Development and Basic Properties Analysis of Perilla frutescens Leaves Fresh-keeping Paper Bag
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摘要: 为延长紫苏鲜叶货架期，保证叶片在贮藏及零售时的贮藏品质，本研究采用新研制涂膜保鲜纸袋对紫苏叶片进行包装处理。试验所用复合涂布液由壳聚糖、D-异抗坏血酸钠、茶多酚及氯化钙按照一定比例溶于乙酸水溶液配制而成，通过单因素及正交试验考察保鲜纸袋复合涂布液中不同组分浓度对紫苏叶感官品质、VC含量及失重率的影响，确定复合涂布液最佳组分浓度配比：壳聚糖浓度2.0%、D-异抗坏血酸钠浓度2.4%、茶多酚浓度0.25%、氯化钙浓度0.6%。通过物理、化学及抑菌性能分析表明，当涂布量为30 g/m2时，复合涂布液在纸张表面形成均匀涂层，具有较强抑菌能力，且涂料渗入纸张纤维间隙内部，使得纸张重量、厚度、伸长率、水分含量皆有所提升，水蒸气透过系数下降，抗张强度及润湿性能略有下降，符合紫苏叶片包装要求，本研究预计将在果蔬包装领域具有广阔发展前景。Abstract: In order to prolong the shelf life of fresh leaves of Perilla frutescens and ensure the storage quality of leaves during storage and retail, a newly developed coating fresh-keeping paper bag was used to package the leaves of Perilla frutescens in this study. The composite coating solution used in the experiment was prepared by dissolving chitosan, sodium D-isoascorbate, tea polyphenols and calcium chloride in acetic acid aqueous solution in a certain ratio. The effects of different component concentrations in the composite coating solution of fresh-keeping paper bags on the sensory quality, VC content and weight loss rate of Perilla frutescens were investigated by single factor and orthogonal experiments, and the optimal component concentration ratio of the composite coating solution was determined as follows: Chitosan concentration 2.0%, sodium D-isoascorbate concentration 2.4%, tea polyphenols concentration 0.25%, and calcium chloride concentration 0.6%. The physical, chemical and antibacterial properties analysis showed that when the coating amount was 30 g/m2, the composite coating solution had formed uniform coating on the surface of the paper. At this time, the coated paper had strong antibacterial ability, and the coating penetrated into the fiber gap of paper, so that the weight, thickness, elongation and moisture content of paper were improved, the water vapor permeability decreased, and the tensile strength and wettability decreased slightly, which met the packaging requirements of Perilla frutescens leaves and would have broad prospects for development in the field of fruit and vegetable packaging.
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紫苏（Perilla frutescens （L.） Birtton）别名桂荏、红苏、赤苏等，具有独特的芳香气味，为一年生草本植物，属唇形科紫苏属，主要分布于中国、韩国、日本和越南等东南亚国家和地区[1-3]。作为我国常食蔬菜及传统中草药，紫苏在我国己有2000多年的栽培历史，现阶段，主要有药用、油用、工业、食用、香料等方面的用途[4]。现代医学表明，紫苏叶中富含多种活性功能成分，例如迷迭香酸、类胡萝卜素、紫苏醛、紫苏酮等[5-7]。当前，国内外学者大多关注于这类活性物质的提取及加工，在紫苏叶片本身保鲜领域却鲜有报道。紫苏叶组织细胞中含有大量的水分和活性很强的酶类，采摘后仍不断进行生命活动。同时紫苏鲜叶采摘相对集中，具有表面积大、厚度薄等特点，在贮运和销售过程中易因呼吸作用强、水分蒸发过快出现黄化、枯萎发黑；且紫苏鲜叶较易受到机械损伤，破损后易因微生物滋生造成腐烂变质，使得远距离运输存在困难[8-9]。因此，在顺应市场对紫苏叶需求的前提下，探索新型保鲜方式，实现由采摘到零售的远距离运输对于紫苏叶的发展具有重要意义。
