Effects of Vitamin E on the Properties of β-Carotene Nanoemulsions and Beverage Stability
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摘要: 为提高β-胡萝卜素的水溶性和稳定性，本研究以吐温80、吐温60和磷脂为乳化剂，维生素E为抗氧化剂制备了纳米乳液。测定了纳米乳液的粒径、透光率、色价、储藏稳定性和应用稳定性。结果显示，维生素E对纳米乳液粒径和透光率有轻微影响，对包埋率和色价没有影响。在25、37 ℃和光照下储藏28 d期间纳米乳液的透光率没有发现明显变化，55 ℃储藏期间透光率呈现下降趋势。在25 ℃和光照下储藏28 d期间色价没有发现明显变化，37和55 ℃储藏期间色价有所降低。不同含量的维生素E均提高了β-胡萝卜素的色价保留率。维生素E的加入显著提高了β-胡萝卜素在酸性和中性饮料中的应用稳定性，且添加量为3%时饮料稳定性最佳。Abstract: In order to improve the water solubility and stability of β-carotene, nanoemulsions were prepared using tween 80, tween 60 and lecithin as emulsifiers and vitamin E as antioxidants. The particle size, light transmittance, color value, storage stability and application stability of the nanoemulsions were measured. The results showed that the vitamin E had a slight effect on the particle size and light transmittance of the nanoemulsions, but had no effect on the encapsulation efficiency and color value. There was no change in light transmittance of nanoemulsions during storage at 25, 37 ℃ and light for 28 days, but showed a downward trend when storaged at 55 ℃. The color value of the nanoemulsions did not change significantly during storage at 25 ℃ and light for 28 days, but decreased when storage at 37 and 55 ℃. Different content of vitamin E improved the color value retention rate of β-carotene. The addition of vitamin E significantly improved the application stability of β-carotene in acidic and neutral beverages, and the best stability of the beverages occurred when the vitamin E content was 3%.
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Keywords:
- β-carotene /
- antioxidant /
- vitamin E /
- stability /
- beverage
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流行病学研究发现类胡萝卜素如β-胡萝卜素可以降低某些癌症、心血管疾病、黄斑病变和白内障的患病风险[1]。相关研究表明类胡萝卜素是通过防止氧化损伤、淬灭单线态氧、改变转录活性以及用作维生素A的前体等生理机制给人体健康带来诸多益处[2-3]。β-胡萝卜素的生物利用度主要取决于食物基质，机体对植物来源的β-胡萝卜素吸收相对较低，从而为开发用于食物强化和补充的β-胡萝卜素产品提供了机会[4]，因此β-胡萝卜素作为营养强化剂在食品工业中的应用引起了广泛关注。但是，β-胡萝卜素不溶于水，并且由于其多不饱和结构而对光、热、异构化和降解高度敏感，成为限制其在食品和饮料中应用的主要因素[5-6]。
