糖尿病是一种以高血糖为主要临床特征的代谢性疾病，其发病机制与人口老龄化、肥胖、遗传因素及不当的生活方式等多种因素密切相关^[1-2]。我国糖尿病患者已有1.14亿之多，已成为世界上的糖尿病大国^[3-4]。糖尿病患者的血糖若长期控制不好，会出现血管、心、肝、肾及眼病等多器官并发症^[5]。其中，糖尿病并发的肝脏损伤一般由于血糖、脂肪、蛋白质或水电解质紊乱引发炎症和氧化应激反应等，进而导致肝功能及肝脏糖脂代谢异常^[6-8]，临床上若糖尿病患者不能很好控制血糖，会诱发肝脏损伤甚至发展成肝硬化或肝癌。但目前还没有针对糖尿病并发肝损伤的特效药物^[9-10]，如何防治糖尿病及其肝脏并发症仍是医学难题。

百合乌药汤（Baihe Wuyao Decoction, BWD）由百合和乌药组成，配比10:3，始载于清代陈修园所著的《医学三字经》，主用于治疗浅表性胃炎^[11]。百合是一种药食同源的中药，《中国药典》2020年版规定的百合为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium brownii F.E.Brown var. Viridulum Baker或细叶百合Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞叶，百合养阴润肺，清心安神。用于阴虚燥咳、劳嗽咳血、虚烦惊悸、失眠多梦、精神恍惚^[12]。乌药始载于唐代《本草拾遗》，是一种传统的理气中药，《中国药典》2020年版规定乌药为樟科植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kos-term.的干燥块根，功能与主治包括行气止痛，温肾散寒。用于寒凝气滞、胸腹胀痛、气逆喘急、膀胱虚冷、遗尿尿频、疝气疼痛、经寒腹痛^[12]。为确定大剂量食用乌药是否存在安全隐患，根据《保健食品安全性毒理学评价程序和检验方法规范》的要求，有学者^[13-14]对乌药进行了系列毒理试验，实验结果发现：乌药经口LD₅₀>10.0 g/kg体重，微核试验、精子畸形试验、Ames试验均表现为阴性，因此得出实验结论：乌药属实际无毒，无致突变性。现代研究表明，百合及乌药具有保肝、降胆固醇和降血糖^[9]、抗炎^[9-10]、抗凋亡^[11]和抗氧化^[15-17]等作用。研究发现BWD对CCl₄诱发的慢性肝损伤和肝纤维化具有很好疗效^[18]，但BWD对1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus, T1DM）及其并发的肝损伤是否具有保护作用尚无报道。

本研究采用STZ诱导小鼠T1DM并发肝损伤后，考察BWD对肝功能指标、肝组织中抗氧化指标、炎症因子和胰岛素信号通路的影响，旨在探究BWD对T1DM并发肝损伤的保护作用及其机制，以揭示T1DM并发肝损伤的病理机制，以期为进一步研发BWD的保健作用奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

百合、乌药　中国唐山唐人药业有限公司，由公司专人进行质检，确保中药饮片质量符合规范。采用传统水提法^[19]，按照10:3的质量比例称重百合与乌药，将药材置于容器内，加入药材质量8倍量的蒸馏水浸泡40 min，完成浸泡后煎煮1 h，滤过，药材残渣再加入原药材质量4倍量的蒸馏水煎煮1 h，再次滤过后，合并两次滤液。使用旋转蒸发仪将药液浓缩，制备浓度分别为2.7、0.9、0.45和0.23 g·mL⁻¹的BWD；SPF级雄性昆明小鼠　6~8周龄，70只，体质量（20±2）g，购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2014～0004；胰岛素注射液　江苏万邦生化医药股份有限公司；链脲佐菌素Streptozotocin（STZ）　Cayman公司；0.1 mol·L⁻¹柠檬酸钠缓冲溶液　Beijing Solarbbio Science & Technology Co.,Ltd.；天冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒　北京瑞正善达生物工程技术有限公司；胰岛素ELISA检测试剂盒　南京建成生物工程研究所；Trizol试剂　Invitrogen公司；Promega GoScript反转录试剂盒　Promega公司；PCR引物　Sangon Biotech（中国分公司）。

VORTE X-5多功能酶标仪　美国伯图腾仪器有限责任公司；G560E全自动生化分析仪　德国罗氏制药有限公司；Image Lab4.1 software q-PCR仪　Applied biosysterns英国；BX53F显微镜　日本OLYMPUS公司。