目前，国内外果蔬包装常用材料主要包括聚乙烯塑料、保鲜膜、保鲜纸袋、保鲜剂以及功能性瓦楞纸箱等。其中纸张与纸板作为安全环保型包装材料，广受消费者青睐。功能性保鲜纸袋是在原有纸基包装材料的基础上添加保鲜剂，以此抑制果蔬生理代谢、避免有害微生物侵袭的包装方法，不仅制作方便，成本相对低廉，便于长途运输，而且克服了保鲜膜等不易透气所导致的水雾凝结问题[10]。现代社会，消费者多采用牛皮纸袋对家中冰箱进行划分，若在销售中就采用功能性保鲜纸袋对紫苏叶片进行包装，既可实现良好的保鲜效果，又方便了消费者整理，同时也满足了现代人们的环保需求。2019年7月，国家发改委、生态环境部等多部门联合发布《关于扎实推进塑料污染治理工作的通知》，由此，果蔬纸袋包装在未来将可能成为大势所趋[11]。
本试验将壳聚糖、D-异抗坏血酸钠、茶多酚与氯化钙固体混合溶解于乙酸水溶液中，均匀涂布在牛皮纸表面制备保鲜纸袋，并从物理性能、抑菌性能等多角度共同分析其保鲜机理，旨在延长紫苏叶货架期，实现远距离运输，并为紫苏等叶用类蔬菜的贮藏保鲜提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫苏叶 黑龙江省桦南林业局提供，叶片色泽均匀、完整、无机械损伤、大小基本一致；8 K牛皮纸（120 g/100张） 盛达科技股份有限公司；氯化钙、茶多酚、壳聚糖 均为食品级，上海源叶生物科技有限公司；D-异抗坏血酸钠 食品级，天津龙华诚信粉体技术有限公司；三氯乙酸、蛋白胨、牛肉膏 天津市光复精细化工研究所；2，6-二氯酚靛酚 上海伊卡生物技术有限公司。
HBS-1096B酶标分析仪 昆山广测仪器设备有限公司；YP-20002型电子天平 山东桑泽仪器仪表有限公司；FJS-6磁力搅拌水浴锅 金坛市城西富威实验仪器厂；5430R型高速离心机 Edenff中国有限公司；TA-XT plus型质构仪 上海超技仪器有限公司；SU-3500钨丝灯扫描电子显微镜 日本日立集团有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 单因素实验
1.2.1.1 复合涂布液中不同浓度壳聚糖对紫苏叶保鲜效果的影响
于浓度为1%（w/v）的冰乙酸水溶液中，分别添加不同质量浓度（以冰乙酸溶液为基液，下同）的食品级壳聚糖粉末（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），继续添加1.5%的食品级D-异抗坏血酸钠、0.2%的茶多酚与0.6%的食品级氯化钙颗粒，于60 ℃下磁力搅拌30 min，再在相同温度下超声20 min，冷却至室温，得到混合涂布溶液，按涂布量30 g/m2对牛皮纸进行涂布处理，使之形成连续的保鲜液涂层并在室温下阴干，折叠、固体胶手工粘合后放置于室温下备用。装袋时，每袋选择约30片大小一致的紫苏叶进行包装，放置于4 ℃的保鲜柜中进行贮藏，5 d后进行感官、失重及VC含量测定。每组试验平行3次，结果取平均值。
1.2.1.2 复合涂布液中不同浓度D-异抗坏血酸钠对紫苏叶保鲜效果的影响
于浓度为1%（w/v）的冰乙酸水溶液中，添加1.5%的食品级壳聚糖粉末、不同质量的食品级D-异抗坏血酸钠（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、0.2%的茶多酚与0.6%的食品级氯化钙颗粒，室温下混合搅拌，后续步骤同1.2.1.1。
1.2.1.3 复合涂布液中不同浓度茶多酚对紫苏叶保鲜效果的影响
于浓度为1%（w/v）的冰乙酸水溶液中，添加1.5%的食品级壳聚糖粉末、1.5%的食品级D-异抗坏血酸钠、不同质量的食品级茶多酚（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）与0.6%的食品级氯化钙颗粒，室温下混合搅拌，后续步骤同1.2.1.1。
1.2.1.4 复合涂布液中不同浓度氯化钙对紫苏叶保鲜效果的影响
于浓度为1%（w/v）的冰乙酸水溶液中，添加1.5%的食品级壳聚糖粉末、1.5%的食品级D-异抗坏血酸钠、0.2%的食品级茶多酚与不同质量的食品级氯化钙颗粒（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），室温下混合搅拌，后续步骤同1.2.1.1。
1.2.2 响应面试验
根据单因素实验筛选出的壳聚糖、D-异抗坏血酸钠、茶多酚和氯化钙适宜浓度范围为基础，进行响应面试验，因素水平见表1。按照响应面试验表分别进行29组实验，贮藏5 d后，对紫苏叶进行失重率、VC含量和感官质量的检测，以综合评分作为评定指标（失重率、VC含量和感官评分加权系数分别为0.3、0.3、0.4）。
表 1 Box-Benhnken 设计试验因素水平及编码Table 1. Level and code of variables for Box-Behnken design水平 A 壳聚糖（%） B D-异抗坏血酸钠（%） C 茶多酚（%） D 氯化钙（%） −1 1.0 1.5 0.2 0.4 0 1.5 2.0 0.25 0.6 1 2.0 2.5 0.3 0.8 1.2.3 性能分析
1.2.3.1 感官评价
感官评定小组由10名经过培训的专业人员组成（5男5女），具体评价标准见表2[12]。