目前，基于乳液的递送系统被广泛用于封装和保护疏水性生物活性成分，可以用于改善β-胡萝卜素在水基产品中的溶解性，延缓氧化降解，提高稳定性[1]。而纳米乳液是动力学稳定的胶体递送系统，液滴尺寸较小，与传统乳液相比具有更高的稳定性和溶解性[7]。影响乳液中β-胡萝卜素降解的因素包括乳液系统的组成和环境条件，例如乳化剂、抗氧化剂、光、热和食物系统等[8-9]。已有研究发现吐温80和大豆卵磷脂混合作为表面活性剂，可以制备稳定的纳米乳液[10]。而且当抗氧化剂以合适的浓度存在时，可以显著抑制或延迟β-胡萝卜素的氧化降解[2]。因此，本研究以吐温和磷脂为乳化剂制备了一支β-胡萝卜素纳米乳液，并探究了抗氧化剂对β-胡萝卜素稳定性的影响，研究结果将对开发用于食品、饮料行业的β-胡萝卜素传递系统提供一定的参考价值。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
β-胡萝卜素油悬浮液 含量30%，浙江医药有限公司新昌制药厂；聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯（吐温60） 江苏四新界面剂科技有限公司；聚氧乙烯山梨醇单油酸酯（吐温80） Kerry集团；磷脂 嘉吉食品（天津）有限公司；辛癸酸甘油酯 杭州油脂化工有限公司；维生素E 浙江伊宝馨生物科技股份有限公司；酶处理异槲皮苷、迷迭香提取物、维生素E乳液 恒枫食品科技有限公司；维生素C 黑龙江新和成生物科技有限公司；EDTA-2Na 南通奥凯生物技术开发有限公司；丙酮、正己烷 上海凌峰化学试剂有限公司；无水乙醇 杭州双林化工试剂有限公司。
磁力搅拌器、移液枪 艾本德中国有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津有限公司；HunterLab ColorQuest XE分光色差仪 美国Hunter Lab公司；IKA T25高速分散机 德国IKA公司；APV1000均质机 斯必克流体技术有限公司；数显恒温水浴锅 国华（常州）仪器制造有限公司；NanoBrook Omni粒径分析仪 美国布鲁克海文仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 β-胡萝卜素纳米乳液制备
准确称取β-胡萝卜素，加入辛癸酸甘油酯中，搅拌条件下加热至β-胡萝卜素完全溶解得到油相（10 wt%）。水相由吐温60（3 wt%）、吐温80（4 wt%）、磷脂（3 wt%）、甘油（60 wt%）和水组成，充分搅拌至完全溶解。将油相添加至水相中，10000 r/min剪切10 min。剪切完成后600 bar均质3次。脂溶性抗氧化剂在β-胡萝卜素完全溶解降温后加入。
1.2.2 抗氧化剂选择
在中性（不含柠檬酸和柠檬酸钠）和酸性（水中添加8%白砂糖，0.08%柠檬酸，0.035%柠檬酸钠）饮料中添加0.05% β-胡萝卜素乳液。在两种β-胡萝卜素饮料中添加不同抗氧化剂，包括VC、VE、EDTA-2Na、迷迭香提取物和酶处理异槲皮苷。将β-胡萝卜素饮料置于自然光下储藏28 d并利用色差仪测定储藏期间颜色变化，测定指标为L*、a*和b*。L*表示样品的亮度值，a*表示样品的红度值，b*表示样品的黄度值，并以b*为指标筛选合适的抗氧化剂。
1.2.3 β-胡萝卜素乳液粒径测定
采用NanoBrooker Omni粒径分析仪测定样品的粒径分布。乳状液稀释100倍后，在25 ℃条件下，采用173°散射角测量且折射系数为1.450，所有的测定均重复三次。
1.2.4 β-胡萝卜素乳液透光率测定
将β-胡萝卜素乳液稀释至0.5%后在680 nm下测定透光率。
1.2.5 β-胡萝卜素包埋率测定
β-胡萝卜素的包埋率的测定参考Hu等[11]的方法，并进行部分修改。β-胡萝卜素乳液在10000 r/min条件下离心40 min，注射器吸取下层清液。吸取0.1 mL β-胡萝卜素乳液和0.1 mL离心后清液，加入2 mL无水乙醇和5 mL正己烷，涡旋1 min后，8000 r/min离心10 min，吸取上层清液后，450 nm波长下测定吸光度。β-胡萝卜素在乳液中的包埋率由下式（1）计算：
包埋率(%)=M1−M0M1×100 (1) 式中：M0和M1分别表示游离β-胡萝卜素和乳液中总β-胡萝卜素含量。
1.2.6 β-胡萝卜素乳液色价测定
准确称取1 g乳液，加水定容至100 mL得到稀释液。准确移取3.0 mL上述稀释液，并用丙酮定容至100 mL。以丙酮为空白，在450 nm下测定稀释液的吸光度值A，色价计算公式（2）如下：
色价=A×1043×m (2) 式中：A为稀释液吸光度值；m为乳液质量，g。
1.2.7 储藏稳定性跟踪
所有β-胡萝卜素乳液置于25、37、55 ℃和自然光下储藏28 d，第7、14和28 d测定乳液的透光率和色价。
1.2.8 β-胡萝卜素饮料制备
酸性和中性饮料中添加0.05% β-胡萝卜素乳液。饮料置于自然光下储藏60 d，利用色差仪测定饮料颜色，测定指标为L*、a*和b*，并以b*为指标筛选合适的抗氧化剂浓度。
1.2.9 动力学模型构建