1.2   实验方法

1.2.1   动物实验分组

昆明小鼠70只随机分成空白组，模型组，阳性对照组，BWD高、中、低1和低2剂量组，剂量分别为15、5、2.5、1.25 g·kg⁻¹·d⁻¹，每组10只小鼠。

1.2.2   造模及处理

小鼠经适应性饲养1周后，禁食不禁水12 h。然后，除空白组外，其余各组小鼠按60 mg·kg⁻¹ ip STZ溶液（STZ溶于0.1 mol·L⁻¹柠檬酸缓冲液中，pH4.5，现配现用）^[20]，空白组小鼠同法注射柠檬酸缓冲液（10 mL·kg⁻¹）。5 d后，禁食6 h，尾尖采血测血糖，血糖高于16.7 mmol·L⁻¹的小鼠视为造模成功，用于后期实验。其中，阳性对照组小鼠皮下注射胰岛素（0.091 U·kg⁻¹），每天两次；BWD的高、中、低1和低2剂量组分别灌胃15、5、2.5和1.25 g·kg⁻¹·d^-1的BWD；空白组和模型组每天同法灌胃蒸馏水。连续给药6周，每2周检测小鼠血糖和体质量，给药结束时，小鼠禁食12 h，然后被处死，同时收集血清和肝脏组织冻存于−80 ℃备用。

1.2.3   血清ALT和AST含量检测

血清ALT和AST水平采用全自动生化分析仪，根据试剂盒说明书检测。

1.2.4   肝组织中的SOD和MDA含量检测

取肝组织研磨，用生理盐水稀释后，按照试剂盒说明书检测小鼠肝组织中的SOD和MDA含量。

1.2.5   检测肝脏炎症因子、凋亡因子、抗氧化指标以及转录因子等基因mRNA表达

取肝组织利用trizol等试剂提取RNA后，采用Promega GoScript反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，以β-actin为内参^[18,21]，通过Real-time PCR检测肝脏组织炎症相关因子（包括TNF-α、NF-κB 、IL-1β、IL-6和IL-8）、凋亡因子（包括Bcl2、Bax和CASP3）、氧化应激相关因子Mn-SOD和iNOS在mRNA水平的表达，PCR引物序列见表1。

表  1  引物序列

Table  1.  Primer sequences

基因	上游引物	下游引物
IL-1β	5’-GTTCCCATTAGACAACTGC-3’	5’-GATTCTTTCCTTTGAGGC-3’
IL-6	5’-GGCAATTCTGATTGTATG-3’	5’-GACTCTGGCTTTGTCTTT-3’
IL-8	5’-GGGCTGCATCTAAAGTAAATGG-3’	5’-CAGAACACTGCTGTAGAAGGTA-3’
NF-κB	5’-CAAAGACAAAGAGGAAGTGCAA-3’	5’-GATGGAATGTAATCCCACCGTA-3’
Mn-SOD	5’-GTCAGACCTGACTATCTGAAAG-3’	5’-CTGCAATGCTCTACACTACTAT-3’
iNOS	5’-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3’	5’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3’
TNF-α	5’-CTCTTCTCATTCCTGCTTG-3’	5’-CTCCACTTGGTGGTTTGCT-3’
Bcl2	5’-GATGACTTCTCTCGTCGATAC-3’	5’-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3’
Bax	5’-TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG-3’	5’-CCATGATGGTTCTGATCAGCTC-3’
CASP3	5’-GAAACTCTTCATCATTCAGGCC-3’	5’-GCGAGTGAGAATGTGCATAAAT-3’
β-actin	5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’	5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’

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1.2.6   检测肝脏胰岛素信号通路AKT的表达

剪取100 mg肝组织，经研磨，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度后进行Western-blot分别检测p-AKT和AKT在蛋白水平的表达，并以α-tubulin为内参^[18,21]，用Image J软件分析目的条带灰度值，并计算其相对表达量。

1.3   数据处理

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，所有数据均以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunet t检验，以P<0.05为具有统计学意义，P<0.01代表有极显著性统计学意义。