表 2 紫苏叶感官评价标准Table 2. Sensory evaluation criteria of Perilla frutescens leaves项目 Ⅰ级（90~100） Ⅱ级（80~89） Ⅲ级（70~79） Ⅳ级（60~69） Ⅴ级（<60） 色泽 叶片翠绿，色泽正常 叶片较绿，色泽较好 黄化斑点<10%，色泽较差 10%≤黄化≤30%，色泽差 黄化>30%，色泽很差 气味 有紫苏清香，口感脆嫩 稍有紫苏清香，口感较好 稍有异味，口感较差 有轻微发酵味，口感差 有腐败酸味，口感很差 质地 硬挺，微有绒毛，
新鲜，无萎蔫较新鲜，无绒毛但极少
出现萎蔫叶片发生卷边，
萎蔫率<10%叶片卷边较严重，10%≤
萎蔫率≤30%叶片卷边严重，
萎蔫率> 30%1.2.3.2 失重率测定
采用称重法对紫苏叶失重率进行测定。于室温下，将紫苏叶置于电子天平上进行称量，每5 d测定一次，并记录每组紫苏叶贮藏前质量及贮藏后质量。
失重率(%)=贮藏前质量−贮藏后质量贮藏前质量×100 (1) 1.2.3.3 VC含量测定
参照GB 5009.86-2016采用2，6-二氯酚靛酚滴定法对VC含量进行测定。
1.2.4 性能分析
1.2.4.1 物理性能测定
定量：定量是指每平方米涂布纸的质量，以g/m2来表示。按照黄紫娟[13]和王猛[14]的方法将涂布纸张精准裁割成边长0.1 m的正方形，置于精确度为0.0001 g的分析天平上称量出准确质量，计算定量。
厚度：厚度是衡量纸张机械性能的基本指标之一。测定时，用数显测厚规在涂布纸上任选5处进行准确测量，取其平均值，单位为mm。
抗张强度：抗张强度是指一定宽度的纸张断裂时所能承受的最大张力，以kN/m表示。参照Basiak等[15]的试验方法，并加以修改。将涂布纸裁成1.5 cm×10 cm的长方形试纸，测定时，将试纸垂直固定于两夹头间，其中，每个夹头约夹住试纸1 cm处，使之夹距约8 cm左右，拉伸开始前，试纸应处于放松状态，试验重复三次，取平均值，具体计算公式如下：
TS(KN/m)=FLW×10−3 (2) 式中：F表示试纸断裂时的最大张力，N；LW表示试纸的宽度，m。
伸长率：纸张断裂伸长率是衡量纸张柔韧性的指标之一，可反应纸张被涂布后纤维间变化程度。其值为纸张断裂时长度与原长的百分比，值越大柔韧性越强，越能承受外界冲击[16-17]。操作方法同上，具体计算公式如下：
E(%)=L−L0L0×100 (3) 式中：L为试纸断裂时长度，mm；L0为纸张初始长度，mm。
水分含量：参照章国华等[16]的测定方法，将保鲜纸裁割呈3 cm×3 cm左右正方形纸条，于105 ℃烘箱内下烘干至恒重，称量并计算数据，公式如下：
水分含量(%)=烘干前质量−烘干后质量烘干前质量×100 (4) 1.2.4.2 水蒸气透过率测定
水蒸气透过率是指在一定温度及湿度条件下，单位时间和单位面积内透过试纸水蒸气总量，本试验参考GB 1037-1988透水蒸气性试验方法-杯式法及王韵仪等[18]的试验方法进行测定。将无水氯化钙粉碎，置于烘箱中干燥2 h，冷却备用。测定时，需将5 g无水氯化钙粉末均匀的铺在称量皿中，将牛皮纸张用皮筋覆盖于皿上以不漏间隙为准，在室温下（25 ℃、55% RH）将其放入装有硫酸钾饱和溶液的干燥器内，7 d后称量并计算数据，公式如下：
WVP=Δm×LA×t×ΔP (5) 式中：WVP为水蒸气透过系数，g·mm/m2·d kPa；∆m为水蒸气透过的重量，g；L为纸张厚度，mm；A为纸张面积，m2；t为天数，d；∆P为样品两侧的部分水蒸气压差，kPa。
1.2.4.3 润湿性能测定
采用视频光学接触角测量仪分别对涂布纸张及未经处理的牛皮纸（空白牛皮纸）进行接触角测定，水滴体积约为5 μL，测定样品润湿、吸收情况，测定时任选5处进行测量，结果取平均值。
1.2.4.4 抑菌性能测定
参照Fang等[19]的抑菌方法并在此基础上加以修改。试验前，将涂布纸裁剪成直径9 mm的圆形纸片，并将纸片、各试验用具置于超净工作台上紫外杀菌2 h；将平板、涂布棒、培养基等试验用具置于高压灭菌锅中灭菌40 min。测定时，先将灭菌后的培养基均匀倒入平皿中，使之布满整个底部，再分别吸取活化后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等菌种200 μL于培养皿中，用涂布棒涂抹均匀后，将圆形纸片置于涂满细菌的平面上，于37 ℃培养箱中培养24 h，观察抑菌圈大小。
1.2.4.5 扫描式电子显微镜分析
通过钨丝灯扫描电子显微镜研究纸张的微观形貌特征。具体制样方法如下：将涂布纸裁剪成合适的大小，用导电双面胶贴于样品台上，真空离子喷金后置于测试腔内，在5.00 kV加速电压，放大倍数为1.0~2.0 k倍条件下进行观察。
1.2.4.6 红外光谱测定
采用傅立叶变换红外光谱仪对涂布纸及未经处理的牛皮纸（空白牛皮纸）进行红外扫描分析，扫描范围为450~4000 cm−1。
1.3 数据处理
以上试验均重复三次，取平均值，经Office Excel 2010软件进行整理，用SPSS 22.0进行显著性分析、Origin 5.0软件作图、采用Design Expert 8.0.6软件进行试验设计、数据处理分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 复合涂布液中不同浓度壳聚糖对紫苏叶保鲜效果的影响
