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中国精品科技期刊2020

酶解与发酵联合处理对黑木耳还原糖含量及抗氧化性能的影响

牟佳红, 梁安雯, 覃超琳, 罗曈, 王碧玮, 孙庆申

牟佳红,梁安雯,覃超琳,等. 酶解与发酵联合处理对黑木耳还原糖含量及抗氧化性能的影响[J]. 食品工业科技,2022,43(7):139−147. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021070175.
引用本文: 牟佳红,梁安雯,覃超琳,等. 酶解与发酵联合处理对黑木耳还原糖含量及抗氧化性能的影响[J]. 食品工业科技,2022,43(7):139−147. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021070175.
MU Jiahong, LIANG Anwen, QIN Chaolin, et al. Effect of Enzymatic Hydrolysis Combined with Fermentation Treatment on Reducing Sugar Content and Antioxidant Performance of Auricularia auricula[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(7): 139−147. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021070175.
Citation: MU Jiahong, LIANG Anwen, QIN Chaolin, et al. Effect of Enzymatic Hydrolysis Combined with Fermentation Treatment on Reducing Sugar Content and Antioxidant Performance of Auricularia auricula[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(7): 139−147. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2021070175.

酶解与发酵联合处理对黑木耳还原糖含量及抗氧化性能的影响

详细信息
    作者简介:

    牟佳红(1995−),女,硕士研究生,研究方向:食品与药品活性物质的挖掘与研发,E-mail:924663736@qq.com

    通讯作者:

    孙庆申(1977−),男,博士,教授,研究方向:食品与药品活性物质的挖掘与研发,E-mail:sunqingshen@hlju.edu.cn

  • 中图分类号: TS255

Effect of Enzymatic Hydrolysis Combined with Fermentation Treatment on Reducing Sugar Content and Antioxidant Performance of Auricularia auricula

  • 摘要: 以黑木耳为原料,通过酶解与发酵联合处理,提升木耳中的还原糖含量和抗氧化能力,为黑木耳产品的开发利用提供理论基础。实验采用纤维素酶、果胶酶或复合酶处理黑木耳浆,在此基础上利用植物乳杆菌(L. plantarum)和发酵乳杆菌(L. fermentum)复合发酵,以还原糖含量为指标,通过单因素优化了木耳酶解过程中料液比、复合酶用量、酶解时间、酶解温度和酶解pH;再以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除率为指标,优化了木耳酶解液在发酵过程中的发酵温度、接种量和发酵时间,最终利用响应面试验确定黑木耳发酵的最佳工艺条件。结果表明,按每克木耳浆计,在果胶酶与纤维素酶总加酶量3.2%(w/w),果胶酶与纤维素酶质量比为2:3(w/w),温度50 ℃,pH5.50,酶解时间3.5 h条件下酶解效果最佳,还原糖含量达到(6.94±0.24)mg/mL。在植物乳杆菌(L. plantarum)与发酵乳杆菌(L. fermentum)添加比例为1:1,发酵温度37 ℃,接菌量3%,发酵时间8 h条件下,木耳发酵液DPPH自由基清除率达到92.46%±3.22%。酶解和发酵联合处理的木耳浆中还原糖含量和抗氧化性能均得到明显提升。
    Abstract: In order to improve the reducing sugar content and antioxidant capacity of Auricularia auricula, thus providing new insight into the development and utilization of Auricularia auricula-based products, in this paper, the Auriculari aauricula pulp was subjected to the joint treatment of enzymatic hydrolysis and fermentation. Cellulase, pectinase or the combination of the two enzymes were used to hydrolyze the Auricularia auricula pulp, which was then co-fermented by Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum alone or in combination. Single-factor experiments involving the material to liquid ratio, the amount of enzyme used, zymolysis time, temperature and pH were optimized using reducing sugar content as criteria. And the effects of inoculum amount, the fermentation temperature and time of the fungus zymolysis liquid on the 1,1-Diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) radical scavenge rate were optimized, and finally the response surface experiment was used to determine the optimal parameters for Auricularia auricula fermentation. The results showed that the maximal reducing sugar content reached (6.94±0.24) mg/mL when 3.2% (w/w on Auricularia auricula pulp base) of pectinase and cellulase was added, and the mass ratio of pectinase and cellulase was 2:3 (w/w) under the following enzymatic hydrolysis conditions: Temperature of 50 ℃, pH5.50 for 3.5 h. Under the conditions of L. plantarum and L. fermentum ratio of 1:1, fermentation temperature at 37 ℃, inoculation amount at 3%, and fermentation time for 8 h, the DPPH free radical scavenging rate of the fermentation broth reached 92.46%±3.22%. The reducing sugar content and antioxidant capacity of the Auricularia auricula pulp treated by enzymatic hydrolysis and fermentation had been significantly improved.
  • 黑木耳(Auricularia auricula)是我国栽培及食用历史悠久的大型食药用菌[1],以其极高的营养价值和独特的口感受到各地特别是中国、日本和韩国等东亚国家消费者的青睐[2]。黑木耳的子实体中含有丰富的杂多糖,主要由D-葡萄糖残基组成,含有各种β(1→3)分支侧链,这些侧链成分包括葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸[3]。黑木耳主要成分为灰分(3.6%)、蛋白质(12.5%)、脂肪(1.7%)、总碳水化合物(包括水溶性多糖、不溶性纤维、甲壳素、果胶,占66.1%)、氨基酸和矿质元素等[4]。黑木耳中的多糖具有抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、抗凝血[7]、抗衰老[8]、抗高胆固醇血症[9]等多种生物学活性;不溶性纤维通过调节肠道微生态来发挥益生元活性[10];除此之外,黑木耳中含有的黑色素还可以预防酒精肝损伤[11]。目前黑木耳产品形式主要有黑木耳干品、黑木耳超微粉、黑木耳多糖等,产品形式较为单一,难以拉动黑木耳产品市场,所以,木耳深加工产品在未来食用菌市场具有广阔的开发前景。

