Correlation between Antioxidant Activity and Structure and Amino Acid Composition of Protease Hydrolysates from Mung Bean
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摘要: 本试验以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶四种不同来源的蛋白酶酶解绿豆蛋白，测定酶解物的抗氧化能力，结合傅里叶红外光谱技术（FTIR）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、圆二色谱（CD）以及氨基酸分析仪，分析酶解物的氨基酸组成以及抗氧化活性与结构变化的相关性。结果表明，绿豆蛋白4 h中性蛋白酶酶解物抗氧化能力最强，其DPPH自由基清除率、羟自由基清除率分别达到71.03%、51.94%，TBARS值达到0.4045 mg/L，Fe2+螯合率达到52.31%；结合SDS-PAGE、FTIR、CD等分析得出：绿豆蛋白酶解物的抗氧化能力与其分子量大小、二级结构构象及氨基酸组成变化紧密相关，与绿豆蛋白相比，绿豆蛋白酶解物的α-螺旋结构含量增加了4.12%、β-折叠结构含量降低了19.99%，而抗氧化活性与其α-螺旋含量的增加、β-折叠含量的降低密切相关；影响抗氧化活性的疏水氨基酸增加了0.208 g/100 g，芳香氨基酸增加了0.207 g/100 g，分子量低于10 kDa的小分子量酶解物具有更好的抗氧化性。综合以上研究结果证实绿豆蛋白酶解物活性与其α-螺旋、β-折叠的相关性较大。Abstract: In this experiment, mung bean protein was enzymolyzed by alkaline protease, neutral protease, pepsin and trypsin, and the antioxidant capacity of the enzymolysis product was determined. The correlation between the enzymolysis product and the structural changes was investigated by combining Fourier transform infrared spectroscopy, SDS-PAGE, circular dichromatography and amino acid analyzer, amino acid composition of the hydrolysates and the correlation between antioxidant activity and structure change were analyzed. The results showed that the 4 h neutral protease hydrolysates of mung bean protein had the strongest antioxidant capacity, with DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl free radical scavenging rate reaching 71.03% and 51.94%, TBARS value reaching 0.4045 mg/L and Fe2+ chelating rate reaching 52.31%. Combined with SDS-PAGE, FTIR and CD, it could be concluded that: The antioxidant capacity of mung bean protease hydrolysates was closely related to its molecular weight, secondary structure conformation and amino acid composition. Compared with mung bean protein, the α-helix structure content of mung bean protease hydrolysates increased by 4.12% and the β-fold structure content decreased by 19.99%. The antioxidant activity was closely related to the increase of α-helix content and the decrease of β-folding content. The hydrophobic amino acids and aromatic amino acids that affected antioxidant activity increased by 0.208 g/100 g and 0.207 g/100 g, respectively. The hydrophobic hydrolysates with lower molecular weight less than 10 kDa had better antioxidant activity. Based on the above results, it was confirmed that the activity of mung bean protease hydrolysate had high relation with α-spiral and β-fold.