对不同维生素E含量的β-胡萝卜素乳液应用于酸性和中性饮料后储藏期间的b*进行零级和一级动力学模型拟合，拟合公式如（3）和（4）所示：
b∗t=b∗0−k0t (3) b∗t=b∗0exp（−k1t） (4) 式中：
b∗t 为储藏期间的测定值；b∗0 为相应的响应初始值；k0为零级反应动力学常数；k1为一级反应动力学反应常数。1.3 数据处理
每个样品进行3次重复测定，实验结果以平均值±标准偏差表示；所有数据用Origin 9.0软件绘图；采用SPSS软件进行单因素ANOVA分析处理，当P<0.05时被认为差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 抗氧化剂的选择
研究表明，引起β-胡萝卜素氧化降解的因素主要有自动氧化、热氧化、光氧化、单线态氧和金属离子催化的氧化、酸降解以及由自由基引发的氧化反应[12]。添加抗氧化剂后可以通过清除自由基、氧气、螯合金属离子等方式抑制氧化过程[13]。前期选择维生素C、维生素E、EDTA-2Na、迷迭香提取物和酶处理异槲皮苷提取物作为抗氧化剂添加至酸性和中性β-胡萝卜素饮料中。以不添加抗氧化剂的β-胡萝卜素饮料为空白进行对照。图1为添加不同抗氧化剂的中性和酸性β-胡萝卜素饮料在储藏期间b*的变化。
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图 1 β-胡萝卜素中性（a）和酸性（b）饮料光照储藏28 d期间b*的变化Figure 1. Change of b* of β-carotene neutral （a） and acid （b） beverages during storage under light for 28 days由图1a可知，中性空白β-胡萝卜素饮料在储藏14 d后，β-胡萝卜素降解，饮料颜色完全褪去。添加维生素C后，中性β-胡萝卜素饮料b*在储藏期间逐渐降低，但稳定性明显优于空白饮料。添加维生素E、EDTA-2Na、迷迭香提取物和酶处理异槲皮苷的中性饮料在储藏期间基本保持颜色稳定。由图1b可知，酸性空白β-胡萝卜素饮料在储藏期间b*逐渐降低，28 d后颜色未完全褪去。添加酶处理异槲皮苷的酸性饮料在储藏期间b*逐渐降低，后期稳定性优于空白饮料。添加维生素C、维生素E、EDTA-2Na和迷迭香提取物的酸性饮料在储藏期间基本保持颜色稳定。根据上述结果发现，维生素E、EDTA-2Na和迷迭香提取物对β-胡萝卜素饮料均有较好的保护作用。后续研究以维生素E作为抗氧化剂为例，探究了不同含量维生素E对β-胡萝卜素乳液性质、储藏稳定性和应用稳定性的影响。
2.2 乳液初始表征
2.2.1 粒径和外观
纳米乳液的分散相质点非常小，加到水中后澄清透明，更适合添加到食品工业中要求外观澄清透明的饮料中[14]。β-胡萝卜素乳液的粒径分布、外观和饮料外观如图2所示。添加不同含量的维生素E对β-胡萝卜素乳液的粒径分布有轻微影响。所有β-胡萝卜素乳液均呈现双峰分布。未添加维生素E的空白β-胡萝卜素乳液第一个峰在20 nm左右，此峰可能为连续相中聚集体的粒径分布，第二个峰在130 nm左右，为乳化油滴的粒径分布[15]。随着维生素E含量的增加，β-胡萝卜素乳液的粒径分布有轻微右移的趋势。当维生素E含量为4%时，第二个峰右移至160 nm左右。液滴尺寸取决于油相粘度、油相成分的分子量等多种因素，粒径的变化可能是因为维生素E的添加改变了油相组成。Sharif等[16]也发现维生素E的加入（2%~4%）可能会导致粘度和粒径的增大。
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图 2 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的粒径和外观Figure 2. Particle size and appearance of β-carotene emulsion with different content of vitamin E在外观上，所有β-胡萝卜素乳液均呈现深橙色，这与Qian等[2]制备的乳液外观非常相似。将β-胡萝卜素乳液以0.05%添加量应用于酸性和中性饮料后，外观澄清透明（图中为酸性饮料示例），表明本研究制备的β-胡萝卜素乳液可以应用于要求有一定色泽且澄清透明的饮料中。
2.2.2 透光率
乳液属于多分散体系，由许多小液滴组成，当光照射到乳液表面时，会发生反射、散射和透过等现象。在食品工业中，乳液的浊度值非常重要，因为乳液在某些食品基质中的使用取决于其浊度值的大小，透光率越大，给饮料带来的浊度越小[17]。图3为添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的透光率。未添加维生素E的空白β-胡萝卜素乳液透光率约为80%。随着维生素E的加入，β-胡萝卜素乳液透光率有轻微下降趋势，这与乳液粒径的变化结果相似，可能是因为当油相含量固定时，乳液粒径是影响浊度的主要因素，从而导致透光率的变化[18]。