    但是黑木耳作为大型真菌,其细胞壁主要有果胶、纤维素和半纤维素等成分组成,若提高其活性成分的生物利用度,必须将其有效成分释放出来,使其能够更容易被吸收。基于黑木耳的细胞壁结构,采用酶法或者生物发酵法对其进行生物降解,降低多糖的分子量或切断多糖的侧链,是增加多糖应用价值的重要措施[12]。Tian等[13]发现发酵可以提高铁皮石斛多糖的平均分子质量,并在发酵过程中增加多糖中甘露糖的比例,促进其免疫刺激活性。Wan等[14]发现益生菌发酵结果使胡萝卜多糖的平均分子量降低,分子量分布范围变窄,并且提高了胡萝卜多糖对活性氧的清除能力,从而提高了其抗糖尿病效果。多糖的生物活性与其分子量有密切关系,将分子量大的多糖降解成为小分子多糖,对于提高多糖的生物活性具有重要的意义[15]。木耳多糖是聚合度较高的高分子碳水化合物,通过酶解转化为分子量较小的低聚糖,使更多的活性基团暴露,可能会使其拥有更好的生物活性。

    本研究基于黑木耳的结构特点,利用纤维素酶和果胶酶酶解黑木耳浆,在此基础上再进行发酵处理,优化发酵条件,使黑木耳多糖游离出来[16],分别以还原糖的生成量以及DPPH自由基清除率作为黑木耳多糖的降解程度及降解多糖的生物活性评价指标。通过酶解与发酵联合处理,使黑木耳产品更易被人体吸收利用,该研究对食用菌产品的转型升级和可持续发展具有重要意义。

    黑木耳 购买于哈尔滨市中央红超市;纤维素酶、果胶酶 北京博奥拓达科技有限公司;植物乳杆菌CGMCC1.557、发酵乳杆菌CGMCC1.1880 购于中国普通微生物菌种保藏中心,并于本实验室保藏;其他试剂均为国产分析纯。

    DZKW-D-2型恒温水浴锅 天津天泰仪器有限公司;MLS-1781L型高压蒸汽灭菌器 日本松下健康医疗器械;DNP-9082型恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;A560型双光束紫外可见分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司;JM-F65型胶体磨 上海台驰轻工装备有限公司;PHS-3C型pH计 上海雷磁实验设备有限公司;VersaMAX酶标仪 美谷MD公司。