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绿豆（Vigna radiata （L.） Wilczek）为豆科豇豆属，是我国主要的食用豆类作物，素有“食中佳品，济世长谷”之称。绿豆富含蛋白质、淀粉、酚类物质以及人体所需的各种氨基酸[1]，具有清热解毒、抗炎消肿、消暑利尿、保肝明目等功效[2]。绿豆蛋白氨基酸种类丰富，必需氨基酸比例高于WHO/FAO推荐值，尤其是赖氨酸的相对含量高达7.7%，接近鸡蛋中的含量[3-4]。现有的研究发现绿豆蛋白及其酶解物具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血压血脂等生理功效[5]。
目前我国绿豆的加工多数集中于制取淀粉，而绿豆蛋白粉作为其加工副产物常被当做动物饲料或直接废弃，浪费了宝贵的蛋白资源。生物酶法是高效解决和利用蛋白质资源的主要途径之一，大量研究已证实食源性蛋白酶解物具有较强的抗氧化能力，而且发现其活性与其二级结构（α-螺旋、β-折叠）、分子量大小和氨基酸组成有关[6-7]。结构决定活性，而关于绿豆蛋白酶解物功效与其结构变化的相关性研究主要集中在分子量上，信息还很有限，因此，有必要对绿豆蛋白酶解物的构效关系进行深入研究。
不同蛋白酶的作用位点不同，同一蛋白酶的作用时间不同，均是影响酶解物抗氧化活性的重要原因[8]，因此，本文以绿豆蛋白为原料，分别采用动物源、植物源和微生物源蛋白酶对绿豆蛋白进行酶解，分别测定酶解物的抗氧化能力以及结构变化，以期明确不同蛋白酶对绿豆蛋白酶解物构效关系的影响，为下一步绿豆肽在机体中的生物利用度研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
绿豆蛋白粉（蛋白质量分数80%） 山西明绿豆，山东六六顺食品有限公司；碱性蛋白酶（2.4 AU/g） 丹麦诺维信公司；中性蛋白酶（10万 U/g）、胃蛋白酶（110万 U/g）、胰蛋白酶（100万 U/g） 上海浩洋生物有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric Acid Reactive Substance，TBARS）、L-组氨酸、大豆卵磷脂（20%）、抗坏血酸钠、硫代硫酸钠（五水） 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；菲洛嗪（Ferrozine） 分析纯，美国Sigma公司；邻二氮菲 分析纯，上海源叶生物科技有限公司；三氯乙酸（TCA）、硫酸亚铁（FeSO4）、氯化亚铁（FeCl2）、氯化铁（FeCl3）、三氯甲烷（CHCl3）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、硫酸（H2SO4）等 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。
FB124电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；S-2600CRT紫外分光光度计、PHS-25数显pH计、RW-120高速搅拌器 上海精密科学仪器有限公司；FD-1A-50冻干机 杭州川一实验仪器有限公司；SY-601恒温水浴锅 天津市欧诺仪器仪表有限公司；164-5050电泳仪 美国Bio-Rad公司；Spectrum Two傅里叶红外变换光谱分析仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 美国PE公司；LA8080氨基酸分析仪 日本日立公司。
1.2 实验方法
1.2.1 绿豆蛋白酶解物的制备
1.2.1.1 绿豆蛋白不同蛋白酶酶解产物的制备
将绿豆蛋白粉（蛋白质质量分数80%）配制成7%的溶液，预热至不同蛋白酶的适宜温度（碱性蛋白酶55 ℃、中性蛋白酶50 ℃、胃蛋白酶37 ℃、胰蛋白酶37 ℃），用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液调pH至不同蛋白酶的最适pH（碱性蛋白酶pH8.0、中性蛋白酶pH6.5、胃蛋白酶pH2.0、胰蛋白酶pH9.0），按照蛋白质量加入2%的蛋白酶后水浴搅拌，水浴过程采用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液保持pH恒定。水解120 min后，调pH7.0，迅速升温至95 ℃，保持10 min灭酶，制备得到的样品采用FD-1A-50冻干机进行冷冻干燥，备用。
1.2.1.2 绿豆蛋白不同酶解时间酶解物的制备
将1.2.1.1中筛选得到抗氧化活性最佳的酶解物用酶作为优选酶，分别以此酶对绿豆蛋白进行酶解，酶解时间分别为1、2、3、4、5 h，得到不同酶解时间的绿豆蛋白酶解物。
1.2.2 绿豆蛋白酶解物抗氧化活性的测定