壳聚糖具有良好的力学性能、阻隔性能及较强的延展性，应用于包装材料，不仅可增强材料耐撕拉程度，还可利用植物自身呼吸作用，形成高CO2低O2的封闭贮藏环境，延长果蔬货架期[20-21]。由图1可见，随着纸袋复合涂布液中壳聚糖浓度的逐渐增加，紫苏叶的感官评分呈先上升后下降的趋势，VC含量由63.28 mg/100 g逐渐增加至75.86 mg/100 g后趋于平稳，失重率则由14.63%逐渐下降至10.69%后略有升高。其中壳聚糖添加量为0.5%~1.5%时，感官评分与VC含量各浓度间差异显著（P<0.05）。这可能是由于壳聚糖浓度较低时，无法在纸袋内壁形成足够厚度的涂膜层而致使水分和营养成分流失，感官品质下降，发生萎蔫。当浓度达到1.5%后，纸袋与壳聚糖涂层的联合阻隔效果作用明显，紫苏鲜叶贮藏效果显著，感官评分到达最高值，失重率也达到最低。而当壳聚糖浓度过大时，水分聚集无法蒸发，使得水汽凝集于叶片上，引起湿度过大导致腐烂现象的发生，影响市场销售。由此，纸袋复合涂布液中壳聚糖浓度应选择在1.0%~2.0%为宜。
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2.1.2 复合涂布液中不同浓度D-异抗坏血酸钠对紫苏叶保鲜效果的影响
由图2可知，紫苏叶贮藏5 d后的感官评分和VC含量皆随着D-异抗坏血酸钠的增加而增加，当浓度达到2.0%后逐渐趋于平稳，失重率呈先逐渐减小后增加的趋势。当浓度到达2.0%时，各指标均达到最佳值，此时感官评分为90.33分、VC含量为72.28 mg/100 g、失重率为10.37%，色泽鲜亮，口感脆嫩，这可能是由于D-异抗坏血酸钠处理后，紫苏叶片内的多酚氧化酶、过氧化物酶等酶的活性受到抑制，叶梗伤口处褐变明显改善，且处理后，显著延缓了叶片颜色变暗及软化的程度，减缓失重，使得贮藏品质得到改善[22-23]。当浓度在2.0%时，由于叶片衰老程度已得到明显抑制，因此当浓度再高于2.0%时，感官评分和叶片失重率变化不再显著（P>0.05）。因此，纸袋复合涂布液中D-异抗坏血酸钠的浓度选择在1.5%~2.5%为佳。
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图 2 复合涂布液中不同浓度D-异抗坏血酸钠对紫苏叶保鲜效果的影响Figure 2. Effects of different concentrations of sodium D-isoascorbate in compound coating solution on the fresh-keeping effect of Perilla frutescens leaves2.1.3 复合涂布液中不同浓度茶多酚对紫苏叶保鲜效果的影响
如图3所示，当涂布液中茶多酚浓度在0.1%~0.2%间时，随茶多酚浓度的增加，紫苏叶感官评分、VC含量及失重率均有所改善，且各浓度间差异显著（P<0.05），当达到0.25%时，感官评分及VC含量达到最佳，此时感官评分为90分、VC含量为75.97 mg/100 g。茶多酚处理可有效改善果蔬生理品质，一方面可通过对果蔬的呼吸抑制作用及较强的抗氧化作用减缓营养物质的消耗，另一方面可通过抑制微生物的生长来减少腐败现象的发生[24-25]。当茶多酚浓度在0.1%~0.25%之间时，随着浓度的不断增加，VC的降解程度明显减缓，失重率也显著改善；此后，感官和VC含量略有下降，失重率略有回升，这可能是由于当浓度高于0.25%，茶多酚对叶片呼吸作用的抑制效果不再显著增加导致的。因此复合涂布液中茶多酚浓度选择0.20%~0.30%为佳。
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图 3 复合涂布液中不同浓度茶多酚对紫苏叶保鲜效果的影响Figure 3. Effects of different concentrations of tea polyphenols in compound coating solution on fresh-keeping effect of Perilla frutescens leaves2.1.4 复合涂布液中不同浓度氯化钙对紫苏叶保鲜效果的影响
钙离子可参与植物信号传导，在植物成熟过程中起着重要的调控作用，是细胞壁、细胞膜的结构物质之一。由图4可知，随着涂布液中氯化钙浓度的增加，紫苏叶片感官品质和VC含量呈先上升后下降趋势，失重率在0.2%~0.4%浓度段下降明显，后随浓度增加而逐渐上升。这可能是由于前期氯化钙处理延缓了低温贮藏期间细胞壁的降解和软化进程，抑制了乙烯信号等相关通路的表达，使得贮藏品质保鲜效果明显。而随着氯化钙浓度的持续增加，使得细胞内的钙离子浓度过高，破坏了叶片细胞膜结构，加速衰老过程，呼吸速率加快，致使叶片萎蔫发黄、失重率增加[26]。可见，保鲜纸袋复合涂布液中氯化钙选择浓度0.4%~0.8%为宜。
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图 4 复合涂布液中不同浓度氯化钙对紫苏叶保鲜效果的影响Figure 4. Effects of different concentrations of calcium chloride in compound coating solution on the fresh-keeping effect of Perilla frutescens leaves2.2 响应面试验优化保鲜纸袋复合涂布液浓度配比
2.2.1 响应面试验结果与分析
根据单因素实验结果分析，结合Box-Behnken中心组合试验设计原理，利用响应面分析优化保鲜纸袋复合涂布液最佳浓度参数（表3）。