    酶解液:将黑木耳用40 ℃自来水泡发2 h,清洗,用胶体磨制浆后,加入不同质量的水,获得不同料液比的黑木耳浆;再按照一定浓度和比例加入果胶酶、纤维素酶或者两者复合,作为黑木耳待酶解液。

    发酵液:将黑木耳酶解液灭酶,冷却到室温,按照一定条件接种植物乳杆菌和发酵乳杆菌进行发酵,获得黑木耳待发酵液。

    黑木耳按照1.2.1酶解液条件处理,以还原糖含量作为指标,考察料液比(1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL)、单一酶(纤维素酶或果胶酶)添加量(w/w)(0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%、3.6%、4.0%)、纤维素酶与果胶酶添加比例(4:1、3:2、1:1、2:3、1:4 w/w)、总加酶量(w/w)(2.8%、3.2%、3.6%和4.0%)、酶解时间(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)对黑木耳酶解条件的影响。固定考察因素料液比1:60、酶解时间4 h,酶解温度40 ℃,单一酶/总加酶量3.2%,纤维素酶与果胶酶比例为3:2,酶解pH5.0。

    在单因素实验的基础上选取对还原糖含量影响较大的加酶量、酶解温度和酶解时间3个因素进行正交试验。每个因素设置三个水平,每个水平设置三个平行样。选用正交试验L9(34)设计正交试验见表1,确定最佳酶解条件组合。

    表  1  黑木耳浆酶解条件正交因素水平表
    Table  1.  Orthogonal factor level table of enzymatic hydrolysis conditions of Auricularia auricula pulp
    水平酶解温度(℃)加酶量(%)酶解时间(h)
    ABC
    1453.23.5
    2503.64.0
    3554.04.5
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    黑木耳发酵液按照1.2.1制备,利用植物乳杆菌和发酵乳杆菌进行发酵实验,以DPPH自由基清除率为指标,分别考察发酵时间(0、2、4、6、8、10、12 h)、发酵温度(27、32、37、42、47 ℃)、菌种比例(L.plantarum: L.fermentum)(1:2、1:3、1:1、2:1,3:1)和接种量(v/v)(2%、3%、4%、5%、6%)对黑木耳发酵条件的影响,固定因素水平为发酵时间7 h,发酵温度37 ℃,菌种比例1:1,接种量3%,其中植物乳杆菌菌液浓度为8.83 log CFU mL−1,发酵乳杆菌菌液浓度为8.13 log CFU mL−1

    在单因素实验结果的基础上,以DPPH自由基清除率为评价指标,选取发酵时间、发酵温度、接种量三个因素,进行三因素三水平的响应面优化试验。响应面试验设计因素与水平见表2,确定最佳发酵条件组合。

    表  2  响应面试验因素与水平表
    Table  2.  Factors and levels table of response surface test
    水平发酵时间
    (h)
    发酵温度
    (℃)
    接种量
    (%)
    ABC
    −17322
    08373
    19424
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    样品果胶酶活力的测定方法参考黄丹梅[17]的方法略有改动。吸取1.8 mL 1%(10 g/L)的果胶底物溶液(用0.05 mol/L pH为5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制)于具塞比色管中,加入0.2 mL稀释粗酶液50 ℃水浴30 min后取出,加入3 mL DNS试剂沸水浴10 min,冷却、定容至25 mL;以煮沸灭活的稀酶液作为空白对照,于540 nm处测OD值。以半乳糖醛酸溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,得标准方程为y=0.4132x−0.0179(R2=0.9972)。果胶酶活力的定义:在反应条件50 ℃、pH5.0时,含有1 mg酶的酶液每分钟水解果胶底物生成1 μmol半乳糖醛酸的能力定义为1个酶活力单位(U)。

    纤维素酶酶活的测定参考GB/T 23881-2009饲用纤维素酶活性的测定-滤纸法。

    还原糖含量测定参考皮双双等[18]方法略有改动,测定方法如下:精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,分别置于25 mL容量瓶中,补水至2.5 mL,加入DNS试剂2.5 mL,混合均匀后,沸水浴加热5 min,迅速流水冷却,定容至25 mL,在540 nm波长下测定吸光度值。空白调零,以葡萄糖含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得标准方程为:y=0.1705x+0.0256(R2=0.9955)。