2.   结果与分析

2.1   BWD对T1DM小鼠的肝脏组织形态的影响

在显微镜下观察HE染色状态下的小鼠肝脏组织形态，空白组小鼠的肝细胞排列紧实，结构完整；模型组小鼠的肝细胞排列疏松、肿胀，存在气球样变性。BWD干预后，小鼠肝脏有不同程度的恢复。BWD高剂量组小鼠肝脏的肝细胞排列较为紧密，结构较完整，有极少量空泡；BWD中剂量组小鼠肝脏的肝细胞排列更加紧密，结构更加完整；BWD低1剂量组小鼠肝脏的肝细胞排列和结构的恢复程度次于前两个给药剂量，BWD低2剂量组小鼠肝脏的病理状态也得到改善，程度次于前三个给药剂量组。由此可见，BWD对T1DM小鼠并发的肝损伤具有保护作用（见图1）。

图  1  HE染色观察小鼠肝脏的病理变化

注：A：空白组；B：模型组；C：阳性对照组；D：BWD高剂量组；E：BWD中剂量组；F：BWD低1剂量组；G：BWD低2剂量组。

Figure  1.  HE staining to observe the pathological changes of the liver of T1DM mice

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2.2   BWD对T1DM小鼠肝功能的影响

BWD对T1DM小鼠肝功能的影响见图2，与空白组相比，模型组小鼠血清ALT和AST极显著升高（P<0.01），提示小鼠肝功能受损；与模型组相比，BWD各剂量组可不同程度的改善小鼠血清ALT和AST水平，BWD高剂量可降低小鼠血清ALT和AST水平（P<0.05），BWD中剂量也可降低小鼠血清ALT和AST水平（P<0.05）且作用效果优于BWD高剂量组，BWD低1剂量和低2剂量均可降低小鼠血清ALT和AST水平（P<0.01或P<0.05）；与空白组相比，BWD低1剂量的ALT没有明显差异，BWD低2剂量AST和ALT均没有明显差异，说明其恢复至正常水平。结合HE染色结果，可以得出BWD对T1DM小鼠并发肝损伤具有改善作用，综合来看，BWD低1剂量组药效较好，因此，后续实验选用BWD低1剂量组进行探讨。

图  2  百合乌药汤对1型糖尿病小鼠血清ALT和AST的影响（$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；图3~图6同。

Figure  2.  Effect of BWD on serum ALT and AST in T1DM mice （$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

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2.3   BWD对T1DM小鼠肝脏抗氧化能力的影响

与空白组相比，模型组小鼠肝脏匀浆中SOD水平明显降低，而MDA水平显著升高（P<0.05）；表明小鼠受到STZ刺激后，抗氧化能力降低。与模型组相比，BWD低1剂量组小鼠肝脏中SOD水平升高（P<0.05），MDA水平下降（P<0.05）。与空白组相比，模型组小鼠肝脏中的Mn-SOD在mRNA水平的表达降低，iNOS在mRNA水平的表达升高，在RNA水平验证了小鼠抗氧化能力降低。BWD低1剂量可上调肝脏中Mn-SOD的表达，下调iNOS的表达（见图3）。表明BWD低1剂量可增强T1DM小鼠肝脏的抗氧化能力。

图  3  BWD对T1DM并发肝损伤小鼠肝脏抗氧化能力的影响（$\bar{\rm{x}}$±s，n=10）

Figure  3.  Effect of BWD on liver antioxidant capacity in the liver of T1DM mice （$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

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2.4   BWD对T1DM小鼠肝脏中多种炎症因子基因的影响

与空白组小鼠相比，模型组小鼠肝脏中的炎症因子TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6和IL-8在mRNA水平的表达均被上调；与模型组相比，BWD低1剂量显著降低（P<0.01或P<0.05）以上各炎症因子mRNA水平的表达（图4）。揭示BWD低1剂量对T1DM小鼠肝脏具有良好的抗炎作用。

图  4  百合乌药汤对1型糖尿病小鼠肝脏炎症因子的影响（$\bar{\rm{x}}$±s，n=10）

Figure  4.  Effect of BWD on inflammation factors in the liver of T1DM mice （$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

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2.5   BWD对T1DM小鼠肝脏中凋亡因子的影响

当肝脏发生肝损伤时，也会存在细胞凋亡与细胞增殖异常活动，因此采用Q-PCR检测Bcl2、Bax、CASP3在mRNA水平的表达情况。如图5所示，与空白组相比，模型组小鼠肝脏Bcl2的基因表达升高，而Bax和CASP3的表达下降，Bcl2/Bax的比例降低，表明在模型小鼠肝脏中细胞凋亡受到抑制。与模型组相比，BWD低1剂量组小鼠肝脏的Bcl2/Bax的比例增加，而CASP3的表达被下调，表明BWD低1剂量可抑制T1DM小鼠肝脏的细胞凋亡。