1.2.2.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考佟晓红等[9]的研究方法。准确称取2.5 mg的DPPH于100 mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度。取上述DPPH溶液4 mL于试管中，加入1 mL 10 mg/mL的酶解物-乙醇溶液，避光静置30 min，于517 nm处测定吸光值，记As，对照组加入1 mL无水乙醇代替样品，记A0。由式（1）计算不同处理组的DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率(%)=(1−AsA0)×100 (1) 1.2.2.2 羟自由基清除能力的测定
参考AVELLAR等[10]的方法。取配制好的0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1 mL置于试管中，依次加入PBS 2 mL和酶解物-水溶液1 mL（10 mg/mL），旋涡振荡器混合均匀后加入0.75 mmol/L FeSO4 1 mL，混匀，加1 mL体积分数0.12% H2O2，37 ℃水浴1 h，于536 nm处测吸光值，记As。用1 mL蒸馏水代替样品，记Ap。用1 mL蒸馏水代替样品，1 mL蒸馏水代替H2O2，记AB。由式（2）计算羟自由基清除率。
羟自由基清除率(%)=AS−APAB−AP×100 (2) 1.2.2.3 Fe2+螯合能力的测定
参考XIE等[11]的方法并稍作修改。取1 mL离心后的酶解物-水溶液（10 mg/mL）于试管中，再加入2 mL 2×10−3 mmol/L FeCl2和2 mL 0.5 mmol/L菲洛嗪溶液，混合均匀，室温下静置10 min，于562 nm处测定溶液吸光值As，1 mL蒸馏水代替样品吸光值记为A0。
Fe2+螯合能力(%)=(1−AsA0)×100 (3) 1.2.2.4 还原能力的测定
参考张江涛[12]的方法对绿豆蛋白酶解物的还原能力进行测定。取2.5 mL酶解物-水溶液（10 mg/mL），加入2.5 mL PBS（pH6.6），2.5 mL 1% K3FeSN6，充分混匀后50 ℃水浴20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 10% TCA，0.5 mL 0.1% FeCl3，静置10 min后于700 nm测定吸光值，以吸光值表示还原能力。
1.2.3 TBARS的测定
参考VHANGANI等[13]的方法并稍微修改。配制pH6.8的组氨酸-KCl溶液，加入适量大豆卵磷脂，4 ℃下超声溶解。取5 mL卵磷脂溶液，加入1 mL酶解物-水溶液（10 mg/mL），0.1 mL 50 mmol/L FeCl3，0.1 mL 10 mmol/L抗坏血酸钠，37 ℃水浴1 h，引发脂质氧化。取上述混合液0.5 mL，加入1.5 mL TBARS，8.5 mL三氯乙酸-盐酸（TCA-HCl）混匀，沸水浴30 min，冷却，加入等体积的CHCl3，3000 r/min离心10 min，于532 nm测定吸光值。
TBARS(mg/L)=A532V×9.48 (4) 式中，V为样品体积，mL；9.48为常数。
1.2.4 绿豆蛋白酶解物结构表征
1.2.4.1 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）
参考LIN等[14]的试验方法并稍作修改。采用0.1 mol/L NaOH溶液配制7 mg/mL酶解物溶液，与上样缓冲液4:1混合，沸水浴10 min。上样量15 μL，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度15%（不同时间的中性酶酶解物分离胶浓度16%）。样品在浓缩胶阶段采用60 V电压，分离胶阶段调整至80 V，直至条带到达分离胶底部停止电泳。浸泡在染色液中染色2 h，随后脱色液脱色。
1.2.4.2 FTIR分析
采用郭莲东等[15]的方法测定。取冻干后酶解物样品粉末与溴化钾1:100混合研磨压片，采用傅里叶红外光谱仪测定其谱图，测定条件：吸收光谱为1600~1700 cm−1，波数度为0.01 cm−1，分辨率为2 cm−1扫描128次。
1.2.4.3 CD光谱的测定
参考ZHENG等[16]的方法并稍作修改，将酶解物冻干粉末配制成0.2 mg/mL的水溶液，在185~265 nm范围内扫描，并绘制圆二光谱（circular dichroism，CD）图。
1.2.5 绿豆蛋白酶解物氨基酸组成的测定
准确称取20 mg酶解物冻干粉末于水解管中，加入12 mL 6 mol/L的HCl溶液，加入3~4滴苯酚后冷冻5 min，抽真空后冲入氮气，110 ℃恒温干燥箱内22 h，取出冷却，水解液定容至50 mL，过滤后取2 mL滤液于40~50 ℃真空干燥，残留物经0.02 mol/L HCl溶解，过滤后经氨基酸分析仪分析测定。