    配制一定浓度木耳酶解液溶液,按上述方法测定其还原糖含量,还原糖含量计算公式如下:

    (mg/mL)=mv×n

    式中m为根据回归方程得到的葡萄糖质量(mg);v为加入样品体积(mL);n为稀释倍数。

    DPPH自由基清除率的测定过程如下:参考Wu等[19]的方法并改进,用无水乙醇配置0.02 mmol/L DPPH反应溶液。准备洁净的96孔板,按表3添加各试剂。

    表  3  DPPH自由基清除活性测定各试剂添加量
    Table  3.  DPPH free radical scavenging activity determination of addition amount of each reagent
    样品(μL)DPPH(μL)无水乙醇(μL)蒸馏水(μL)
    样品组(A2100100
    对照组(A0100100
    空白组(A1100100
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    按上表添加试剂后,混匀,室温避光反应30 min,在517 nm处用酶标仪测定吸光值。DPPH自由基清除率计算见下式:

    DPPH(%)=(1A2A0A1)×100

    式中:A0-蒸馏水与无水乙醇混匀的OD值;A1-蒸馏水代替样品的OD值;A2-样品与DPPH反应液混匀的OD值。其中样品包括木耳浆、木耳酶解最优条件下的样品和不同处理的发酵液样品。

    所有实验进行3次重复,单因素实验结果采用ANOVA进行统计分析,并利用Origin 9.0软件绘图,结果均以平均值±标准差表示;响应面试验数据使用Design Expert 8.0.6.1软件进行设计分析并作图。

    本实验测得的市售果胶酶酶活为(216.84±8.01) U/mg,纤维素酶酶活为(322.31±11.22) U/mg,利用这两种酶进行后续实验研究。如图1所示,在无酶条件时,还原糖含量较低,且不同料液比间无明显差异,添加果胶酶和纤维素酶后,还原糖含量明显增加,其中果胶酶作用时还原糖含量明显高于纤维素酶作用,在料液比1:60时,加入果胶酶,木耳液还原糖含量为5.85 mg/mL,添加纤维素酶时,还原糖含量为4.26 mg/mL,均高于其他料液比还原糖含量,料液比过高会稀释底物和酶的浓度,因此随着料液比的提高,还原糖含量逐渐下降[20],故确定料液比为1:60。

    图  1  料液比对黑木耳浆还原糖含量的影响
    Figure  1.  Effect of material-liquid ratio on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    选用果胶酶和纤维素酶对黑木耳浆进行酶解,以还原糖含量为评价指标,评价两种酶的酶解效果。由图2可见,两种酶对酶解体系中还原糖含量增长速率的影响不同,当加酶量小于1.6%时,随着酶量的增加,纤维素酶反应体系中还原糖增长速率高于果胶酶酶解体系。骆嘉原等[21]的研究显示,纤维素酶可显著提高木耳多糖的得率,其次是果胶酶,这与本研究结果相似。但是,随着加酶量的继续增加,果胶酶酶解速率大于纤维素酶。在果胶酶添加量从2.8%~3.2%时,还原糖的增加量出现一个拐点,而纤维素酶的添加量达到2.8%以后,酶解液中还原糖的还原糖含量增加不明显;当加酶量约为3.6%时,两种单一酶酶解液中还原糖含量达到峰值,分别为5.85 mg/mL和3.51 mg/mL,当加酶量大于3.6%,还原糖含量略下降,这与Wu等[1]的研究结果相似,说明当酶的添加量达到一定值时,可与酶接触的底物已经被完全水解,再继续加大酶的添加量,也不会增加相应的还原糖含量。因此选择加酶量2.8%、3.2%、3.6%、4.0%(w/w)进行后续研究,在此基础上进行了双酶复合实验。

    图  2  单一酶添加量对黑木耳浆还原糖含量的影响
    Figure  2.  Effect of single enzyme on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图3为果胶酶与纤维素酶总添加量以及在每一添加量下二者的不同添加比例对还原糖含量的影响。当两种酶的添加比例为2:3,总加酶量为3.6%时,此时还原糖含量为7.23 mg/mL,高于其他添加比例,这一结果表明,当两种酶同时作用于木耳细胞壁时,纤维素酶破坏细胞壁的结构,促进了果胶酶与中胶层的果胶质接触,从而发挥更好的酶解效果。 当果胶酶:纤维素酶(w/w)为2:3(总加酶量3.6%)组合作用条件下,双酶复合物能显著提高水解液的还原糖含量。因此,果胶酶:纤维素酶=2:3双酶的组合可以提高后续发酵的初始底物浓度。