表 3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3. Box-Benhnken design and results实验号 A B C D 综合评分（分） 1 −1 0 −1 0 64.92 2 0 0 0 0 87.69 3 1 0 0 1 83.03 4 1 0 0 −1 84.19 5 1 1 0 0 85.48 6 0 0 0 0 89.34 7 0 1 1 0 86.18 8 1 −1 0 0 73.21 9 −1 −1 0 0 69.35 10 0 −1 0 1 77.40 11 −1 0 1 0 81.43 12 0 0 −1 −1 70.00 13 0 0 0 0 93.09 14 −1 0 0 −1 70.19 15 0 −1 −1 0 72.98 16 0 0 0 0 92.98 17 0 −1 1 0 76.03 18 0 1 0 −1 74.48 19 0 1 0 1 87.33 20 0 1 −1 0 76.24 21 1 0 1 0 87.02 22 0 0 −1 1 74.96 23 0 0 0 0 90.12 24 −1 0 0 1 67.74 25 0 −1 0 −1 71.51 26 −1 1 0 0 66.55 27 1 0 −1 0 83.01 28 0 0 1 −1 85.23 29 0 0 1 1 82.36 利用Design-Expert 8.0.6软件进行保鲜纸袋复合涂布液中壳聚糖（A）、D-异抗坏血酸钠（B）、茶多酚（C）以及氯化钙（D）浓度的回归分析，建立以综合评定指标为响应值的多元二次回归方程：
Y=90.64+6.31A+2.98B+4.68C+1.4D+3.77AB−3.13AC+0.32AD+1.72BC+1.74BD−1.96CD−7.92A2−7.85B2−4.89C2−6.39D2
由表4分析可知，本试验建立的回归模型显著性极高（P<0.0001），失拟项P=0.2544，R2=0.9303>0.9000，即失拟项不显著，预测值与实际值较为接近，表明该模型误差较小，拟合程度较好，适合应用此方程实现保鲜纸袋复合涂布液的各成分浓度优化。由各项方差分析可得，一次项中的壳聚糖、D-异抗坏血酸钠、茶多酚，交互项中的壳聚糖和D-异抗坏血酸钠以及各因素的二次项均对紫苏叶贮藏综合指标的影响呈显著水平（P<0.05）。分析表4中一次项F值可显示各因素对响应值的主效应关系，F值越大，该因素对于响应值的影响程度越高[27-28]。由表4分析可得，一次项各F值的大小为：A>C>B>D，即各因素对综合指标评分的影响程度大小为：壳聚糖>茶多酚>D-异抗坏血酸钠>氯化钙。
表 4 方差分析结果Table 4. Variance analysis of regression model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1814.25 14 129.59 13.36 <0.0001 *** A 478.3 1 478.3 49.29 <0.0001 *** B 106.68 1 106.68 10.99 0.0051 ** C 262.64 1 262.64 27.07 0.0001 *** D 24.71 1 24.71 2.55 0.1329 AB 56.78 1 56.78 5.85 0.0298 * AC 39.06 1 39.06 4.03 0.0645 AD 0.42 1 0.42 0.043 0.8389 BC 11.87 1 11.87 1.22 0.2874 BD 12.11 1 12.11 1.25 0.2827 CD 15.33 1 15.33 1.58 0.2294 A2 407.34 1 407.34 41.98 <0.0001 *** B2 399.41 1 399.41 41.16 <0.0001 *** C2 155.39 1 155.39 16.01 0.0013 ** D2 264.61 1 264.61 27.27 0.0001 *** 残差 135.85 14 9.70 失拟项 113.71 10 11.37 2.05 0.2544 不显著 R2 0.9303 R2Adj 0.8607 注：***表示极显著（P<0.0001）；**表示高度显著（0.0001<P<0.01）；*表示差异显著（0.01<P<0.05）。 2.2.2 保鲜纸袋涂布液最佳浓度配比及验证试验
根据回归模型，通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出，新研制保鲜纸袋复合涂布液中各因素的最佳浓度为：壳聚糖浓度2.0%、D-异抗坏血酸钠浓度2.35%、茶多酚浓度0.2605%、氯化钙浓度0.634%，在此条件下得到预测值为93.95分。考虑到实际操作的简易性，选择壳聚糖浓度2.0%、D-异抗坏血酸钠浓度2.4%、茶多酚浓度0.25%、氯化钙浓度0.6%制备纸袋复合涂布液。在此工艺参数下，进行响应面验证试验，按上述同样步骤对紫苏叶片进行贮藏，并重复三次取平均值，得到贮藏综合指标评分为93.11分，与预测值仅差0.84，证实该模型可靠，能够较为准确的预测紫苏叶保鲜纸袋复合涂布液的各因素最佳浓度。同时通过贮藏试验验证，保鲜纸袋包装下的紫苏相较于未经处理的空白牛皮纸袋包装下的紫苏，叶片颜色更为翠绿，叶梗也更加硬挺，芳香气味浓郁，食用周期得到有效延长，而放置于保鲜柜中普通状态下的紫苏叶片在第4 d时就已发生萎蔫现象，表面卷曲严重，紫苏香气消失，显著差于保鲜纸袋及空白纸袋，保鲜效果依次为保鲜纸袋包装>空白纸袋包装>普通状态，证实了保鲜纸袋包装的可行性。
2.3 紫苏叶保鲜纸袋性能分析
2.3.1 物理性能分析