1.3 数据处理
所有数据均采用Statistix 8（分析软件，St Paul, MN）进行分析。采用Sigma Plot 12.5作图。
2. 结果与分析
2.1 绿豆蛋白酶解物的抗氧化活性
图1表示绿豆蛋白不同酶酶解物的抗氧化活性。由图可知，绿豆蛋白不同酶解物的抗氧化活性不同，四种酶解物相比，中性蛋白酶酶解物的抗氧化能力最强（P<0.05），其DPPH自由基和羟自由基清除率分别达到71.03%和51.94%，Fe2+螯合能力达到52.31%，这是由于不同酶解物的作用位点不同，其释放的产物不同。谭梦[17]的研究也发现不同酶解物的活性不同，因为不同酶的作用位点不同；另外，中性蛋白酶主要水解羧基侧含酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）等芳香族氨基酸残基的肽键，这些氨基酸的含量与抗氧化性呈正比[17]。绿豆蛋白酶解物与VC相比，具有更好的金属螯合能力（P<0.05），有研究证明，吲哚基、咪唑基和巯基等活性基团在与Fe2+螯合方面中起着重要作用，中性蛋白酶酶解物中拥有组氨酸（His）、蛋氨酸（Met）等含有吲哚基、咪唑基等活性基团的氨基酸[18]，因而具有更好的Fe2+螯合能力。基于以上结果，后续选取中性蛋白酶对绿豆蛋白进行处理。
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图 1 绿豆蛋白酶解物的抗氧化活性注：1.VC组；2.碱性蛋白酶酶解物；3.中性蛋白酶酶解物；4.胃蛋白酶酶解物；5.胰蛋白酶酶解物；6.绿豆蛋白；不同字母代表各组差异显著，P<0.05；图2同。Figure 1. Antioxidant activity of protease hydrolysates from mung bean图2是不同酶解时间对绿豆蛋白中性蛋白酶酶解物抗氧化活性的影响。由图2可知，随着酶解时间的延长，酶解物的活性整体呈增强趋势，在酶解4 h时抗氧化活性达到最高，DPPH自由基清除率、羟自由基清除率分别达到71.03%、51.94%，TBARS值达到0.4045 mg/L，Fe2+螯合率达到52.31%，还原能力吸光值达到0.1237。5 h酶解物的还原能力出现下降，这可能是由于水解时间过长，使具有抗氧化活性的肽段被过度降解，也可能是由于酶解过程中搅拌导致了肽段间发生缠绕，-NH2基团被掩盖[19]，引起水解物活性下降；TBARS反映了酶解物抑制丙二醛生成的能力，随着酶解时间的延长，绿豆蛋白释放的肽片段逐渐增多，包裹在卵磷脂的周围，阻断了油脂与氧气的接触，从而达到抑制氧化的效果，随着酶解时间的进一步延长，酶解物的片段又被降解为更小的片段，此时无法包裹住卵磷脂体系，导致抑制脂质氧化的能力减小[20]。综上，绿豆蛋白经中性蛋白酶酶解4 h得到的酶解物具有更好的抗氧化活性。
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图 2 绿豆蛋白中性蛋白酶酶解物的抗氧化活性Figure 2. Antioxidant activity of mung bean protein neutral protease hydrolysates2.2 绿豆蛋白酶解物的结构表征
2.2.1 SDS-PAGE
绿豆蛋白酶解物的亚基条带变化情况见图3。由图3A可知，绿豆蛋白四种蛋白酶酶解物的亚基条带均发生了不同程度的变化。绿豆蛋白有鲜明的5个亚基条带，其分子量分别为61.7、57.5、50.1、25.1、19.5 kDa，而不同蛋白酶酶解物的亚基条带均发生了不同程度的降解，其中碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解物分子量均小于10 kDa，胃蛋白酶酶解物在17 kDa以下亚基条带逐渐增多，胃蛋白酶酶解物在70~90 kDa之间出现了明显的条带，可能是因为在强酸性环境中发生了聚集现象[21]。结合抗氧化研究结果可以看出，随着绿豆蛋白的酶解，其抗氧化活性逐渐增强，分子量低于10 kDa以下的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解物具有较强的抗氧化能力。但同时也发现并不是绿豆蛋白的分子量越小其抗氧化能力就越强，在SDS-PAGE中，小于10 kDa的胰蛋白酶酶解物亚基条带较碱性蛋白酶酶解物的明显，碱性蛋白酶酶解物却具有较强的抗氧化能力，这可能是由于碱性蛋白酶能水解所有羧基侧具有芳香族或疏水性的氨基酸肽键[17]，因此，其抗氧化能力强。由此也可以得出，绿豆蛋白酶解物与分子量相关，但并不一定是越小越好。