    图  3  果胶酶与纤维素酶添加比例(w/w)对黑木耳浆还原糖含量的影响
    Figure  3.  Effect of the ratio of pectinase and cellulase (w/w) on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图4可知,在3~4 h内,还原糖增长速率最快,酶解时间与还原糖含量呈正相关,随后有下降趋势。当发酵4 h以后,还原糖含量出现下降随后平稳,原因可能是随着时间延长,底物浓度不断降低以及部分酶失活,还有产物反馈抑制效应增加,酶促反应速率下降,从而降低了还原糖含量[22]。这一结果表明底物已经被酶充分水解[23]。因此反应体系最佳酶解时间范围为3.5、4、4.5 h区间范围内。

    图  4  酶解时间对黑木耳浆还原糖含量的影响
    Figure  4.  Effect of enzymatic hydrolysis time on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    纤维素酶最适作用温度范围为40~60 ℃,果胶酶最适温度为50 ℃。因此,本实验在40~60 ℃之间研究了果胶酶:纤维素酶添加质量比(w/w)为2:3,总加酶量3.6%时的还原糖生成量的动态变化(见图5)。在40~50 ℃范围内,还原糖生成量随着酶解温度的升高而增加。再继续升高温度,酶解体系中还原糖的生成量反而下降。这可能是因为随着温度的升高,黑木耳多糖分子与纤维素酶分子的运动速度开始增大,互相之间的接触机会也增大,因此黑木耳还原糖含量增加,且在50 ℃以下时,温度的升高时果胶酶的活性逐渐提高,使双酶联合作用后还原糖含量在50 ℃达到最大值。当温度高于50 ℃时,纤维素酶和果胶酶由于温度过高导致次自身次级键不稳定而发生断裂,使其空间结构发生破坏,最终使酶活性减弱,甚至丧失活性,还原糖生成速率也随之降低[4,24]。因此,选择酶解温度区间45、50、55 ℃进行后续研究。

    图  5  酶解温度对黑木耳浆还原糖含量的影响
    Figure  5.  Effect of enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    由于果胶酶的最适pH为3.5,纤维素酶的最适pH为5.5,故选择酶解的pH范围为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0,酶解4 h。由图6可知,在pH3.0和pH6.0之间,随着酶解pH的增高,还原糖含量缓慢增长,在pH5.5时还原糖含量最高,可能是由于溶液的pH可以通过改变酶活性中心必需基团的解离以及底物和辅酶的解离来影响酶的活性和结构,从而影响酶分子与底物的结合,最终影响催化作用[1],因此选择黑木耳浆酶解pH5.5进行后续实验。

    图  6  酶解pH对黑木耳浆还原糖含量的影响
    Figure  6.  Effect of enzymatic hydrolysis pH on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    根据单因素实验结果,选取对酶解条件有主要影响的3个因素,按照3因素3水平进行正交试验,按照L9(34)正交试验设计,正交试验结果与分析见表4,加酶量对还原糖含量的影响最大,其次是酶解时间,最小的是酶解温度。由此可见,在复合酶水解木耳液时,在实验给定的温度范围内,复合酶的用量起到了主导作用,这一结果显示,利用不同的酶破坏木耳细胞壁结构,是促进木耳多糖水解释放的关键因素。故综合考虑对还原糖含量影响的极差分析结果,可得出最佳酶解条件为A2B1C1,在此条件下进行了三次重复验证实验。经验证采用此方案,黑木耳酶解液中还原糖含量平均值为(6.94±0.24)mg/mL,因此黑木耳酶解的的最佳工艺为酶用量(w/w)3.2%,酶解时间3.5 h,酶解温度50 ℃,酶解pH为5.5。

