测定吸光度值，用吸光度A420的大小反映褐变程度[17]，重复三次，取其平均值。
1.2.2.3 其它指标的测定
总酚含量采用Folin-Ciocalteau比色法[18]；还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸法[19]；抗坏血酸含量的测定按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中2,6-二氯靛酚方法[20]；溶解氧含量的测定采用溶解氧测定仪法，将溶解氧测定仪探头感应器端缓缓浸入沙棘酒中约20 cm处，读取数值；总酸含量的测定按照GB/T 12456-2021《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法[21]；酒精度的测定按照GB 5009.225-2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》中的密度瓶法[22]。
1.2.2.4 通径分析的计算
根据相关系数和通径系数，通过公式（1）、（2）和（3）可计算出决定系数d，以及剩余通径系数Pe。决定系数表示各因素对结果的相对决定程度，剩余通径系数表示未被考虑的一切可能影响Y的因素和试验误差[23]。
单因素对Y的决定系数：di=P2i (1) 两因素对Y的决定系数：dij=2rijPiPj (2) 剩余通径系数：Pe=√1−Σ d (3) 1.3 数据处理
每个指标均重复测定三次，采用SPSS 25.0软件进行数据处理，图表采用Excel 2013和Origin 8.5完成。
2. 结果与分析
2.1 沙棘酒贮藏过程中褐变度和总酚含量的变化
如图1所示，在避光陈酿条件下，随贮藏时间的延长，沙棘酒的褐变度增加较快，且每周之间的差异显著（P<0.05），在25 ℃贮存10周后，褐变度值是初始值的2.07倍，此时沙棘酒已经褐化；对于总酚含量的变化来说，每周之间的变化差异也显著（P<0.05），且呈逐渐降低的趋势，可能是因为多酚氧化的醌类物质增加所致[24]，这与白葡萄酒贮藏过程的褐变规律相似[25-26]。
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2.2 沙棘酒贮藏过程中5-HMF含量和VC含量的变化
由图2可以看出，随着贮藏时间的延长，虽然沙棘酒中5-HMF含量呈显著（P<0.05）上升趋势，但其含量数值并不高，在陈酿结束后，其含量仅为1.44 μg/L，要远低于桃汁在25 ℃贮藏贮藏40 d后的5-HMF的产生量（6.63 mg/L）[27]。沙棘酒25 ℃贮藏中，在前1~4周时，VC含量显著（P<0.05）下降，这是因为VC极易氧化分解成为含双羰基的化合物，并进一步发生氧化、聚合等反应形成有色物质而引起褐变[28]，随后其下降速率相对缓慢，这一现象与张鑫等[29]研究的猕猴桃果酒中VC含量的变化规律十分相似。
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图 2 沙棘酒贮藏过程中5-HMF含量和VC含量的变化Figure 2. Changes of 5-HMF content and VC content in sea buckthorn wine during storage![]()
图 4 沙棘酒贮藏过程中溶解氧含量的变化Figure 4. Changes of dissolved oxygen content in sea buckthorn wine during storage2.3 沙棘酒贮藏过程中还原糖含量和总酸含量的变化
由图3可知，沙棘酒在陈酿过程中还原糖含量呈先降低后升高的趋势，在第9周后达到稳定，为2.03 mg/L，后期还原糖含量的微弱上升可能与沙棘酒中多糖等非发酵性残糖转化为葡萄糖、果糖、阿拉伯糖或半乳糖等有关[23]，也可能与倒酒过程中酒液挥发逸出导致的浓度增加有关[30]。沙棘酒中总酸含量在第8周后呈显著下降（P<0.05）趋势，到陈酿结束后，总酸含量由0.88 g/L下降到0.78 g/L，降幅为11.36%，这可能与一些有机酸在陈酿过程中生成酯类物质有关。
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图 3 沙棘酒贮藏过程中还原糖含量和总酸含量的变化Figure 3. Changes of reducing sugar content and titratable acid content in seabuckthorn wine during storage2.4 沙棘酒贮藏过程中溶解氧含量的变化
沙棘酒在贮藏过程中溶解氧的含量表现为先下降后上升的趋势。由于沙棘酒中较多的还原类物质，如多酚和VC等物质的消耗，使得贮藏前期溶解氧含量快速降低[10]，到第5周时，溶解氧含量达到最低（P<0.05），为1.27 mg/L。但是，在此之后，由于第7和第10周的倒罐处理，使沙棘酒中溶解氧含量在后期上升较快，在贮藏结束时，溶解氧含量达到了4.68 mg/L，显著高于初始时的溶解氧含量（P<0.05）。
2.5 沙棘酒贮藏过程中褐变度与主要致褐因子的相关性分析
表1为沙棘酒25 ℃贮藏过程中非酶褐变反应主要因子与沙棘酒褐变度的相关性。由表1可看出各个主要影响因素之间的相关系数，褐变度A420与抗坏血酸、总酸以及总酚呈显著负相关（P<0.05），即褐变度随着抗坏血酸、总酸和总酚的增加而减少；褐变度与5-HMF呈极显著正相关（P<0.01），即随着5-HMF的积累，褐变度逐渐增大。溶解氧与还原糖之间呈显著正相关（P<0.05），但是二者均与沙棘酒褐变度无显著相关关系（P˃0.05）。由表1还可看到，5-HMF、抗坏血酸、总酸和总酚之间显著负相关（P<0.05），其中，5-HMF和总酚之间呈极显著负相关（P<0.01），且5-HMF、抗坏血酸和总酚都与褐变度A420显著相关（P<0.05，P<0.01）。因此，选择5-HMF、抗坏血酸、总酚作为下一步通径分析对象。