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图 3 绿豆蛋白酶解物的SDS-PAGE图注：1.碱性蛋白酶酶解物；2.中性蛋白酶酶解物；3.胃蛋白酶酶解物；4.胰蛋白酶酶解物；5.绿豆蛋白；M：蛋白标品。Figure 3. SDS-PAGE of mung bean protein hydrolysate图3B是不同酶解时间的中性蛋白酶酶解物的亚基变化情况。由图可知，随着水解时间的延长，绿豆蛋白均发生了不同程度地降解，且大分子量的片段逐步被降解为小分子量基团。40、24 kDa分别是绿豆蛋白的11 S球蛋白大小亚基，两者通过二硫键链接，与8 S球蛋白亚基间结合紧密[22]，由图3B可知，24、16、10 kDa等亚基条带随着时间的延长逐渐变浅，5 h酶解物的24、16 kDa亚基条带显著变窄，这是由于热处理使蛋白结构遭到破坏，二硫键发生断裂，8 S、11 S球蛋白亚基分离被水解成小分子物质。10 kDa亚基条带显著变宽，且<10 kDa亚基条带显著增加。这说明，随着时间的延长，分子量逐渐降低，结合2.1中抗氧化活性分析可知，随着蛋白质酶解物分子量的降低，其功能活性呈现升高的趋势，但是水解时间过长，酶解物的功能活性反而下降，可能是因为具有抗氧化功能的肽序列进一步被降解而丧失功能活性[19]。
2.2.2 FTIR分析
图4是绿豆蛋白酶解物酰胺Ⅰ带（1700~1600 cm−1）红外图谱。由图可以看出，绿豆蛋白的FTIR在1650 cm−1处有一个小峰，这是蛋白质的一个特征峰[23]，主要由C=O的伸缩震动引起[6]。绿豆蛋白经四种蛋白酶酶解处理后，产物在1650 cm−1处的吸收峰发生红移，去卷积分析后得出不同酶解物的二级结构不同，其中，中性蛋白酶酶解物的β-折叠结构较其它结构的比例降低明显（见表1），α-螺旋结构增加，且抗氧化活性也最强，这说明中性蛋白酶酶解物具有较强的抗氧化活性与其β-折叠、α-螺旋结构有关。β-折叠含量的降低导致疏水相关位点暴露，提升抗氧化性[24]。绿豆蛋白酶解物的抗氧化能力与其二级结构被破坏显著相关。
表 1 绿豆蛋白及其酶解物酰胺Ⅰ带二级结构Table 1. Secondary structure of amide Ι band of mung bean protein and its hydrolysateα-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） 其他（%） 碱性蛋白酶酶解物 11.65 37.62 29.82 17.05 3.86 中性蛋白酶酶解物 12.37 31.38 45.54 8.77 1.94 胃蛋白酶酶解物 7.55 36.27 27.98 10.50 17.60 胰蛋白酶酶解物 7.61 36.67 27.99 10.59 17.14 绿豆蛋白 14.87 42.67 25.49 14.82 2.15 由图4B可以得出，4 h酶解物的1650 cm−1处峰发生了不同程度的变化，根据去卷积处理结果得出酶解4 h得到的酶解物β-折叠结构含量较其它处理时间最低，α-螺旋结构含量较其它处理组高（见表2），结合图2试验结果得出，此时抗氧化活性最强。5 h水解产物的α-螺旋的含量突然减少，转变成了无规则卷曲等二级结构，这是由于酶解时间过长，导致连接α-螺旋的氢键遭到破坏，无规则结构增多，发生了解螺旋现象[25]。由此可以得出酶解物的抗氧化活性与其二级结构有关。许晶等[26]的研究也发现酶解物的活性与其二级结构破坏有关，与未酶解蛋白相比，随着酶解时间的变化，α-螺旋、β-折叠等稳定结构逐步转变为β-转角和无规则卷曲，导致肽链中的活性位点暴露，进而提高了酶解物的抗氧化活性。
表 2 中性蛋白酶不同水解时间酰胺Ⅰ带二级结构Table 2. Secondary structure of hydrolysate of neutral protease at different hydrolysis time时间（h） α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） 其他（%） 1 14.29 30.63 43.40 9.96 1.72 2 12.37 31.38 45.54 8.77 1.94 3 18.94 22.69 41.71 16.60 0.60 4 18.99 22.68 41.38 16.84 0.11 5 14.48 24.38 43.91 17.12 0.11 2.2.3 CD光谱图分析
图5是绿豆蛋白酶解物在185~265 nm范围内的CD光谱图。由图5A可以看出，绿豆蛋白在190 nm附近出现正峰，200~250 nm处于负值，与天然蛋白质的CD光谱图类似[27]，而绿豆蛋白酶解物在190 nm附近的正峰消失，原本在200~250 nm处的负峰发生偏移，说明绿豆蛋白原本的结构被破坏，各二级结构占比发生改变，从而导致酶解物的功能活性发生变化。由图5B可以看出，不同水解时间的绿豆蛋白酶解物的吸收峰出峰位置接近，峰值高低有明显差异，随着水解时间的增加，在200 nm附近峰值逐渐增大，酶解4 h的酶解物负峰值达到最大，而当酶解5 h时的酶解物负峰值开始减小，席加富等[27]认为，峰值与α-螺旋含量呈反比，结合2.2.2中酶解物二级结构分析，得出了相同的结论。综上所述，酶解过程增加了蛋白的α-螺旋结构、减少了β-折叠结构，并且抗氧化性得到提高，与FTIR分析的结论相同，毛小雨[28]发现了同样的规律。