    表  4  黑木耳浆酶解正交试验结果
    Table  4.  Orthogonal test results of the enzymatic hydrolysis of Auricularia auricula pulp
    试验号酶解温度加酶量酶解时间还原糖含量(mg/mL)
    ABC
    11116.96±0.22
    21225.92±0.08
    31336.71±0.23
    42127.04±0.30
    52236.72±0.21
    62316.71±0.12
    73136.92±0.15
    83216.86±0.06
    93326.63±0.14
    k16.536.976.84
    k26.836.506.53
    k36.806.686.78
    R0.300.470.31
    主次顺序B>C>A
    优水平A2B1C1
    优组合A2B1C1
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    黑木耳浆在发酵初期,DPPH自由基清除率随着发酵时间延长而逐渐增长,在8 h时,DPPH自由基清除率为91.81%,达到最高,随后逐渐下降(图7)。微生物在发酵初期不断分解蛋白质,以及胞外多糖等物质,导致氨基酸、多糖等活性物质含量增加,随着发酵时间延长,发酵液内营养物质逐渐消耗殆尽,菌株个体间竞争加剧,活菌数减少,导致分解蛋白质的能力降低、反应速度和产物积累速度逐渐减缓,以及木耳发酵液中多糖等物质被消耗,导致抗氧化性降低[25-26]。因此,本实验选择发酵8 h的木耳液进行后续研究。

    图  7  发酵时间对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  7.  Effect of fermentation time on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图8可知,DPPH自由基清除率随着温度升高先增加后降低,在37 ℃ DPPH自由基清除率达到83.49%±5.37%,可能是由于随着温度逐渐增加,达到了混合菌发酵的最适温度,发酵温度会影响微生物的生长代谢,进而影响发酵液中抗氧化物质含量和活性[27]。因此选择37 ℃进行后实验。

    图  8  发酵温度对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  8.  Effect of fermentation temperature on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图9可知,当植物乳杆菌与发酵乳杆菌的菌种比例为1:1时,发酵后木耳液的DPPH自由基清除率达到最佳。当达到一定比例时,互作关系达到最强,使生成抗氧化物质丰富,使抗氧化效果达到最佳。因此,选择植物乳杆菌与发酵乳杆菌的菌种比例为1:1进行后续实验。

    图  9  菌种比例对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  9.  Effect of strain ratio on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图10所示,在2%~6%接种量范围内,DPPH自由基清除率随接菌量的增加呈先升高下降趋势,接菌量为3%时,DPPH自由基清除率达到峰值,为87.44%±7.22%,随着接菌量的逐渐增加,培养基中的营养物质被充分利用,生成胞外多糖等营养物质,发酵液抗氧化性增加,随着接菌量的进一步增加,菌体浓度过大,无法与底物有效结合,培养基中营养物质消耗较快,营养物质不足,乳酸菌提前进入衰亡期,菌体自溶,抗氧化性下降[28]。根据实验过程和结果,选择2%、3%和4%的接菌量进行随后研究。

    图  10  接菌量对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响
    Figure  10.  Effect of inoculation amount on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    在单因素实验的基础上,选用发酵时间(A)、发酵温度(B)、接菌量(C)进行3因素3水平响应面试验,响应面设计及结果如表5所示。

    表  5  黑木耳发酵响应面结果
    Table  5.  Response surface results of the fermentation of Auricularia auricula
    序号A:时间B:温度C:接菌量DPPH自由基清除率(%)
    100085.01
    21−1079.22
    300088.12
    410−170.72
    501−179.74
    6−10173.09
    701178.41
    810178.78
    911080.58
    1000086.27
    110−1−171.45
    12−10−166.91
    130−1184.33
    1400087.2
    15−1−1067.41
    16−11074.44
    1700088.29
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    通过Design-Expert-V8.0.6.1软件进行响应面分析,得到回归拟合方程Y(%)=86.98+3.43A+1.35B+3.22C−1.42AB+0.47AC−3.55BC−8.84A2−2.73B2−5.77C2

    通过对此回归方程进行方差分析,由表6可知,二次回归模型的F值为28.42,P值为0.0001,证明所得模型极显著。而失拟项中P=0.192>0.05,说明失拟项差异不显著,说明此方程对实验拟合度较好,可以充分反应该实验实际情况。实验模型的决定系数R2=0.99,实验模型的校正系数R2Adj=0.96。综上所述:该实验结果可靠,证明利用此响应面模型确定发酵木耳液对于DPPH自由基清除能力的优化条件具有可行性。通过此模型还发现各影响因素对DPPH的影响顺序为A>C>B,所以对木耳发酵条件影响最大的是时间、其次是接菌量和温度。