图  5  百合乌药汤对1型糖尿病小鼠肝脏凋亡因子和细胞增殖因子的影响（$\bar{\rm{x}}$±s，n=10）

Figure  5.  Effect of BWD on apoptosis factors and cell proliferation factors in the liver of T1DM mice （$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

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2.6   BWD对T1DM小鼠肝脏中AKT信号通路的影响

为探讨BWD对T1DM小鼠并发肝损伤的改善作用是否与胰岛素的AKT信号通路有关，进一步检测了p-AKT和AKT在蛋白水平的表达（图6）。与空白组相比，模型组小鼠肝脏中p-AKT/AKT的比值明显降低，表明胰岛素信号通路减弱。而与模型组相比，BWD低1剂量组小鼠肝脏中p-AKT/AKT的比值升高。表明BWD低1剂量可通过影响AKT改善胰岛素信号通路保护T1DM小鼠的肝脏。

图  6  BWD对T1DM并发肝损伤小鼠肝脏中AKT的影响（$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

Figure  6.  Effect of BWD on the AKT in the liver of T1DM mice （$\bar{\rm{x}}$±s, n=10）

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3.   讨论

本研究发现BWD可缓解T1DM小鼠血清ALT和AST水平；改善肝脏病理形态结构，表明BWD对T1DM并发的肝损伤具有较好保护作用。在T1DM发生和发展过程中存在胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗不仅会导致糖代谢异常，还会引发脂毒性和氧化应激^[22]。当脂质过氧化产生MDA等物质时，SOD可清除机体内的超氧阴离子自由基，从而保护细胞膜免受损伤，因此，SOD对机体的氧化和抗氧平衡起着重要作用。BWD低1剂量可上调肝脏组织中SOD的含量，而下调MDA。此外，BWD低1剂量可增强抗氧化参数Mn-SOD在mRNA水平的表达，并降低iNOS的表达。表明BWD低1剂量对T1DM并发的肝损伤保护作用，与抗氧化作用有关。

当糖尿病并发肝损伤时，肝细胞中NF-κB通路被激活，从而炎症因子被大量释放，进而导致炎症和氧化应激反应，造成肝细胞功能受损甚至细胞死亡^[23]。BWD低1剂量可下调炎症因子：TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6和IL-8在mRNA水平的表达，表明BWD低1剂量可通过抗炎作用改善T1DM并发的肝损伤。

此外，胰岛素的PI3K-AKT信号通路可调控多种生物学进程，特别是细胞增殖、细胞凋亡和糖原代谢，在多种疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病中均会发生该信号通路的失调^[24]。PI3K受到刺激时可以诱导AKT磷酸化使其激活，而AKT的激活会进一步激活其下游信号通路如NF-κB和Foxo1等，影响氧化应激和炎症反应^[25-26]。在血糖升高的早期，胞核内代偿性增加的Foxo1可使胰岛素基因启动子（IPF-1/PDX-1）与增强子区的转录因子的结合增强，促进β细胞的增殖与分化，进而胰岛素会代偿性升高^[27]。BWD低1剂量可使T1DM小鼠肝脏中p-AKT/AKT的比值升高，改善胰岛素抵抗，从而改善T1DM相关的肝损伤。细胞凋亡的级联反应受到Bcl2家族蛋白质的严格调控，包括促凋亡的Bax和抗凋亡因子Bcl2^[28]。Bcl2通常位于线粒体的外膜上，它抑制细胞色素C释放到细胞质中，而Bax位于细胞质的，并且与Bcl2的活性相反^[29]。CASP3是半胱氨酸蛋白酶家族的成员，是细胞凋亡级联反应的关键执行者^[30]。CASP3被前胱天蛋白酶3裂解激活，随后介导线粒体途径细胞凋亡^[31]。BWD的低1剂量在基因水平上增加了Bcl2/Bax基因表达，下调CASP3的表达，这表明BWD的低1剂量抑制了T1DM小鼠肝脏的细胞凋亡。

综上所述，BWD以药食同源的百合作为主要原料，搭配传统理气中药乌药，对T1DM并发的肝损伤具有良好保护作用，其机制与抗炎、抗氧化和改善胰岛素抵抗有关，为进一步研发BWD奠定了基础。