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图 3 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的透光率注：图中不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图4同。Figure 3. Transmittance of β-carotene emulsions with different content of vitamin E2.2.3 包埋率和色价
图4为不同维生素E含量对β-胡萝卜素包埋率的影响，有研究表明，乳液中β-胡萝卜素的包埋率可能会影响其储藏稳定性[19]。据文献[20]报道，吐温和磷脂两者复配通常会显示出较高的包埋率。由图4可知，未添加维生素E的空白乳液中β-胡萝卜素的包埋率为90.40%，表明本研究制备的乳液对β-胡萝卜素有较好的保护作用。而且，维生素E的加入，对β-胡萝卜素的包埋率没有显著影响（P˃0.05）。这与刘蕾[19]发现添加不同含量的EGCG对β-胡萝卜素的包埋率没有显著影响的结果相似。
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图 4 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的包埋率和色价Figure 4. Encapsulation efficiency and color value of β-carotene emulsions with different content of vitamin E色价是商业上色素浓度的一种评价方式。由图4可知，未添加维生素E的空白β-胡萝卜素乳液色价约为2300。同时，维生素E含量对β-胡萝卜素乳液的色价没有影响。
2.3 乳液储藏稳定性
2.3.1 透光率
图5为添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液在25、37、55 ℃和光照条件下透光率的变化。由图5可知，在25、37 ℃和光照条件下储藏28 d期间乳液透光率基本保持稳定。吐温是一种小分子乳化剂，分子结构紧密，在均质过程形成乳液时能迅速分散在油水界面降低乳液表面张力，形成较小的乳滴，从而保证了储藏过程中乳液的稳定[21]。在55 ℃储藏条件下，所有β-胡萝卜素乳液储藏至14 d后透光率均出现下降趋势。可能原因是高温加速了分子的热运动，使乳液微粒聚集，从而粒径增大，透光率下降[22-23]。同时Zahi等[22]也提出乳液储藏在较高温度下，液滴碰撞的机会更多，从而导致更高的浊度值。
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图 5 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液在25 ℃（a）、37 ℃（b）、55 ℃（c）和光照（d）条件下透光率的变化Figure 5. Changes of light transmittance of β-carotene emulsion with different content of vitamin E under 25 ℃ (a), 37 ℃ (b), 55 ℃ (c) and light (d)2.3.2 色价
图6为添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液在25、37、55 ℃和光照条件下色价的变化。由于不饱和双键的存在，β-胡萝卜素在储藏过程中容易发生氧化降解，而储藏温度和光照等条件可能会对β-胡萝卜素乳液的稳定性产生较大影响[24]。由图6可知，未添加维生素E的空白β-胡萝卜素乳液，在25 ℃和光照条件下储藏28 d后色价分别为2220和2332。在37和55 ℃条件下储藏过程中色价分别降低至1813和1109。结果表明，较高的储藏温度会明显影响β-胡萝卜素的稳定性。
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图 6 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液在25 ℃（a）、37 ℃（b）、55 ℃（c）和光照（d）条件下色价的变化Figure 6. Changes of color value of β-carotene emulsion with different content of vitamin E under 25 ℃ (a), 37 ℃ (b), 55 ℃ (c) and light (d)维生素E的加入使β-胡萝卜素乳液在37和55 ℃储藏28 d后，色价分别提高至2100和1600左右，说明维生素E的加入可以有效提高β-胡萝卜素的稳定性。这与Tahir Mehmood等[17]发现维生素E的加入显著提高了β-胡萝卜素的保留率的研究结果相似，可能原因是维生素E可以清除自由基。刘蕾[19]也发现乳液中添加抗氧化剂可以清除自由基以减缓β-胡萝卜素的降解。而维生素E的含量对28 d储藏期间色价稳定性没有明显影响。