2.3 绿豆蛋白酶解物的氨基酸组成
表3反映的是绿豆蛋白不同酶解物的氨基酸组成。由表可知，不同蛋白酶酶解绿豆蛋白得到的蛋白酶解物的氨基酸组成差异明显。其中，中性蛋白酶酶解物疏水性氨基酸（21.183 g/100 g）、芳香族氨基酸（6.202 g/100 g）含量较高，疏水性氨基酸被认为是影响自由基清除能力的关键因素之一[29]，芳香族氨基酸（酪氨酸Tyr和苯丙氨酸Phe）同样可以显著提高肽的抗氧化能力[30]。另外，中性蛋白酶酶解物的谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）的含量分别为16.337、7.067、9.669、3.167 g/100 g，也是影响抗氧化性的重要氨基酸[31-32]。表4是中性蛋白酶水解不同时间酶解物游离氨基酸组成。随着中性蛋白酶水解时间的增加，疏水性氨基酸丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（ILe）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）；芳香族氨基酸Tyr、Phe含量增加，这些游离氨基酸的组成提高了酶解物的活性[17]，而酶解5 h的中性蛋白酶解物抗氧化活性出现下降，可能是水解时间过长，肽序列过度降解丧失了功能活性。
表 3 不同蛋白酶酶解物游离氨基酸组成（g/100 g）Table 3. The free amino acid composition of hydrolysate of different enzymes (g/100 g)氨基酸 绿豆蛋白 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 天冬氨酸 9.067 8.738 9.669 7.286 8.716 苏氨酸 2.715 2.570 2.723 1.760 2.401 丝氨酸 4.269 4.085 4.544 3.351 4.053 谷氨酸 13.807 13.698 16.337 14.104 14.298 甘氨酸 3.032 2.831 3.067 2.417 2.799 丙氨酸 3.293 3.047 3.234 2.286 2.894 缬氨酸 3.295 3.084 3.069 2.343 2.868 蛋氨酸 0.375 0.217 0.115 0.227 0.232 异亮氨酸 2.935 2.745 2.685 2.050 2.586 亮氨酸 5.250 5.812 5.878 4.378 5.500 酪氨酸 2.816 2.677 2.709 1.737 2.556 苯丙氨酸 3.732 3.469 3.493 2.548 3.534 赖氨酸 5.482 5.238 5.908 4.057 5.332 组氨酸 1.726 1.618 1.792 1.442 1.556 精氨酸 6.509 6.264 7.067 5.655 6.486 脯氨酸 3.092 2.893 3.167 2.336 2.805 疏水氨基酸 21.696 21.051 21.183 15.569 20.170 芳香族氨基酸 6.548 6.146 6.202 4.285 6.090 表 4 中性蛋白酶水解不同时间酶解物游离氨基酸组成（g/100 g）Table 4. The free amino acid composition of hydrolysate of neutral protease at different hydrolysis time (g/100 g)氨基酸 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 天冬氨酸 9.873 9.669 9.269 9.887 9.942 苏氨酸 2.527 2.723 2.456 2.640 2.658 丝氨酸 4.676 4.544 4.364 4.656 4.664 谷氨酸 18.372 16.337 16.648 17.695 17.693 甘氨酸 3.038 3.067 2.868 3.075 3.088 丙氨酸 3.218 3.234 3.391 3.246 3.259 缬氨酸 3.043 3.069 3.088 3.048 3.094 蛋氨酸 0.076 0.115 0.134 0.196 0.205 异亮氨酸 2.642 2.685 2.594 2.676 2.725 亮氨酸 5.863 5.878 5.855 5.983 5.983 酪氨酸 2.482 2.709 2.842 2.997 2.623 苯丙氨酸 3.765 3.493 3.363 3.758 3.520 赖氨酸 6.144 5.908 5.719 6.124 6.133 组氨酸 1.731 1.772 1.782 1.798 1.832 精氨酸 7.563 7.067 7.013 7.622 7.515 脯氨酸 3.082 3.167 2.965 3.163 3.179 疏水氨基酸 21.089 21.183 21.267 21.904 21.409 芳香族氨基酸 6.247 6.202 6.205 6.755 6.143 3. 