    表  6  木耳发酵的响应面回归方程方差分析
    Table  6.  Analysis of variance of response surface regression equation of the fermentation of Auricularia auricula
    方差来源平方和自由度均方FP
    模型797.02988.5628.420.0001**
    A-时间94.19194.1930.230.0009**
    B-温度1.45E+0111.45E+014.65E+000.0681
    C-接菌量83.14183.1426.690.0013**
    AB8.0418.042.580.1523
    AC0.8810.880.280.6108
    BC50.48150.4816.200.0050**
    A2328.771328.77105.53<0.0001**
    B231.36131.3610.060.0157*
    C2140.011140.0144.940.0003**
    残差21.8173.12
    失拟项14.3634.792.570.1920
    误差项7.4541.86
    总和818.8316
    注:*表示影响显著(P<0.05);**表示影响极显著(P<0.01)。
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    利用响应面软件Design-Expert-V8.0.6.1处理,得到发酵时间、发酵温度、接菌量交互作用的响应面和等高线图(图11)。发酵温度和接种量交互作用对黑木耳发酵DPPH自由基清除率影响显著,发酵时间和接种量、发酵时间和发酵温度对黑木耳发酵DPPH自由基清除率影响不显著。图11a、b发酵时间和接种量影响呈现先升高后降低的变化趋势,但等高线排列疏松,椭圆曲率较小,说明发酵时间和接种量之间有交互作用,但是并不显著。图11c、d发酵时间和发酵温度影响呈现先升高后降低的变化趋势,等高线坡度较陡峭,说明发酵时间和接种量之间有一定的交互作用,但是并不显著。

    图  11  发酵时间和接菌量(a,b)、发酵时间和发酵温度(c,d)、接菌量和发酵温度(e,f)交互作用的响应面和等高线图
    Figure  11.  Response surface and the interaction contour line plot of between fermentation time and inoculation amount (a, b), fermentation time and fermentation temperature (c, d), inoculation amount and fermentation temperature (e, f)

    根据得到的响应面模型确定木耳发酵的最佳工艺为:发酵时间8.20 h,接菌量3.29%,温度37.04 ℃,此条件下DPPH自由基的清除率为92.01%±4.17%。基于对于实验操作的可行性确定最佳木耳发酵最佳条件为发酵时间8 h,接菌量3%,温度37 ℃。多糖的抗氧化性能常常被用作体外功能评价的指标[29]。本研究通过三次重复性实验测定DPPH自由基的清除能力达到92.46%±3.22%,与预测值相似,证明响应面模型对优化木耳发酵后对DPPH自由基清除能力的制备条件具有可行性。

    本实验通过优化酶法水解工艺,最终确定了复合酶解条件的最佳组合:最终得到果胶酶与纤维素酶总加酶量3.2%(w/w按木耳浆液质量计),果胶酶与纤维素酶质量比为2:3,温度50 ℃,pH5.5,酶解时间3.5 h,酶解效果最佳,此时还原糖含量达到(6.94±0.24)mg/mL。黑木耳发酵的最佳条件为:植物乳杆菌与发酵乳杆菌添加比例为1:1,发酵温度37 ℃,接菌量3%,发酵时间8 h,在此条件下木耳发酵液的DPPH自由基清除率为92.46%±3.22%,远远高于木耳酶解液的DPPH自由基清除率(64.49%±5.62%)和木耳液的DPPH自由基清除率(59.42%±5.04%),由此可见,经过酶解和发酵可以使木耳中活性成分得到释放,使抗氧化性增强。

  • 图  1   料液比对黑木耳浆还原糖含量的影响

    Figure  1.   Effect of material-liquid ratio on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图  2   单一酶添加量对黑木耳浆还原糖含量的影响

    Figure  2.   Effect of single enzyme on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图  3   果胶酶与纤维素酶添加比例(w/w)对黑木耳浆还原糖含量的影响