2.4 应用稳定性
综合以上结果发现，维生素E的添加提高了乳液储藏期间β-胡萝卜素的保留率，后续观察不同维生素E含量对β-胡萝卜素在饮料中稳定性的影响。图7为β-胡萝卜素乳液应用在中性和酸性体系后在光照条件下储藏60 d期间b*的变化。b*可以反映饮料的黄色程度[25]。前期进行抗氧化剂选择时已经发现，中性空白β-胡萝卜素饮料首先出现明显的褪色现象，储藏至14 d后黄色完全褪去。维生素E加入后，中性饮料的b*在储藏14 d内均未出现明显的下降现象，表明维生素E的加入提高了中性饮料体系中β-胡萝卜素的稳定性。酸性空白β-胡萝卜素饮料储藏14 d后，b*开始下降，42 d后黄色完全褪去。维生素E加入后，28 d内未发现明显下降现象。酸性体系中β-胡萝卜素的稳定性优于中性体系，表明制备的β-胡萝卜素乳液更适合应用于酸性体系中。储藏60 d后发现，维生素E含量为3%时，对饮料中β-胡萝卜素的保护作用最好。
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图 7 β-胡萝卜素中性（a）和酸性（b）饮料光照储藏60 d期间b*的变化Figure 7. Change of b* of β-carotene neutral （a） and acid （b） beverages during storage for 60 days of light表1和表2为酸性和中性饮料在储藏期间β-胡萝卜素的动力学模型。通过对β-胡萝卜素饮料的b*进行动力学模型分析发现，零级反应动力学的回归系数R2均高于一级反应动力学，表明在酸性和中性饮料中β-胡萝卜素的b*变化均比较符合零级反应[26]。Mesenier等[27]也发现β-胡萝卜素饮料中添加维生素C和迷迭香提取物后，在40 ℃条件下b*的变化符合零级反应。维生素E的加入减缓了酸性和中性饮料中胡萝卜素的降解率，且维生素E含量为3%时降解率低，表明该维生素E含量对酸性和中性饮料中的β-胡萝卜素的保护作用最好。维生素E等抗氧化剂发挥抗氧化或促氧化作用会受到其浓度的影响，在低浓度条件作用下呈现抗氧化趋势，而在高浓度条件下则表现为促氧化的现象。研究发现在高浓度维生素E条件下，随着时间发展自由基会不断积累，从而诱导产生烷基自由基和过氧化自由基，发生促氧化作用[28]。
表 1 酸性饮料中的β-胡萝卜素的动力学模型Table 1. Dynamic model of β-carotene in acidic beverages酸性饮料 零级反应 一级反应 速率常数k0 回归系数R2 速率常数k1 回归系数R2 0% 2.0518 0.8814 0.0374 0.7931 1% 0.5541 0.8583 0.0077 0.8041 2% 0.2209 0.8164 0.0029 0.7944 3% 0.2212 0.8424 0.0029 0.8215 4% 0.3028 0.8807 0.0041 0.8549 表 2 中性饮料中的β-胡萝卜素的动力学模型Table 2. Dynamic model of β-carotene in neutral beverages中性饮料 零级反应 一级反应 速率常数k0 回归系数R2 速率常数k1 回归系数R2 0% 5.4079 0.8055 0.0945 0.4358 1% 0.7616 0.8165 0.0111 0.6653 2% 0.6739 0.8125 0.0098 0.7346 3% 0.4429 0.8928 0.0064 0.8574 4% 0.5688 0.8769 0.0084 0.8209 3. 结论
本研究制备了包埋率高的β-胡萝卜素纳米乳液，探究了不同维生素E含量对乳液粒径、透光率、包埋率和色价的影响，不同条件下的储藏稳定性及酸性和中性饮料中的应用稳定性。β-胡萝卜素乳液的包埋率大于90%，色价约为2300。维生素E的加入对纳米乳液粒径和透光率有轻微影响，但对包埋率和色价没有明显影响。在55 ℃条件下，所有β-胡萝卜素乳液储藏至14 d后透光率出现下降趋势，其他条件下基本稳定。37和55 ℃储藏期间，β-胡萝卜素乳液的色价逐渐下降，维生素E的加入改善了其色价稳定性。β-胡萝卜素乳液添加量为0.05%时，饮料外观澄清透明，在酸性饮料中的稳定性优于中性饮料，3%的维生素E添加量对饮料中β-胡萝卜素保护作用最佳。
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图 1 β-胡萝卜素中性（a）和酸性（b）饮料光照储藏28 d期间b*的变化
Figure 1. Change of b* of β-carotene neutral （a） and acid （b） beverages during storage under light for 28 days