酶解物抗氧化作用模式
影响绿豆蛋白酶解物的抗氧化活性的因素有很多（见图6），中性蛋白酶酶解物的抗氧化性与其结构密切相关，特别是水解过程中产生的二级结构α-螺旋[28]，水解破坏了绿豆蛋白稳定紧密的结构，使具抗氧化作用的氨基酸残基暴露，抗氧化活性增加；酶解释放的肽片段产生了大量疏水性氨基酸，有利于酶解物与脂类中自由基作用，这些肽片段包裹在卵磷脂的周围，阻断了油脂与氧气的接触，达到抑制氧化的效果；Fe2+与酶解物的残基能够形成稳定的环状结构，中性蛋白酶在水解过程中释放出的组氨酸（His）、蛋氨酸（Met）等含有吲哚基、咪唑基等活性基团的氨基酸，在与Fe2+螯合方面中起着重要作用[18]；精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）含量的增加使得-NH2基团暴露[19]，抗氧化活性增加；DPPH·是一个N-中心自由基，酶解过程释放的“自由基”将自身电子给予DPPH·的孤电子，形成配对从而猝灭DPPH·，提高了酶解物的抗氧化活性[33]。
4. 结论
为探究绿豆蛋白酶解物的构效关系，分别采用了四种不同来源的蛋白酶水解绿豆蛋白2 h，筛选出了中性蛋白酶的酶解物抗氧化效果最好，在不同时间下继续水解绿豆蛋白，结果得出：当中性蛋白酶水解4 h时，DPPH清除率、羟自由基清除率分别达到71.03%、51.94%，TBARS值达到0.4045 mg/L，Fe2+螯合率达到52.31%。结合氨基酸含量、电泳、傅里叶红外光谱、圆二光谱分析得出结构影响功能活性，疏水氨基酸和芳香族氨基酸含量越高活性越强，酶解物分子量越低（在一定范围内）的酶解物抗氧化活性越强，二级结构α-螺旋含量增加，β-折叠含量降低，有利于酶解物抗氧化活性的提高。本文的研究结果表明，绿豆蛋白酶解物可作为一种潜在的抗氧化剂用于食品领域。
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图 1 绿豆蛋白酶解物的抗氧化活性
注：1.VC组；2.碱性蛋白酶酶解物；3.中性蛋白酶酶解物；4.胃蛋白酶酶解物；5.胰蛋白酶酶解物；6.绿豆蛋白；不同字母代表各组差异显著，P<0.05；图2同。
Figure 1. Antioxidant activity of protease hydrolysates from mung bean
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图 2 绿豆蛋白中性蛋白酶酶解物的抗氧化活性
Figure 2. Antioxidant activity of mung bean protein neutral protease hydrolysates
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图 3 绿豆蛋白酶解物的SDS-PAGE图
注：1.碱性蛋白酶酶解物；2.中性蛋白酶酶解物；3.胃蛋白酶酶解物；4.胰蛋白酶酶解物；5.绿豆蛋白；M：蛋白标品。
Figure 3. SDS-PAGE of mung bean protein hydrolysate
表 1 绿豆蛋白及其酶解物酰胺Ⅰ带二级结构
Table 1 Secondary structure of amide Ι band of mung bean protein and its hydrolysate
α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） 其他（%） 碱性蛋白酶酶解物 11.65 37.62 29.82 17.05 3.86 中性蛋白酶酶解物 12.37 31.38 45.54 8.77 1.94 胃蛋白酶酶解物 7.55 36.27 27.98 10.50 17.60 胰蛋白酶酶解物 7.61 36.67 27.99 10.59 17.14 绿豆蛋白 14.87 42.67 25.49 14.82 2.15 
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表 2 中性蛋白酶不同水解时间酰胺Ⅰ带二级结构