由表5所示，涂布牛皮纸与空白牛皮纸在物理性能各方面均产生了一定差异。首先在重量、厚度方面，纸张涂布后，壳聚糖、茶多酚等物质在表面形成了一层透明的薄膜，使得纸张的重量和厚度均略有上升，其中当涂布量为30 g/m2时，重量上升12.5%，厚度上升12%。同时在薄膜形成过程中，各涂料均向纸张内部渗透，增强了纤维间的结合力，柔韧性更好，使得涂布牛皮纸伸长率增加约6.3%。另外，涂布牛皮纸在抗张强度上略有下降，水分含量相对提升，这可能是由于牛皮纸在涂布过程中不仅涂料进入纸张，水分也逐渐渗入基材，即使后续水分逐渐挥发，仍含有微量水分，致使牛皮纸在抗张强度略有下降[29]。由于壳聚糖本身的粘性和成膜性，这一劣势得到极大缓解，试验证明，涂布后纸张抗张强度仅下降6%，对纸袋包装影响较小。
表 5 纸张物理性能分析Table 5. Analysis of physical properties of paper名称 涂布牛皮纸 空白牛皮纸 定量（g/m2） 135.00±8.64 120.00±6.50 厚度（mm） 0.168±0.008 0.150±0.006 抗张强度（KN/m） 1.949±0.068 2.074±0.053 伸长率（%） 3.616±0.101 3.401±0.140 水分含量（%） 10.13±0.56 9.03±0.33 2.3.2 水蒸气透过系数分析
如图5所示，涂布牛皮纸对水蒸气的阻隔性能强于空白牛皮纸，其中，涂布纸张的水蒸气透过系数为20.73 g·mm/m2·d·kPa，空白纸张则为23.16 g·mm/m2·d·kPa，优化了10.5%。这可能是由于纸张涂布后，壳聚糖等分子间的相互作用使得表面形成粘性涂膜，阻碍了水分子的扩散。且随着纸张干燥时间的延长，涂料间的水分逐渐蒸发，表面壳聚糖分子相互作用力也不断加强，亲水基团相应减少。与此同时，涂料也渗透于纤维内部，使得纸张空隙被涂料填充，大大降低了纸张的水蒸气透过率[30-31]。紫苏叶片表面积较大、水分蒸发较快，在运输和销售过程中极易因失水造成叶片萎蔫，降低销售价值，该纸袋涂布后水蒸气阻隔性能得到了较大提高，适宜应用于紫苏叶片的包装贮藏[32]。
2.3.3 润湿性能分析
天然纤维素大分子由于具有较多的表面羟基，可以与水分子产生氢键，使水能够在表面扩散。因此，大多数纤维素基材料，特别是纤维素纸具有较强的亲水性和吸湿性，也正是这种吸湿性能阻碍了纤维素高分子聚合物在果蔬包装材料领域的应用[33]。接触角是指水滴在固体表面稳定时，在固-液-气三相交界点，气液界面切线与固液界面连线之间的夹角。一般认为当夹角大于90°时，物体不易被水润湿，当夹角小于90°时，物体易被润湿。如图6所示，空白涂布纸的接触角平均值为124.66°，而涂布后接触角减少为102.84°，这可能是由于牛皮纸相较于其他纸张间隙较为致密，表面张力较大，不宜润湿，而纸张涂布后，由于壳聚糖本身的亲水性能，使得少量水蒸气向膜内溶解，润湿性能略有影响[34]。这也使得环境中的水分还未穿过基材就被表面的涂布层所吸收，在一定程度上起到了阻隔作用，且涂布后接触角仍大于90°，可作为包装疏水纸材料。
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图 6 涂布牛皮纸（A）与空白牛皮纸（B）润湿性能分析Figure 6. Analysis of wettability of coated kraft paper(A) and blank kraft paper(B)2.3.4 抑菌性能分析
抑菌圈法是测定材料抑菌效果的经典试验方法，抑菌圈越大，试验材料对该细菌的抑制效果越好。试验通过比较抑菌圈的大小来衡量保鲜涂布牛皮纸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及枯草杆菌的抑菌效果。由表6及图7可见，经试验制得的保鲜涂布牛皮纸对革兰氏阴性和阳性菌均具有较好的抑菌能力，其中该涂布纸张对枯草杆菌的抑菌效果最佳，培养24 h后，抑菌圈达到24.75±3.32 mm，对大肠杆菌的抑菌效果稍弱，不及金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，抑菌圈大小为16.22±1.82 mm。这可能是由于复合涂布液中壳聚糖及茶多酚均具有一定广谱抗菌性，使得纸张表面形成严密的抗菌膜，抑制了细菌的繁殖，避免紫苏叶片贮藏时腐败菌的生长。
表 6 涂布纸对微生物的抑菌直径Table 6. Antibacterial diameter of coated paper to microorganism微生物种类 抑菌圈直径（mm） 大肠杆菌 16.22±1.82 金黄色葡萄球菌 18.01±2.77 沙门氏菌 18.96±1.91 枯草杆菌 24.75±3.32 ![]()
图 7 涂布纸对大肠杆菌（A）、金黄色葡萄球菌（B）、沙门氏菌（C）及枯草杆菌（D）的抑菌效果Figure 7. Antibacterial effect of coated paper on Escherichia coli (A), Staphylococcus aureus (B), Salmonella (C) and Bacillus subtilis (D)2.3.5 扫描式电子显微镜分析
复合涂布液涂布前后纸张表面形态SEM如图8所示，牛皮纸微观结构发生了明显变化。涂布前，从图8A~图8B可知空白牛皮纸表面较为粗糙，纵切面和横切面纤维结构明显且较为松散，相互结合力弱，空隙结构较多较大，水分子易透过纸张进出包装，难以抑制果蔬失重现象。涂布后，从图8C中纵切面可明显看出，涂料已深入基材内部，图8D中横切面形态也变得平滑，几乎看不见纤维结构，其间缝隙基本被全部填充，表面被涂料层覆盖，相互间结合力大大增强，由此，纤维结构被紧密的交织结合，降低了纸张透气性[35-36]。紫苏叶片属失水量较大的叶菜类蔬菜，贮藏包装的表面结构对紫苏叶的失重影响较大，涂布纸张的制备可明显缓解失水过多的现象，达到了保鲜果蔬的要求。