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图 2 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的粒径和外观
Figure 2. Particle size and appearance of β-carotene emulsion with different content of vitamin E
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图 3 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的透光率
注：图中不同小写字母表示差异显著，P<0.05；图4同。
Figure 3. Transmittance of β-carotene emulsions with different content of vitamin E
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图 4 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液的包埋率和色价
Figure 4. Encapsulation efficiency and color value of β-carotene emulsions with different content of vitamin E
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图 5 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液在25 ℃（a）、37 ℃（b）、55 ℃（c）和光照（d）条件下透光率的变化
Figure 5. Changes of light transmittance of β-carotene emulsion with different content of vitamin E under 25 ℃ (a), 37 ℃ (b), 55 ℃ (c) and light (d)
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图 6 添加不同含量维生素E的β-胡萝卜素乳液在25 ℃（a）、37 ℃（b）、55 ℃（c）和光照（d）条件下色价的变化
Figure 6. Changes of color value of β-carotene emulsion with different content of vitamin E under 25 ℃ (a), 37 ℃ (b), 55 ℃ (c) and light (d)
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图 7 β-胡萝卜素中性（a）和酸性（b）饮料光照储藏60 d期间b*的变化
Figure 7. Change of b* of β-carotene neutral （a） and acid （b） beverages during storage for 60 days of light
表 1 酸性饮料中的β-胡萝卜素的动力学模型
Table 1 Dynamic model of β-carotene in acidic beverages
酸性饮料 零级反应 一级反应 速率常数k0 回归系数R2 速率常数k1 回归系数R2 0% 2.0518 0.8814 0.0374 0.7931 1% 0.5541 0.8583 0.0077 0.8041 2% 0.2209 0.8164 0.0029 0.7944 3% 0.2212 0.8424 0.0029 0.8215 4% 0.3028 0.8807 0.0041 0.8549 
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表 2 中性饮料中的β-胡萝卜素的动力学模型
Table 2 Dynamic model of β-carotene in neutral beverages
中性饮料 零级反应 一级反应 速率常数k0 回归系数R2 速率常数k1 回归系数R2 0% 5.4079 0.8055 0.0945 0.4358 1% 0.7616 0.8165 0.0111 0.6653 2% 0.6739 0.8125 0.0098 0.7346 3% 0.4429 0.8928 0.0064 0.8574 4% 0.5688 0.8769 0.0084 0.8209
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