    Figure  3.   Effect of the ratio of pectinase and cellulase (w/w) on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图  4   酶解时间对黑木耳浆还原糖含量的影响

    Figure  4.   Effect of enzymatic hydrolysis time on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图  5   酶解温度对黑木耳浆还原糖含量的影响

    Figure  5.   Effect of enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图  6   酶解pH对黑木耳浆还原糖含量的影响

    Figure  6.   Effect of enzymatic hydrolysis pH on reducing sugar content of Auricularia auricula pulp

    图  7   发酵时间对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  7.   Effect of fermentation time on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图  8   发酵温度对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  8.   Effect of fermentation temperature on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图  9   菌种比例对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  9.   Effect of strain ratio on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图  10   接菌量对黑木耳浆DPPH自由基清除能力的影响

    Figure  10.   Effect of inoculation amount on the DPPH scavenge capacity of Auricularia auricula pulp

    图  11   发酵时间和接菌量(a,b)、发酵时间和发酵温度(c,d)、接菌量和发酵温度(e,f)交互作用的响应面和等高线图

    Figure  11.   Response surface and the interaction contour line plot of between fermentation time and inoculation amount (a, b), fermentation time and fermentation temperature (c, d), inoculation amount and fermentation temperature (e, f)

    表  1   黑木耳浆酶解条件正交因素水平表

    Table  1   Orthogonal factor level table of enzymatic hydrolysis conditions of Auricularia auricula pulp

    水平酶解温度(℃)加酶量(%)酶解时间(h)
    ABC
    1453.23.5
    2503.64.0
    3554.04.5
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    表  2   响应面试验因素与水平表

    Table  2   Factors and levels table of response surface test

    水平发酵时间
    (h)
    发酵温度
    (℃)
    接种量
    (%)
    ABC
    −17322
    08373
    19424
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    表  3   DPPH自由基清除活性测定各试剂添加量

    Table  3   DPPH free radical scavenging activity determination of addition amount of each reagent

    样品(μL)DPPH(μL)无水乙醇(μL)蒸馏水(μL)
    样品组(A2100100
    对照组(A0100100
    空白组(A1100100
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    表  4   黑木耳浆酶解正交试验结果

    Table  4   Orthogonal test results of the enzymatic hydrolysis of Auricularia auricula pulp

    试验号酶解温度加酶量酶解时间还原糖含量(mg/mL)
    ABC
    11116.96±0.22
    21225.92±0.08
    31336.71±0.23
    42127.04±0.30
    52236.72±0.21
    62316.71±0.12
    73136.92±0.15
    83216.86±0.06
    93326.63±0.14
    k16.536.976.84
    k26.836.506.53
    k36.806.686.78
    R0.300.470.31
    主次顺序B>C>A
    优水平A2B1C1
    优组合A2B1C1
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    表  5   黑木耳发酵响应面结果

    Table  5   Response surface results of the fermentation of Auricularia auricula

    序号A:时间B:温度C:接菌量DPPH自由基清除率(%)
    100085.01
    21−1079.22
    300088.12
    410−170.72
    501−179.74
    6−10173.09
    701178.41
    810178.78
    911080.58
    1000086.27
    110−1−171.45
    12−10−166.91
    130−1184.33
    1400087.2
    15−1−1067.41
    16−11074.44
    1700088.29
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    表  6   木耳发酵的响应面回归方程方差分析

    Table  6   Analysis of variance of response surface regression equation of the fermentation of Auricularia auricula

    方差来源平方和自由度均方FP
    模型797.02988.5628.420.0001**
    A-时间94.19194.1930.230.0009**
    B-温度1.45E+0111.45E+014.65E+000.0681
    C-接菌量83.14183.1426.690.0013**
    AB8.0418.042.580.1523
    AC0.8810.880.280.6108
    BC50.48150.4816.200.0050**
    A2328.771328.77105.53<0.0001**
    B231.36131.3610.060.0157*
    C2140.011140.0144.940.0003**
    残差21.8173.12
    失拟项14.3634.792.570.1920
    误差项7.4541.86
    总和818.8316
    注:*表示影响显著(P<0.05);**表示影响极显著(P<0.01)。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-07-18
  • 网络出版日期:  2022-02-10
  • 刊出日期:  2022-03-31

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