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图 8 纸张的结构表征（SEM）注：图中A、B分别为未涂布牛皮纸的纵、横斜面表面形态；C、D分别为涂布牛皮纸的纵、横切面表面形态。Figure 8. Structure characterization of paper （SEM）2.3.6 红外光谱分析
涂布前后牛皮纸红外光谱分析如图9所示。从中可见，二者在3334.53、1417.74、1027.3 cm−1处均有较为显著的吸收峰值。波数3334.53 cm−1左右，为形成氢键缔合-OH伸缩振动吸收峰与-NH伸缩振动吸收峰所重合而增宽的较大吸收峰区；波数1417.74 cm−1为-CH2弯曲及-CH3变形振动吸收区；1027.3 cm−1则为C-O的伸缩振动区域[18,37]。壳聚糖与纸浆纤维都属多糖，分子间及内部存在大量的氢键、甲基以及碳氧键，尤其是氢键结构，因其长短、强弱程度各有不同，分布区域较大，再加上涂料中壳聚糖含量较少，因此波数在3334.53和1027.3 cm−1区域中，涂布前后峰面积差别不大，但在1417.74 cm−1左右时，壳聚糖的甲基与钙离子、钠离子所产生的缔合作用影响了原有的-CH3和-CH2结构，使得峰值变小。2899.33~2901.85 cm−1分别为C-H键的两个振动吸收峰区，一般认为壳聚糖结晶度的增加会使得峰区向低频移动，图中也证实，涂布后，峰区所处波数由2901.85变为2899.33 cm−1。1316.40 cm−1区域为壳聚糖的酰胺Ⅲ谱带区，由于壳聚糖的添加，使得在此区域出现一个新的峰值，此外，纸张红外光谱中并未明显体现茶多酚的特征峰，这可能与用量较少有关。
3. 结论
试验选取壳聚糖、D-异抗坏血酸钠、茶多酚、氯化钙作为保鲜纸袋复合涂布液添加剂，进行单因素及响应面试验，筛选出最优涂布液浓度配比：壳聚糖浓度2.0%、D-异抗坏血酸钠浓度2.4%、茶多酚浓度0.25%、氯化钙浓度0.6%。并对涂布前后保鲜纸张进行机械性能、水蒸气透过率、润湿性等物理特性及红外、扫描电镜、抑菌性能测定，综合分析结果表明：当涂布量为30 g/m2时，复合涂布液已渗入纸张纤维间隙内部，干燥后在纸张表面形成均匀涂层，使得纸张重量、厚度、伸长率、水分含量均有所提升，水蒸气透过系数下降，抗张强度及润湿性能略有下降，具有较强的抑菌性能，符合紫苏叶片包装要求。本研究制备的保鲜纸袋可有效延长紫苏叶片贮藏期，不仅为紫苏叶的贮藏保鲜提供了一种新思路，也为其它叶菜类蔬菜的保鲜贮藏提供重要参考依据。
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图 2 复合涂布液中不同浓度D-异抗坏血酸钠对紫苏叶保鲜效果的影响
Figure 2. Effects of different concentrations of sodium D-isoascorbate in compound coating solution on the fresh-keeping effect of Perilla frutescens leaves
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图 3 复合涂布液中不同浓度茶多酚对紫苏叶保鲜效果的影响
Figure 3. Effects of different concentrations of tea polyphenols in compound coating solution on fresh-keeping effect of Perilla frutescens leaves
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图 4 复合涂布液中不同浓度氯化钙对紫苏叶保鲜效果的影响
Figure 4. Effects of different concentrations of calcium chloride in compound coating solution on the fresh-keeping effect of Perilla frutescens leaves
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图 6 涂布牛皮纸（A）与空白牛皮纸（B）润湿性能分析
Figure 6. Analysis of wettability of coated kraft paper(A) and blank kraft paper(B)
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图 7 涂布纸对大肠杆菌（A）、金黄色葡萄球菌（B）、沙门氏菌（C）及枯草杆菌（D）的抑菌效果
Figure 7. Antibacterial effect of coated paper on Escherichia coli (A), Staphylococcus aureus (B), Salmonella (C) and Bacillus subtilis (D)
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图 8 纸张的结构表征（SEM）
注：图中A、B分别为未涂布牛皮纸的纵、横斜面表面形态；C、D分别为涂布牛皮纸的纵、横切面表面形态。
Figure 8. Structure characterization of paper （SEM）
表 1 Box-Benhnken 设计试验因素水平及编码
Table 1 Level and code of variables for Box-Behnken design