Table 2 Secondary structure of hydrolysate of neutral protease at different hydrolysis time
时间（h） α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） 其他（%） 1 14.29 30.63 43.40 9.96 1.72 2 12.37 31.38 45.54 8.77 1.94 3 18.94 22.69 41.71 16.60 0.60 4 18.99 22.68 41.38 16.84 0.11 5 14.48 24.38 43.91 17.12 0.11
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表 3 不同蛋白酶酶解物游离氨基酸组成（g/100 g）
Table 3 The free amino acid composition of hydrolysate of different enzymes (g/100 g)
氨基酸 绿豆蛋白 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 天冬氨酸 9.067 8.738 9.669 7.286 8.716 苏氨酸 2.715 2.570 2.723 1.760 2.401 丝氨酸 4.269 4.085 4.544 3.351 4.053 谷氨酸 13.807 13.698 16.337 14.104 14.298 甘氨酸 3.032 2.831 3.067 2.417 2.799 丙氨酸 3.293 3.047 3.234 2.286 2.894 缬氨酸 3.295 3.084 3.069 2.343 2.868 蛋氨酸 0.375 0.217 0.115 0.227 0.232 异亮氨酸 2.935 2.745 2.685 2.050 2.586 亮氨酸 5.250 5.812 5.878 4.378 5.500 酪氨酸 2.816 2.677 2.709 1.737 2.556 苯丙氨酸 3.732 3.469 3.493 2.548 3.534 赖氨酸 5.482 5.238 5.908 4.057 5.332 组氨酸 1.726 1.618 1.792 1.442 1.556 精氨酸 6.509 6.264 7.067 5.655 6.486 脯氨酸 3.092 2.893 3.167 2.336 2.805 疏水氨基酸 21.696 21.051 21.183 15.569 20.170 芳香族氨基酸 6.548 6.146 6.202 4.285 6.090
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表 4 中性蛋白酶水解不同时间酶解物游离氨基酸组成（g/100 g）
Table 4 The free amino acid composition of hydrolysate of neutral protease at different hydrolysis time (g/100 g)
氨基酸 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 天冬氨酸 9.873 9.669 9.269 9.887 9.942 苏氨酸 2.527 2.723 2.456 2.640 2.658 丝氨酸 4.676 4.544 4.364 4.656 4.664 谷氨酸 18.372 16.337 16.648 17.695 17.693 甘氨酸 3.038 3.067 2.868 3.075 3.088 丙氨酸 3.218 3.234 3.391 3.246 3.259 缬氨酸 3.043 3.069 3.088 3.048 3.094 蛋氨酸 0.076 0.115 0.134 0.196 0.205 异亮氨酸 2.642 2.685 2.594 2.676 2.725 亮氨酸 5.863 5.878 5.855 5.983 5.983 酪氨酸 2.482 2.709 2.842 2.997 2.623 苯丙氨酸 3.765 3.493 3.363 3.758 3.520 赖氨酸 6.144 5.908 5.719 6.124 6.133 组氨酸 1.731 1.772 1.782 1.798 1.832 精氨酸 7.563 7.067 7.013 7.622 7.515 脯氨酸 3.082 3.167 2.965 3.163 3.179 疏水氨基酸 21.089 21.183 21.267 21.904 21.409 芳香族氨基酸 6.247 6.202 6.205 6.755 6.143
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