表 1 各因素间的相关系数Table 1. Correlation coefficient of each factor指标 A420 5-HMF 抗坏血酸 总酸 还原糖 溶解氧 总酚 A420 1 0.934** −0.816* −0.777* 0.513 0.578 −0.801* 5-HMF 1 −0.878* −0.821* 0.276 0.443 −0.908** 抗坏血酸 1 0.781* 0.040 −0.047 0.965** 总酸 1 −0.234 −0.327 0.687 还原糖 1 0.840* 0.011 溶解氧 1 −0.098 总酚 1 注：*表示显著相关；**表示极显著相关；表2同。 选择5-HMF、抗坏血酸和总酚等三个指标作为因子，将各个因子分别以子分别以X1、X2、X3表示；Y1值为褐变度A420，其相关性系数以及显著性如表2所示。
表 2 三个因素间的相关系数分析Table 2. Analysis of correlation coefficient among three factors因子 5-HMF（X1） 抗坏血酸（X2） 总酚（X3） A420（Y1） X1 1 0.934** X2 −0.878* 1 −0.816* X3 −0.908** 0.965** 1 −0.801* 2.6 沙棘酒非酶褐变度的通径分析
根据表2中相关系数，计算出其直接通径系数与间接通径系数。由表3可看出，25 ℃贮藏条件下沙棘酒褐变度第一直接作用是5-HMF，其P1值为1.1750；其次为总酚，P3=0.8490，抗坏血酸对其影响最小，P2=−0.6040。通过公式（1）、（2）和（3）计算得到：d1=1.3806，d2=0.3650，d3=0.7208，d12=1.2462，d13=−1.8115，d23=−0.9896，Σd=0.9111，Pe=0.2980。
表 3 各因素间的通径系数分析Table 3. Path analysis of each factor因子 X1 X2 X3 X1 1.1750* 0.5303 −0.7708 X2 −1.0320 −0.6040* 0.8192 X3 −1.0660 −0.5820 0.8490* 注：*为直接通径系数Pi；其余为间接通径系数Pij。 将各个因素的决定系数值按照绝对值的大小排列，可以得出，5-HMF与总酚的交互作是影响沙棘酒在25 ℃贮藏条件下褐变的第一决定因素，d13=−1.8115，第二决定因素是5-HMF单独作用，d1=1.3806，第三决定因素是5-HMF与抗坏血酸的交互作用，d12=1.2462，依次类推；决定系数总和Σd=0.9111，Pe=0.2980，表明已考虑了影响沙棘酒非酶褐变的主要因素。
3. 结论
沙棘酒在25 ℃贮藏条件下，褐变度随贮藏时间的延长而增大，其活性物质总酚和VC含量随贮藏时间的延长而降低，非酶褐变指示因子5-HMF含量随着贮藏时间的延长逐渐增加，总酸含量逐渐下降，还原糖含量和溶解氧的含量呈现先下降后上升的变化，且每个指标在贮藏结束后与贮藏之前差异显著（P<0.05）。通过对沙棘酒中的5-HMF、抗坏血酸和总酚等成分分别与褐变度的通径系数分析，结果表明5-HMF对沙棘酒褐变度起到的直接作用最强，5-HMF与总酚的交互作用是影响沙棘酒非酶褐变度的第一决定因素，是沙棘酒贮藏过程中非酶褐变的主要原因。本研究初步探讨了沙棘酒在室温贮藏期间与非酶褐变有关的主要物质的变化及其与褐变之间的关系，有关非酶褐变机理尚未深入解析，有待进一步研究。
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图 2 沙棘酒贮藏过程中5-HMF含量和VC含量的变化
Figure 2. Changes of 5-HMF content and VC content in sea buckthorn wine during storage
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图 4 沙棘酒贮藏过程中溶解氧含量的变化
Figure 4. Changes of dissolved oxygen content in sea buckthorn wine during storage
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图 3 沙棘酒贮藏过程中还原糖含量和总酸含量的变化
Figure 3. Changes of reducing sugar content and titratable acid content in seabuckthorn wine during storage
表 1 各因素间的相关系数
Table 1 Correlation coefficient of each factor
指标 A420 5-HMF 抗坏血酸 总酸 还原糖 溶解氧 总酚 A420 1 0.934** −0.816* −0.777* 0.513 0.578 −0.801* 5-HMF 1 −0.878* −0.821* 0.276 0.443 −0.908** 抗坏血酸 1 0.781* 0.040 −0.047 0.965** 总酸 1 −0.234 −0.327 0.687 还原糖 1 0.840* 0.011 溶解氧 1 −0.098 总酚 1 注：*表示显著相关；**表示极显著相关；表2同。 
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表 2 三个因素间的相关系数分析
Table 2 Analysis of correlation coefficient among three factors
因子 5-HMF（X1） 抗坏血酸（X2） 总酚（X3） A420（Y1） X1 1 0.934** X2 −0.878* 1 −0.816* X3 −0.908** 0.965** 1 −0.801*
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表 3 各因素间的通径系数分析
Table 3 Path analysis of each factor
因子 X1 X2 X3 X1 1.1750* 0.5303 −0.7708 X2 −1.0320 −0.6040* 0.8192 X3 −1.0660 −0.5820 0.8490* 注：*为直接通径系数Pi；其余为间接通径系数Pij。
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