水平 A 壳聚糖（%） B D-异抗坏血酸钠（%） C 茶多酚（%） D 氯化钙（%） −1 1.0 1.5 0.2 0.4 0 1.5 2.0 0.25 0.6 1 2.0 2.5 0.3 0.8 
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表 2 紫苏叶感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of Perilla frutescens leaves
项目 Ⅰ级（90~100） Ⅱ级（80~89） Ⅲ级（70~79） Ⅳ级（60~69） Ⅴ级（<60） 色泽 叶片翠绿，色泽正常 叶片较绿，色泽较好 黄化斑点<10%，色泽较差 10%≤黄化≤30%，色泽差 黄化>30%，色泽很差 气味 有紫苏清香，口感脆嫩 稍有紫苏清香，口感较好 稍有异味，口感较差 有轻微发酵味，口感差 有腐败酸味，口感很差 质地 硬挺，微有绒毛，
新鲜，无萎蔫较新鲜，无绒毛但极少
出现萎蔫叶片发生卷边，
萎蔫率<10%叶片卷边较严重，10%≤
萎蔫率≤30%叶片卷边严重，
萎蔫率> 30%
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表 3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Box-Benhnken design and results
实验号 A B C D 综合评分（分） 1 −1 0 −1 0 64.92 2 0 0 0 0 87.69 3 1 0 0 1 83.03 4 1 0 0 −1 84.19 5 1 1 0 0 85.48 6 0 0 0 0 89.34 7 0 1 1 0 86.18 8 1 −1 0 0 73.21 9 −1 −1 0 0 69.35 10 0 −1 0 1 77.40 11 −1 0 1 0 81.43 12 0 0 −1 −1 70.00 13 0 0 0 0 93.09 14 −1 0 0 −1 70.19 15 0 −1 −1 0 72.98 16 0 0 0 0 92.98 17 0 −1 1 0 76.03 18 0 1 0 −1 74.48 19 0 1 0 1 87.33 20 0 1 −1 0 76.24 21 1 0 1 0 87.02 22 0 0 −1 1 74.96 23 0 0 0 0 90.12 24 −1 0 0 1 67.74 25 0 −1 0 −1 71.51 26 −1 1 0 0 66.55 27 1 0 −1 0 83.01 28 0 0 1 −1 85.23 29 0 0 1 1 82.36
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表 4 方差分析结果
Table 4 Variance analysis of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1814.25 14 129.59 13.36 <0.0001 *** A 478.3 1 478.3 49.29 <0.0001 *** B 106.68 1 106.68 10.99 0.0051 ** C 262.64 1 262.64 27.07 0.0001 *** D 24.71 1 24.71 2.55 0.1329 AB 56.78 1 56.78 5.85 0.0298 * AC 39.06 1 39.06 4.03 0.0645 AD 0.42 1 0.42 0.043 0.8389 BC 11.87 1 11.87 1.22 0.2874 BD 12.11 1 12.11 1.25 0.2827 CD 15.33 1 15.33 1.58 0.2294 A2 407.34 1 407.34 41.98 <0.0001 *** B2 399.41 1 399.41 41.16 <0.0001 *** C2 155.39 1 155.39 16.01 0.0013 ** D2 264.61 1 264.61 27.27 0.0001 *** 残差 135.85 14 9.70 失拟项 113.71 10 11.37 2.05 0.2544 不显著 R2 0.9303 R2Adj 0.8607 注：***表示极显著（P<0.0001）；**表示高度显著（0.0001<P<0.01）；*表示差异显著（0.01<P<0.05）。
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表 5 纸张物理性能分析
Table 5 Analysis of physical properties of paper
名称 涂布牛皮纸 空白牛皮纸 定量（g/m2） 135.00±8.64 120.00±6.50 厚度（mm） 0.168±0.008 0.150±0.006 抗张强度（KN/m） 1.949±0.068 2.074±0.053 伸长率（%） 3.616±0.101 3.401±0.140 水分含量（%） 10.13±0.56 9.03±0.33
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表 6 涂布纸对微生物的抑菌直径
Table 6 Antibacterial diameter of coated paper to microorganism
微生物种类 抑菌圈直径（mm） 大肠杆菌 16.22±1.82 金黄色葡萄球菌 18.01±2.77 沙门氏菌 18.96±1.91 枯草杆菌 24.75±3.32
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